一种治疗化疗后骨髓抑制和/或免疫功能抑制的中药组合物及其应用

1.本发明属于中医药技术领域，具体涉及一种治疗化疗后骨髓抑制和/或免疫功能抑制的中药组合物及其应用。


背景技术：

2.化疗是目前治疗恶性肿瘤的主要手段，具有一定的治疗效果，化疗后患者的肿瘤病灶得到有效控制，临床症状得到一定的改善，生存时间得到延长。但是目前的大多数化疗药物对肿瘤细胞缺乏靶向性，在抑制或者杀死肿瘤细胞的同时也会损伤人体的正常细胞，从而常常会引起严重的副作用，例如恶心呕吐、骨髓抑制、脱发、腹泻、疲劳等症状。大约90％以上的化疗药物都可能引起骨髓抑制的副作用，导致患者外周血中白细胞的显著减少，需要反复升白药物治疗，从而严重影响患者的生活质量。
3.骨髓抑制是肿瘤患者化疗后严重的常见副作用之一，也是在血液系统常见的、可危及生命的毒性反应。外周血中以白细胞为主的全血细胞下降是骨髓抑制的主要表现，最常见和最早出现的是以白细胞的下降为主，其次是血小板减少，红细胞数及血红蛋白量下降相对较少，进而引起贫血、出血、抗感染能力下降等严重的不良反应，很大程度上影响肿瘤患者的治疗和预后。目前研究认为，化疗药物引起的骨髓抑制的机制，主要是直接损伤造血干细胞，以及损伤骨髓基质细胞的结构或功能。化疗药物能够抑制不同阶段的癌细胞增殖，抑制dna的分裂增殖能力，从而起到对肿瘤的治疗作用，但其在杀死大量肿瘤细胞的同时，亦可杀死不少正常的骨髓细胞，增加了骨髓抑制和免疫功能下降的发生率。
4.中医学研究认为，放化疗乃是外来之毒邪，在恶性肿瘤正气不足的基础上，“毒邪”侵犯机体，进一步耗伤人体正气，引起五脏六腑的亏虚，气血阴阳的不足。“毒邪”内伤脾胃，导致脾失健运，胃失和降，水谷精微不能输布失常，则气血乏源；若肝肾受损，则肝不藏血，肾精不足，导致精血不足，加之“毒邪”与体内气血相搏，导致气血运行失常，加重脏腑阴阳气血的亏损，而发为本病。由于其病机相对复杂，目前医家对此病的病机认识不尽一致，大致认为虚证是本病的根本所在。至于病证上，多数认为以脾肾亏虚为主要病机。临床中恶性肿瘤患者常因正气内虚，邪气内侵，正不胜邪致病，常常又因放疗、化疗等治疗手段引起进一步的虚证，产生恶性循环。大多数恶性肿瘤的患者都有气血不足或脾肾亏虚的证候表现，与正常人群相比，其机体的免疫功能明显下降。
5.临床上选择有效的药物升高白细胞数量是保证化疗顺利实施的重要环节。目前有效的方法是应用集落刺激因子，但由于其价格昂贵，同时该类药物容易引起患者出现骨痛、发热、肌肉疼痛、乏力、过敏等诸多副反应，且疗效持续时间短，预期获益较差，增加医疗成本。因此，如何有效地预防和治疗骨髓抑制和免疫功能下降是提高化疗疗效的重要手段之一，也是肿瘤患者能配合临床医师治疗的重要前提。


技术实现要素：

6.基于此，本发明的目的在于提供一种治疗化疗后骨髓抑制和/或免疫功能抑制的中药组合物，其能有效治疗化疗后的骨髓抑制，增强机体的免疫功能，提高抗氧化能力。
7.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案。
8.一种治疗化疗后骨髓抑制和/或免疫功能抑制的中药组合物，包含以下重量份的组分：五指毛桃25～35份，黄芪25～35份，党参15～25份，白术10～20份，当归3～10份，熟地5～15份，陈皮5～15份，法夏5～15份，广藿香5～15份，生姜3～10份，大枣5～15份，炙甘草5～15份。
9.在一些优选的实施例中，所述中药组合物包含以下重量份的组分：五指毛桃30～35份，黄芪30～35份，党参20～25份，白术15～20份，当归6～8份，熟地10～15份，陈皮10～15份，法夏10～15份，广藿香10～15份，生姜6～8份，大枣10～15份，炙甘草10～15份。
10.更优选的，所述中药组合物包含以下重量份的组分：五指毛桃30份，黄芪30份，党参20份，白术15份，当归6份，熟地10份，陈皮10份，法夏10份，广藿香10份，生姜6份，大枣10份，炙甘草10份。
11.本发明还提供了一种治疗化疗后骨髓抑制和/或免疫功能抑制的药物，所述药物包含上述中药组合物和药物学上可接受的辅料。
12.在一些实施例中，所述药物的剂型为片剂、溶液剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂。
13.本发明还提供了上述中药组合物在制备治疗化疗后骨髓抑制的药物中应用。
