一种基于大米蛹虫草子实体制备虫草素和降血压肽的方法

一种基于大米蛹虫草子实体制备虫草素和降血压肽的方法
1.技术领域
2.本发明属于一种基于大米蛹虫草子实体制备虫草素和降血压肽的方法，属于生物工程技术领域。


背景技术：

3.人工蛹虫草主要分为两类，一是虫体培养的蛹虫草，二是培养基培养的蛹虫草（microorganisms, 2022, 10(2):405.）。虫体培养蛹虫草除了成本较高、原材料有限、蛹体消毒不彻底等缺点外，栽培管理的难度也较高，不适于大规模生产（journal of fungi, 2021, 7(11):986.）。使用玉米、小麦、大米等代替虫体作为培养基具有操作简单、栽培料广泛、管理方便、低成本、高产量等特点，非常适合大规模培育蛹虫草。
4.虫草素作为虫草中具有代表性的核苷类物质，是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗生素，其纯品的售价在国际上的售价约为25000美元/g。international journal of medicinal mushrooms, 2015, 17(7):649-659.）。它具有广泛的生理功能如，抗肿瘤、增强免疫力、抑菌与抗炎等。虽然也能人工合成虫草素，但是价格昂贵、产量低，所以虫草素的主要来源依然是虫草。虫草素的结构与生理功能都已经研究得较为透彻，目前虫草素的研究工作主要集中在虫草素的增产和提取上。增产方法主要有菌株的选育、优化培养条件等；虫草素的提取主要通过超声提取、柱层析的方式进行分离纯化，此类方法过程繁琐、耗时长、容易对环境造成负担。
5.虫草属真菌中含有丰富的氨基酸，据研究表明桑、柞蚕蛹虫草和冬虫夏草中17种游离氨基酸总量分别为4255.7、1608.5和1875.5mg/100g，其中11种人体必需、半必需氨基酸以及10种药效氨基酸的含量和，分别占总含量的 60.4%、67.1%和57.7%，以及68.3%、66.0%和65.7%。虫草属真菌具有较高的生物活性多肽开发潜力，目前已经有多种生物功能的活性肽从虫草中被分离纯化，如抗氧化肽、抗菌肽、抗癌肽、降三高肽等。所以虫草属真菌中的蛋白质，不应在加工流程中作为废料舍弃，而应被视为一种生物资源收集起来。
6.双水相萃取技术是一种操作简单，易于放大的分离方法，自20世纪60年代提出以来得到广泛关注。双水相萃取在提取中兼具分离功能，具有生物相溶性高、易于放大、可连续化操作、不易引起蛋白质的变性失活等优势（advances in colloid and interface science, 2022, 302: 102618.）。该技术已经被应用于蛋白质、核酸、氨基酸、抗生素、色素以及中药材中的小分子化合物等产品的分离和纯化。传统的双水相系统是由亲水性的两种聚合物或一种水溶性聚合物与一种无机盐组成，若在双水相体系中加入氯化钠会改变原有体系的分配系数，起到更好的分离效果。
7.离子液体指完全由熔点低于100℃或通常在室温附近呈液态的由离子构成的物质。研究表明，离子液体的加入，改变大部分酶的催化活性与稳定性（cn202010190425.9）。
8.固定化酶技术主要是通过物理作用或化学作用，把游离酶固定在一定的空间范围
内或者固定在特定的位置以提高其催化性能和使用次数（cn201811463257.5）。与游离酶催化相比固定化酶的最大优势在于可以对酶分子高效回收，并多次利用，可以有效的降低酶催化的成本。酶固定后，还能提高酶的稳定性增加其利用次数。所以固定化酶技术在酶解中使用广泛。
9.在过去十年中，由于先进的微加工技术，分析系统的小型化迅速发展。近几年来，基于集成微流控系统的应用范围从基因组学和蛋白质组学扩展到医学诊断，药物发现以及许多其他研究领域。微反应器技术也助力了化学和生物相关邻域的发展。固定化酶技术和微反应器在酶催化反应中联合使用，不仅能提高酶的使用次数，降低使用成本，还能提高产物的转化率。但是也存在多次使用后酶活降低，更换酶制剂操作繁琐等缺点。在溶液中引入离子液体作为共溶剂，提高酶的活性增加其稳定性，从而达到延长酶的使用次数的作用。