14.在一些实施例中，所述药物具有以下任意一种作用：(1)提高化疗后外周血中白细胞的含量；(2)降低化疗后外周血中红细胞的含量；(3)降低化疗后外周血中血小板的含量。
15.在一些实施例中，所述药物具有以下任意一种作用：(1)提高化疗后血浆中造血因子的含量；优选地，所述造血因子选自gm-csf、tpo、epo、il-2中的至少一种；(2)提高化疗后造血干细胞数量，改善骨髓造血功能；(3)降低化疗后造血干细胞的分化活性。
16.本发明还提供了上述中药组合物在制备增强化疗后机体免疫功能的药物中的应用。
17.本发明还提供了上述中药组合物在制备提高化疗后机体抗氧化能力的药物中的应用。
18.本发明提供了一种治疗化疗后骨髓抑制和/或免疫功能抑制的中药组合物，药方配伍原理如下：君药：五指毛桃、黄芪；臣药：党参、白术、当归、熟地；佐药：法夏、陈皮、藿香、生姜；使药：大枣、灸甘草。党参、白术为臣药，配伍炙甘草为四君子汤底，增强君药的健脾益气之功；熟地、当归组成四物汤底，重在补血养血；黄芪与当归按特定比例配伍组成当归补血汤，具益气生血功效；法夏、陈皮为佐药，与党参、白术、炙甘草合用，为陈夏六君子汤之意，具健脾益气、燥湿和胃的功效；陈皮行气祛湿，藿香芳香化湿、理气和中，配伍呕家圣药“生姜”，加强和胃止呕的功效；法半夏：燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结；陈皮：理气健脾，燥湿化痰；两者配伍使用以防补益药之滋腻滞气之弊；生姜：解表散寒，温中止呕，温肺止咳；生姜为呕家圣药，且能制半夏之悍，二者配伍则一降一散，共助降逆止呕之功；大枣、炙甘草共为使药，炙甘草重在健脾，大枣重在补血，加强健脾补血兼以调和药性。通过上述配伍，本发明中药组合物能健脾补血，有效改善化疗后骨髓抑制患者的骨髓抑制及免疫功能下降状态，同时提高患者的抗氧化能力，加强对内脏器官的保护功能，具有疗效确切、广泛，无明显
副作用，且简便易廉的优点。
附图说明
19.图1为实施例2中药煎剂的指纹图谱。
20.图2为各组小鼠胸腺的变化(0.73
×
)。
21.图3为各组小鼠脾的变化(1.0
×
)。
22.图4为各组小鼠股骨(10
×
40)、脾(10
×
40)、肝(10
×
40)的he染色。
23.图5为各组小鼠脾的nqo1和ho1(10
×
40)免疫组化比较。
具体实施方式
24.本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
25.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
26.本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
27.在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
28.下面结合具体实施例进行说明。
29.实施例1
30.本实施例提供一种治疗化疗后骨髓抑制和/或免疫功能抑制的中药组合物，所述中药组合物包含以下重量份的组分：五指毛桃30份，黄芪30份，党参20份，白术15份，当归6份，熟地10份，陈皮10份，法夏10份，广藿香10份，生姜6份，大枣10份，炙甘草10份。
31.实施例2
32.本实施例研究实施例1所述中药组合物对化疗后的疗效。
33.一、实验动物
34.健康雌性c57bl/6小鼠，购自广州中医药大学实验动物中心，6～8周龄，体重18-22g。动物饲养于12h光明/12h黑暗，温度控制在20-26摄氏度，温差不低于3摄氏度，湿度在40％-70％的无特定病原体污染(specific pathogen free，spf)级别环境中，自由饮水和摄食，适应性饲养1周后开始进行动物实验。
35.二、方药组成及制备
36.取实施例1中药组合物：五指毛桃30份，黄芪30份，党参20份，白术15份，当归6份，熟地10份，陈皮10份，法夏10份，广藿香
(后下)
10份，生姜6份，大枣10份，炙甘草10份，煎煮得到中药煎剂，中药煎剂制作过程如下：将上方中药置8倍温水中浸泡0.5h，沸腾后文火煎煮0.5h，注意均匀搅拌，取汁后经三层纱布过滤；第二次煎煮以6倍水文火煎煮1h，同样方法取
汁，合并两次药液，置60℃旋转蒸发仪内，浓缩至2.5g/ml为高剂量中药组，稀释2倍后为1.25g/ml为中剂量中药组，稀释4倍后为0.62g/ml为低剂量中药组。药液常温冷却后，至4℃冰箱内保存备用。
37.药物用量：参照黄继汉主编的《药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算》(中国临床药理学与治疗学，2004年9月)具体实验动物用药量折算标准如下:小鼠(20g)用量＝中药总量(167g)/人的体量(60kg)
×9×
20g＝0.501g/d，0.501/0.4ml＝1.25g/ml/d，即为中剂量；1.25g/ml
×
2＝2.5g/ml/d即为高剂量；1.25g/ml/2＝0.62g/ml/d即为低剂量。
38.三、建立动物模型
39.按照上述摸索环磷酰胺诱导骨髓抑制的剂量-时间关系，采用环磷酰胺腹腔注射的方法建立小鼠骨髓抑制模型。每天腹腔注射1次，每次25mg/kg/d，连续10d。
40.四、动物分组及处理
41.72只c57bl/6雌性小鼠，适应性正常饲养1周后，随机分为6组，每组12只，分别为正常对照组(control)，模型组(model)，阳性药物组(positive)，低剂量中药组(low dose)，中剂量中药组(medium dose)，高剂量中药组(high dose)。正常对照组小鼠，正常饲养，除生理盐水灌胃外，不加任何其他干预；模型组小鼠，按照上述造模方法，连续腹腔注射10天，每天1次；低、中、高剂量中药组小鼠，按照上述方法造模，低、中、高剂量中药组小鼠分别按照0.62g/ml/d、1.25g/ml/d、2.5g/ml/d的三个剂量给予灌胃中药汤剂处理，每天1次，持续至12天到实验结束；阳性药物组小鼠则在腹腔注射环磷酰胺的第1天开始，每天皮下注射集落刺激因子(gm-csf)，按照临床常用剂量与动物剂量换算，以5μg/kg剂量皮下注射gm-csf，每天1次，给药持续至12天到实验结束。
42.五、样本采集及指标观察
43.1、中药方剂成份分析：为了明确在该研究中药方剂的主要化合物成份，取高剂量组中药2.5g/ml，用50％甲醇稀释至5mg/ml，取400ul，13500rpm，25min，取上清80ul进行高效液相色谱(hplc)分析。
44.2、小鼠大体情况的动态观测：实验期间，观察各组小鼠的体重变化、毛发情况，饮水和进食变化情况，活泼度以及对外界刺激的反应情况。实验开始前称量各组小鼠的体重，每天称量一次体重、水量、食物量，动态观察各组小鼠的体重、饮水和进食变化。
45.3、小鼠胸腺、脾、肝的测定：采用天平称量小鼠取材前的体重，采血后颈椎脱臼处死小鼠，用大头针和粗棉线将小鼠仰卧位固定于泡沫盒盖上，冰上剪开胸腹部皮肤，取小鼠体内的胸腺、脾、肝，用滤纸吸干，并称量其重量，具体比较各组小鼠的胸腺、脾、肝的重量及脏器指数，同时利用体视镜观察比较各组小鼠胸腺、脾的形态变化。
46.4、小鼠外周血细胞的采集及保存：各组小鼠完成给药后，称量体重，摘眼球法抽取小鼠外周血，置于肝素ep管中，4℃冷冻保存待测，采用血液分析仪器计算各类外周血细胞数。
47.5、小鼠血浆采集保存及gm-csf、tpo、epo含量检测
48.各组小鼠完成给药后，摘眼球法抽取小鼠外周血，置于肝素ep管中，3000rpm离心20min，取上清即为血浆，-80℃冷冻保存待测。
49.(1)血清样品从-80℃冰箱中取出，冰上自然解冻，将血清和样品稀释液按1:1体积
7.9，10％glycerol，300mm nacl，1.5mm kcl，0.1mm edta，1mm dtt，1μg/ml leupeptin，1mm pmsf)中，0℃涡旋30min，4℃ 15，000
×
g离心10min，取上清，采用bca蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，然后储存于-80℃备用。
56.(1)按照上述配方配制12％的分离胶及5％的浓缩胶；将蛋白样品与5
×
蛋白上样缓冲液按4：1的体积比混合；(2)待胶凝固好后，放置于电泳槽中，内槽加满电泳缓冲液，根据蛋白定量的结果加样，每孔加样60μg蛋白；(3)接上电极，将电压调到80v开始电泳，当溴酚蓝通过浓缩胶和分离胶界面的时候，将电压调到120v，恒压，直至溴酚蓝跑到底部，停止电泳。(4)将pvdf膜浸入甲醇溶液中1-2min进行活化。切下分离胶，将胶放到转膜缓冲液中平衡30min，按照由下至上分别为阳极碳板、滤纸、pvdf膜、凝胶、滤纸、阴极碳板的顺序制备转膜三明治，用玻璃棒赶掉气泡；(5)将转膜槽放在冰浴中，300ma恒流转膜100min；(6)封闭：转膜结束后，小心取出pvdf膜，并用tbst洗膜，5min
×