技术实现要素：

10.本发明的目的在于提供一种基于大米蛹虫草子实体制备虫草素和降血压肽的方法，低成本、高效率地实现同时提取与分离虫草素和蛋白质。对虫草素粗产品继续纯化获得高纯度样品，使用离子液体强化的固定化酶微流场技术水解蛋白质制备天然活性肽。解决目前虫草素提取分离中存在的操作过程繁琐、生产周期长、能耗大、生物资源损失大和操作条件苛刻等问题，进一步提高大米蛹虫草的经济利用价值。
11.为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：一种基于大米蛹虫草子实体制备虫草素和降血压肽的方法，将大米蛹虫草子实体研磨成粉末，置于水中超声处理，为了虫草素和蛋白质更充分溶解，过滤后向滤液中加入peg和无机盐，使溶液形成双水相，上相经超滤膜分离回收peg和虫草素，下相经超滤膜分离回收粗蛋白和无机盐，粗蛋白经离子液体强化的固定化酶微流场水解后，经超滤和多步层析后得到降血压肽。
12.作为改进的是，上述方法具体包括以下步骤：s1:将新鲜的大米虫草子实体烘干后粉碎，过60目筛，得粉末；s2:将粉末置于水中搅拌成悬浊液，超声处理得悬浮液，保证虫草素和蛋白质更充分溶解；s3:将悬浊液过滤得澄清滤液，再向滤液中加入的peg和无机盐，搅拌后静置，待peg溶解后分层得双相体系产物，其中，无机盐、peg和滤液的质量比为（1-35）：（20-30）：100，ph范围4.5-7；s4:对双相体系产物进一步纯化，其中，上相产物经超滤处理后，将分子量大的溶液烘干回收peg，分子量小的溶液经萃取、冻干、结晶和重结晶获得高纯度虫草素；下相产物经超滤膜将分子量小的溶液烘干回收无机盐，分子量大的溶液冻干获得大米蛹虫草子实体粗蛋白；s5: 将粗蛋白和浓度为0.5-1000mm的铵离子液体分别配成混合溶液后，通入到装有固定化蛋白酶的微通道的微反应器中，水解制得多肽溶液；粗蛋白和离子液体水溶液的料液比为1：10-70；s6:用活性炭对多肽溶液进行脱色；s7:脱色后的多肽溶液经超滤、阳离子交换层析和凝胶层析得高活性组分，经液质
联用鉴定活性肽结构。
13.作为改进的是，步骤s1中烘干温度为55℃。
14.作为改进的是，步骤s2中悬浊液的料液比为5：20，超声处理的频率为50hz，超声时间为3h，超声处理的提取次数为2，超声温度为50℃，溶液ph为5-6，2次提取液合并。
15.作为改进的是，步骤s3中peg的分子量为1000-10000da，无机盐为硫酸铵和/或氯化钠、磷酸氢二钠、或硫酸钠。
16.进一步改进的是，步骤s3中peg的分子量为6000，无机盐为氯化钠和硫酸铵的混合，无机盐、peg和滤液的质量比30：20： 100，ph值为6.5。
17.作为改进的是，步骤s5中铵离子液体为1-辛基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑甲磺酸、1-丁基-3-甲基咪唑三氟甲磺酸盐、1-丁基-3-甲基吡啶四氟硼酸盐、氯化胆碱、或四甲基溴化铵；固定化蛋白酶的酶为碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶或风味蛋白酶。
18.进一步改进的是，步骤s5中离子液体为四甲基溴化铵，固定化蛋白酶的酶为碱性蛋白酶，微反应器中水解的流速为2.5 μl/min、粗蛋白的料液比为1：50、反应温度为60℃。
19.作为改进的是，步骤s6中活性炭的添加量0.1-3.5%，脱色温度30-60℃，脱色时间0.5-2.5h，脱色ph 3.5-7。
20.进一步改进的是，步骤s6中的活性炭的添加量为2%，脱色温度为45℃，脱色时间为1h，脱色ph为5.5。
21.作为改进的是，步骤s7中所用的超滤膜为5 kda，阳离子交换层所用的树脂为大孔树脂yk200，析洗脱液为a液0.01m盐酸溶液和b液0.01m氢氧化钠溶液，洗脱流速为1.5 ml收集第三个馏分，凝胶层析所用的色谱g-15，且洗脱液为纯水，洗脱流速为1.5 ml，收集第三个馏分。