3次，加入5％bsa/脱脂牛奶封闭液，室温于脱色摇床上缓慢摇动1.5h；(7)孵育一抗：封闭完成后，tbst洗膜，5min
×
3次，将膜用滤纸稍吸去多余tbst，后放置于按1：1000稀释的一抗溶液中，4℃冰箱中摇床孵育过夜；(8)孵育二抗：次日，取出pvdf膜，tbst洗膜，10min
×
3次，后将膜用滤纸稍吸去多余tbst，后放置于按照1：2000稀释二抗，二抗使用5％bsa或脱脂牛奶配制，室温孵育1.5h；(9)取出pvdf，1
×
tbst洗膜，5min
×
3次，暗室中将膜涂上事先配制好的ecl发光液(发光液a液:b液按1:1比例配制)，确保整张pvdf膜上均有发光液覆盖，吸去多余的发光液，盖上保鲜膜，开始压片，每次压片的时间需根据实际情况而定；(10)暗室中取出胶片并放入显影液中，观察到影像后，取出，清水漂洗后，立即放入定影液中，后洗干净胶片并晾干。(11)分析结果：用扫描仪将胶片上扫描成电子图片并保存；采用bio-rad的quantity one图像分析系统分析各蛋白条带的积分光密度。
57.9、小鼠脾组织的收集及nrf2、nqo1和ho1蛋白和基因的检测
58.组织标本的收集：剪下脾组织，pbs漂洗后，分成三部分，一部分固定于4％的多聚甲醛溶液中，室温放置，留作组织学检测；一部分浸在rnalater保存液中，-80℃冷冻保存，留作rt-pcr检测；一部分直接放在1.5ml ep管中，-80℃冷冻保存，留作western blot检测。
59.小鼠股骨、脾、肝组织的组织学检测
60.清洗小鼠肺组织固定液后，经过脱水透明、浸蜡包埋后，做2-3μm的切片。将切下的薄片放在加热的水中烫平，贴在防脱的载玻片上，45℃烘箱中烤干。
61.(1)股骨、脾、肝组织he染色
62.1)脱蜡：二甲苯ⅰ5min
→
二甲苯ⅱ5min
→
100％酒精ⅰ1min
→
100％酒精ⅱ30s
→
95％酒精30s
→
90％酒精30s
→
自来水浸洗10-30s。
63.2)染色：苏木素染液10-15min
→
水洗20s
→
1％盐酸酒精分化切片(上下三次、颜色由蓝变红)
→
自来水冲冼15min
→
1％伊红酒精浸染3min
→
水洗1min。
64.3)脱水、透明、封片：95％酒精ⅰ30s
→
95％酒精ⅱ30s
→
100％酒精ⅰ30s
→
100％酒精ⅱ30s
→
二甲苯ⅰ30s
→
二甲苯ⅱ30s
→
二甲苯ⅰ透明30s
→
二甲苯ⅱ透明30s
→
取出后用中性树胶室温封固。
65.4)染色结果：核：蓝紫色，胞浆：不同程度的粉红色。
66.(2)免疫组织化学方法检测小鼠脾组织内nqo1和ho1的表达
67.1)脱蜡：将组织切片常规脱蜡，pbs洗涤3次，每次3min；2)抗原修复：采用edta抗原
修复液(ph＝8.0)进行高压修复，冷却到室温后，pbs洗涤3次，每次3min；3)阻断内源性过氧化物酶：加1％的tritonx-100溶液促渗，洗涤后用0.3％的过氧化氢溶液作用10min以消除内源性的过氧化氢酶的影响；4)封闭：pbs洗涤后加入10％的牛血清白蛋白溶液封闭20min；5)孵育一抗：pbs洗涤过后，用滤纸吸干组织附近的水，用免疫组化笔在组织附近画圈，将玻片放在孵育暗盒里面的架子上面，分别向圈内滴加1:200稀释的抗小鼠nqo1和ho1抗体，37℃孵育1h；6)孵育hrp标记复合物：pbs洗涤3次，每次5min，向圆圈内滴加dako免疫组化检测试剂盒中的a液，37℃孵育30min；7)显色、衬染、封片：临时配制dab显色液。切片洗涤后，将片子甩干，滴加dab显色液，不时在显微镜下进行观察，待细胞着色明显，而底面颜色较淡时，马上水洗，终止染色反应，苏木素复染后，梯度酒精脱水之后，封片，置于普通显微镜下观察拍片。
68.小鼠脾组织nrf2、nqo1和ho1 mrna水平的检测
69.(1)采用trizol提取组织总rna
70.具体操作步骤：
71.1)取小鼠肺组织100mg左右于2ml ep管中，加入1ml trizol，加入钢珠，在研磨器中进行匀浆。冰上裂解1h。2)4℃，12，000
×
g离心10min，弃沉淀；3)上清移入另一管，每管加入200μl氯仿，剧烈震荡混匀15s，室温静置2～3min；4)4℃12，000
×
g离心15min，吸取上层水相200ul，至另一离心管中；5)每管加入0.5ml异丙醇，混匀，室温放置10min；6)4℃12，000
×
g离心10min，用200ul移液枪弃上清，rna沉于管底；7)每管加入900ul75％的乙醇，温和震荡离心管，悬浮沉淀，弹散团块；8)4℃8，000
×
g离心5min，尽量小心弃上清，室温晾干10min；9)每管50μl depc处理过的水溶解rna样品，55℃10min，取出冰上3min；10)测定a260和a280处的od值，判断rna的纯度和定量。
72.(2)将rna逆转录为cdna
73.具体操作步骤：
74.1)rna样品冰上解冻；2)depc水18ul稀释rna样品2ul；3)检测前重新上机定量rna浓度；4)按逆转录试剂盒说明书操作：5xprime script buffer 2ul，prime script ri enzyme mix 0.5ul，oligo dt prime(50mm)0.5ul，random 6mers 0.5ul，按上述比例每孔加入后混匀；5)每ep管加入上述混合物3.5ul，再根据rna浓度和上样体积，depc水加rna样品体积为6.5ul，最后共10ul。6)37℃加热15min后终止反应，置冰上；7)85℃加热5s使酶失活；
75.8)用depc水将反应体系稀释到50μl，取2-5μl进行pcr扩增反应。
76.(3)荧光实时定量pcr
77.1)引物设计与合成
78.根据权威文献自主设计小鼠nrf2、nqo1和ho1引物序列(北京六合华大基因科技有限公司合成)。
79.表13引物序列信息
[0080][0081]
2)real-time pcr扩增
[0082]
表14扩增体系
[0083][0084]
pcr反应条件：95℃30sec；95℃5sec；60℃34sec；72℃30sec，共120min。
[0085]
(3)pcr结果分析
[0086]
在扩增动力曲线中，ct值代表扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数；2-δδct
表示实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数，δδct＝(ct
目的
–
ct
内参
)
处理组
–
(ct
目的
–
ct
内参
)
对照组
。
[0087]
六、统计学处理方法
[0088]
实验数据以均数
±
标准差表示，采用spss 19.0统计软件，多组间比较用单因素方差分析方法，若方差齐时，两两比较采用lsd检验，p＜0.05为差异有统计学意义，p＜0.01为差异有显著统计学意义。若方差不齐时，两两比较采用dunnett t3检验，p＜0.05为差异有统计学意义，p＜0.01为差异有显著统计学意义。
[0089]
七、实验结果
[0090]
1、中药方剂成份分析
[0091]
从图1、表1可见，通过检测中药复方主要成份，结果提示复方中检测到化合物以黄芪、陈皮、生姜、甘草中的化合物为主。
[0092]
表1主要检测成份
[0093][0094]
2、中药方剂对小鼠一般情况的影响
[0095]
表2各组小鼠体重变化
[0096][0097][0098]
注：与正常对照组比较，
*
p＜0.05，
**
p＜0.01；与模型组比较，
#
p＜0.05，
##
p＜0.01。
[0099]
从表2可见，造模前，各组小鼠均比较健康，进食及饮水正常，活泼好动，毛发有光泽，没有体重下降、脱毛等的症状，各组小鼠体重经统计分析没有明显差异(p＞0.05)。造模开始后，持续观察各组小鼠的一般情况，定期称量小鼠体重和进食量。结果显示：正常对照组和阳性药物组、中药组小鼠，始终呈现比较健康的状态，体重稳定，无明显异常波动。通过化疗药物造模的小鼠，造模初期出现明显纳差症状，进食量及饮水量较其他组明显下降，毛发逐渐失去光泽，甚至脱毛，精神萎靡，活动量明显减少，因此，体重也较其它组明显下降。从绘制的各组小鼠体重变化曲线看，造模的小鼠在化疗开始的前9天，体重呈现进行性下降，正常对照组和阳性药物组、中药各剂量组小鼠体重变化曲线相对比较平坦，说明化疗药物对小鼠的体重、饮食具有明显的抑制作用，而中药各剂量组与阳性药物组小鼠体重变化曲线较为平坦，提示治疗药物干预的小鼠的体重、饮食未出现明显下降。提示本发明中药组合物可能可以改善肿瘤患者的生活质量，具有减毒作用。
[0100]
3、中药方剂对小鼠胸腺、脾和肝的影响
[0101]
表3各组小鼠胸腺、脾、肝的净重
[0102][0103]
注：与正常对照组比较，
**
p＜0.01；与模型组比较，
#
p＜0.05，
##
p＜0.01；与阳性药物组比较，
&&
p＜0.01；与高剂量中药组比较，^p＜0.05,^^p＜0.01。
[0104]
表4各组小鼠胸腺、脾、肝的脏器指数比较
[0105][0106][0107]
注：与正常对照组比较，
**
p＜0.01；与模型组比较，
##
p＜0.01；与阳性药物组比较，
&
p＜0.05,
&&
p＜0.01；与高剂量中药组比较，^p＜0.05。
[0108]
从图2、3和表3、4可见，与正常对照组比较，模型组胸腺、脾的净重和脏器指数均显著下降(p＜0.01)，肝净重及脏器指数明显升高(p＜0.01)。与模型组比较，阳性药物组的胸腺净重升高(p＜0.05)，高、中、低剂量中药组的胸腺净重下降(p＜0.05)，阳性药物组胸腺的脏器指数升高(p＜0.01)，各中药剂量组胸腺脏器指数下降(p＜0.01)。阳性药物组和各剂量中药组脾净重升高(p＜0.01)，中剂量中药组脾的脏器指数升高(p＜0.01)。阳性药物组和各剂量中药组的肝净重和脏器指数下降(p＜0.01)。结果表明，本发明中药组合物对化疗后脏器具有显著的保护作用。
[0109]
4、中药方剂对小鼠外周血细胞数的影响
[0110]
表5各组小鼠外周血中白细胞、血小板、红细胞数的变化
[0111][0112]
注：与正常对照组比较，
**
p＜0.01；与模型组比较，
#
p＜0.05，
##
p＜0.01；与阳性药物组比较，
&
p＜0.05，
&&
p＜0.01；与中剂量中药组比较，^^p＜0.01；与低剂量中药组比较，
％％
p＜0.01。
[0113]
从表5可见，与正常对照组比较，模型组的白细胞数量明显减少(p＜0.01)，血小板和红细胞数均明显升高(p＜0.01)，可能与化疗药物对机体引起的应激性反应相关。与模型组比较，阳性药物组和各中药剂量组均能显著提高白细胞数量(p＜0.01)，提示阳性药物和各剂量中药组能够提高小鼠外周血细胞中的白细胞数量，减少化疗药物导致白细胞下降的发生。阳性药物组和中剂量中药组能显著升高血小板数量(p＜0.01)，低剂量中药组明显下降(p＜0.05)。高、中剂量中药组的红细胞数量明显降低(p＜0.01)。阳性药物组和低剂量中药组在红细胞数量上无明显变化(p＞0.05)。阳性药物和各剂量中药组均能够上调白细胞数，以高、中剂量作用明显。提示本发明中药组合物对白细胞、血小板、红细胞均有一定的调节作用。
[0114]
5、中药方剂对小鼠血浆因子gm-csf、tpo、epo、il-2浓度的影响
[0115]
表6各组小鼠外周血中血浆因子gm-csf、tpo、epo和il-2浓度
[0116][0117]
注：与正常对照组比较，
**
p＜0.01；与模型组比较，
##
p＜0.01；与阳性药物组比较，
&
p＜0.05，
&&
p＜0.01；与高剂量中药组比较，^p＜0.05，^^p＜0.01；与中剂量中药组比较，
％％
p＜0.01。
[0118]
小鼠的血浆中造血因子gm-csf、tpo、epo的浓度(表6)，模型组比正常对照组小鼠的均明显减少(p＜0.01)，而阳性药物组和各中药剂量组均能不同程度地显著提高造血因子浓度(p＜0.01)，提示阳性药物和低剂量中药组能够提高小鼠血浆中的gm-csf浓度，减少
化疗后白细胞下降的发生。同时阳性药物组与高、中剂量中药组均能显著提高小鼠血浆中tpo的浓度(p＜0.01)。与模型组比较，阳性药物组和各剂量中药组均能显著提高化后后小鼠血浆中epo的浓度(p＜0.01，p＜0.05)。提示本发明中药组合物对小鼠血浆中造血因子gm-csf、tpo、epo的浓度均有一定的调节作用。此外，小鼠血浆中il-2浓度也发生变化，与正常对照组比较，模型组il-2浓度显著下降(p＜0.01)，阳性药物组和高、中、低剂量中药组血浆中il-2浓度均显著升高(p＜0.01)。上述结果表明，高、低剂量中药能够调节小鼠的血浆因子gm-csf、tpo、epo的表达，本发明中药组合物可能通过调节各种造血因子浓度，起到调节外周血细胞的作用。
[0119]
6、中药方剂对小鼠骨髓细胞的sca1、c-kit、lamin、cd48

cd150

的影响
[0120]
表7各组小鼠骨髓细胞的sca1、c-kit、lamin、cd48

cd150

的表达
[0121][0122][0123]
注：与正常对照组比较，
**
p＜0.01；与模型组比较，
##
p＜0.01；与阳性药物组比较，
&
p＜0.05，
&&
p＜0.01；与高剂量中药组比较，
％％
p＜0.01；与中剂量中药组比较，^^p＜0.01。
[0124]
从表7可见，各组小鼠的骨髓细胞中造血细胞表面标记物sca1表达不同，模型组比正常对照组小鼠的明显降低(p＜0.01)，而中剂量中药组均能显著提高sca1的表达(p＜0.01)，提示本发明中药组合物能够增强小鼠骨髓细胞中sca1的表达，减少骨髓抑制的发生。与正常对照组比较，模型组骨髓细胞中c-kit和lamin显著下降(p＜0.01)。与模型组比较，高剂量中药组能显著增强骨髓细胞中c-kit表达(p＜0.01)，阳性药物组和中、低剂量中药组中lamin的表达显著下降(p＜0.01)，高剂量中药组对lamin的表达无明显变化(p＞0.05)。阳性药物组和各剂量中药组均能显著增强cd48

cd150

的表达，从而降低造血干细胞的活性表达，缓解化疗药物对骨髓造血干细胞的刺激。上述结果表明，本发明中剂量中药能够明显提高sca1、c-kit的表达，降低lamin的表达，因此，本发明中药组合物可能通过提高造血干细胞数量，减少细胞破裂衰亡，从而改善造血功能。
[0125]
7、中药方剂对小鼠外周血单核细胞的cd3、cd4和cd8a表达的影响
[0126]
表8各组小鼠pbmcs中cd3、cd4和cd8a的表达
[0127][0128]
注：与正常对照组比较，
**
p＜0.01；与模型组比较，
##
p＜0.01；与阳性药物组比较，
&
p＜0.05，
&&
p＜0.01；与高剂量中药组比较，
％％
p＜0.01；与中剂量中药组比较，^^p＜0.01。
[0129]
从表8可见，与正常对照组比较，模型组小鼠的外周血单核细胞中cd3、cd4和cd8a的表达，均明显降低(p＜0.01)，而阳性药物组和各剂量中药组均能显著增强外周血单核细胞中cd3、cd4和cd8a的表达(p＜0.01)，提示本发明中药组合物具有增强小鼠外周血单核细胞中cd3、cd4和cd8a的表达，从而减少化疗后免疫功能抑制的发生，增强机体免疫功能的作用。
[0130]
8、中药方剂对小鼠胸腺的cd3和cd8a蛋白表达的影响
[0131]
表9各组小鼠胸腺的cd3和cd8a的表达
[0132][0133]
注：与正常对照组比较，
**
p＜0.01；与模型组比较，
##
p＜0.01；与阳性药物组比较，
&
p＜0.05，
&&
p＜0.01。
[0134]
从表9可见小鼠的胸腺中cd3和cd8a蛋白的表达，模型组比正常对照组小鼠的均明显降低(p＜0.01)，而阳性药物组和各剂量中药组均能不同程度地显著增加胸腺中cd3和cd8a的表达(p＜0.01)，提示本发明中药组合物具有增强小鼠胸腺中cd3和cd8a的表达，从而参与增强机体免疫功能的作用。
[0135]
9、中药方剂对小鼠胸腺的nrf2、nqo1和ho1蛋白表达的影响
[0136]
表10各组小鼠胸腺的nrf2、nqo1和ho1蛋白的表达
[0137][0138]
注：与正常对照组比较，
**
p＜0.01；与模型组比较，
##
p＜0.01；与阳性药物组比较，
&
p＜0.05，
&&
p＜0.01；与高剂量中药组比较，
％
p＜0.05，
％％
p＜0.01；与中剂量中药组比较，^^p＜0.01。
[0139]
从表10可见，与正常对照组比较，模型组小鼠的胸腺中nrf2、nqo1和ho1蛋白的表达均明显升高(p＜0.01)。与模型组比较，阳性药物组中nrf2、nqo1蛋白表达显著降低(p＜0.01)，各剂量中药组均能显著降低胸腺组织中nrf2蛋白的表达(p＜0.01)，显著升高nqo1和ho1蛋白的表达(p＜0.01)，提示本发明中药组合物可能具有增强小鼠胸腺中抗氧化蛋白的表达，从而减少化疗后体内氧化反应的发生，增强机体抵御能力。
[0140]
10、中药方剂对小鼠脾的nrf2、nqo1和ho1蛋白表达的影响
[0141]
表11各组小鼠脾的nrf2、nqo1和ho1蛋白的表达
[0142][0143]
注：与正常对照组比较，
**
p＜0.01；与模型组比较，
##
p＜0.01；与阳性药物组比较，
&
p＜0.05，
&&
p＜0.01；与高剂量中药组比较，
％
p＜0.05，
％％
p＜0.01；与中剂量中药组比较，^^p＜0.01。
[0144]
从表11可见，与正常对照组比较，模型组小鼠的脾脏中nrf2、nqo1和ho1蛋白的表达均明显升高(p＜0.01)。与模型组的nrf2蛋白表达比较，阳性药物组和高、低剂量中药组无显著变化，中剂量中药组中nrf2蛋白表达显著升高(p＜0.01)；与模型组的nqo1蛋白表达比较，阳性药物组和高、低剂量中药组显著升高(p＜0.01)，中剂量中药组中nqo1蛋白表达无明显变化(p＞0.05)；与模型组的ho1蛋白表达比较，阳性药物组和高、中、低剂量中药组显著降低(p＜0.01)。上述结果表明，本发明中药组能够提高nrf2的作用，以中剂量中药组
最为明显，nqo1在高、低中药组最为明显，由于中药的抗氧化作用，导致ho1的表达明显下降。
[0145]
11、中药方剂对小鼠脾的nrf2、nqo1和ho1 mrna表达的影响
[0146]
表12各组小鼠脾的nrf2、nqo1和ho1 mrna的表达
[0147][0148][0149]
注：与正常对照组比较，
**
p＜0.01；与模型组比较，
##
p＜0.01；与阳性药物组比较，
&
p＜0.05，
&&
p＜0.01；与高剂量中药组比较，
％
p＜0.05，
％％
p＜0.01；与中剂量中药组比较，^^p＜0.01。
[0150]
从表12可见，与正常组比较，模型组的nrf2和ho1 mrna的表达显著升高(p＜0.01)，而nqo1 mrna的表达显著下降(p＜0.01)。与模型组nrf2 mrna表达的相比，阳性药物组和高、中剂量组均显著升高(p＜0.01)，低剂量中药组显著下降(p＜0.01)。与模型组nqo1 mrna表达的相比，阳性药物组和高、低剂量组均显著升高(p＜0.01)，中剂量中药组无明显变化(p＞0.05)。与模型组ho1 mrna表达的相比，阳性药物组显著升高(p＜0.01)，中剂量组显著下降(p＜0.01)，高、低剂量组无明显变化(p＞0.05)。上述结果表明，本发明中药组能够提高nrf2和nqo1 mrna的表达，与蛋白表达一致。
[0151]
12、中药方剂对小鼠股骨、脾、肝he染色的影响
[0152]
苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining)，简称he染色法，石蜡切片技术里常用的染色法之一。脱氧核糖核酸(dna)两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。伊红是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明对比。
[0153]
如图4所示，在股骨组织切片中，he染色可以将细胞核染成蓝色。正常对照组小鼠股骨组织内细胞核染色较多，核内可见多个细胞分裂，而模型组小鼠股骨组织内细胞核染色较少，核内可见细胞分裂数减少。高、中、低剂量的中药处理的小鼠的股骨组织细胞核染色相对于模型组小鼠，明显增加，胞内细胞核分裂数也明显增加，其中低剂量中药组可见胞内多个细胞核分裂。正常对照组小鼠脾组织内细胞核染色较多，核染加深，而模型组小鼠脾组织内细胞核染色较少，核内染色数减少。高、中、低剂量的中药处理的小鼠的股骨组织细胞核染色相对于模型组小鼠，明显增加，细胞核染色数也明显增加。正常对照组小鼠肝组织
内细胞核染色较多，核染加深，胞核变形，不规则，空泡较少，伴周围细胞浸润，而模型组小鼠脾组织内细胞核染色较少，核内染色数减少，空泡较小，无明显周围细胞浸润。高、中、低剂量的中药处理的小鼠的肝组织细胞核染色相对于模型组小鼠，明显增加，空泡数明显减少，以中、低剂量中药组明显。
[0154]
13、中药方剂对小鼠脾的nqo1和ho1免疫组化的影响
[0155]
从图5的免疫组化结果显示，nqo1和ho1在正常的小鼠脾组织内呈阳性表达，表现为细胞胞浆和细胞间隙内呈现淡棕黄色的均匀染色。在模型组小鼠脾组织内，nqo1和ho1呈现弱阳性表达，表现为细胞胞浆和细胞间隙内出现少量的棕褐色染色。低、中、高剂量的中药处理的小鼠脾组织内nqo1和ho1的含量明显增加，以高、中剂量中药组明显，表现为细胞胞浆和细胞间隙内的棕褐色染色加深。阳性药物组也能明显增加小鼠脾组织内nqo1和ho1的表达。从nqo1和ho1的免疫组化的结果看，本发明中药组合物和集落刺激因子对小鼠脾组织内nqo1和ho1的表达具有明显的上调作用，提示本发明中药组合物可能参与了抗氧化反应，增强抗氧化因子nqo1和ho1的表达。
[0156]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0157]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。