22.有益效果：本发明一种基于大米蛹虫草子实体制备虫草素和降血压肽的方法，低成本、高效率地实现同时提取与分离虫草素和蛋白质。对虫草素粗产品继续纯化获得高纯度样品，使用离子液体强化的固定化酶微流场技术水解蛋白质制备天然活性肽，进一步提高大米蛹虫草的经济利用价值。
附图说明
23.图1为本发明双水相萃取虫草素和蛋白质的过程示意图；图2为本发明纯化后的虫草素晶体的质谱图；图3为本发明的新结构多肽的流离子图。
具体实施方式
24.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
25.实施例1
将蛹虫草子实体原料在烘箱中55℃烘干后，在常温下使用粉碎机粉碎，并过60目的筛网。
26.称取子实体粉末5g，置于100ml纯水中，调整ph值为5.5，玻璃棒搅拌形成悬浊液；将盛有悬浊液的玻璃器皿放入超声波仪中以55 hz，50℃，超声3h。
27.将提取液过滤，将过滤后的滤饼收集，重复超声提取步骤，经过滤后将2次滤液合并。取100ml滤液加入30g peg6000，15g硫酸铵，5g氯化钠，调节ph6.5，搅拌5min后，静置分层。经双水相萃取后上相澄清透明呈淡黄色，下相澄清透明无色。
28.收集上相液体，经5 kda超滤膜过滤后，加入2倍体积的乙酸乙酯进行萃取，除去乙酸乙酯层。
29.剩下的液体中加入1.5g脱色活性炭，并在水浴锅中50℃磁力搅拌（120rmp）脱色1h。脱色后的液体在离心机中以4000rmp，离心15min。收集上清，冷冻干燥后获得淡黄色粉末。将黄色粉末溶解于30ml的60℃乙醇中，在0℃进行结晶，分离得到结晶产物。得到的晶体再次使用热乙醇溶解，降温重结晶后并分离结晶产物，洗涤烘干得虫草素晶体。下相经超滤膜，获得蛋白溶液。经过生物活性分析测定，这个过程虫草素提取总回收率为63.20%，蛋白质的总回收率为16.75%。
30.实施例2将蛹虫草子实体原料在烘箱中以在55℃烘干，常温下使用粉碎机粉碎，过60目的筛网。称取子实体粉末5g，置于100ml纯水中，调整ph值为5.5，玻璃棒搅拌形成悬浊液。将盛有悬浊液的玻璃器皿放入超声波仪中以55 hz，50℃，超声3h。
31.将提取液过滤，将过滤后的固体，加入100ml的纯水中再次按第一次的条件超声提取，过滤第二次提取液，除去固体，将两次超声提取液合并。取100ml提取液加入30gpeg6000，20g硫酸铵，2g氯化钠，调节ph6.5，搅拌5min后，静置分层。经双水相萃取后上相澄清透明呈淡黄色，下相澄清透明无色。
32.收集上相液体，过5 kda超滤膜，后加入2倍体积的乙酸乙酯与上相进行萃取，除去乙酸乙酯层。剩下的液体中加入1.5g脱色活性炭，水域锅中120rmp，50℃，脱色1h后于离心机中以4000rmp，离心15分钟，除去活性炭。冷冻干燥剩下的液体得淡黄色粉末，将黄色粉末溶解于30ml的60℃的乙醇中，降温，在0℃结晶抽滤分离结晶产物，得到的晶体再次热乙醇溶解，降温结晶，抽滤分离结晶产物，洗涤烘干得虫草素晶体。下相经超滤膜，获得蛋白溶液。经过生物活性分析测定，这个过程虫草素提取总回收率为87.65%，蛋白质的总回收率为34.25%。
33.实施例3将蛹虫草子实体原料在烘箱中以在55℃烘干，常温下使用粉碎机粉碎，过60目的筛网。称取子实体粉末5g，置于100ml纯水中，调整ph值为5.5，玻璃棒搅拌形成悬浊液。
34.将盛有悬浊液的玻璃器皿放入超声清洗机中以55 hz，50℃，超声3h。将提取液过滤，将过滤后的固体，加入100ml的纯水中再次按第一次的条件超声提取，过滤第二次提取液，除去固体，将两次超声提取液合并。取100ml提取液加入25gpeg6000，20g硫酸铵， 1g氯化钠，调节ph6.5，搅拌5min后，静置分层。经双水相萃取后上相澄清透明呈淡黄色，下相澄清透明无色。
35.收集上相液体，过5 kda超滤膜，后加入2倍体积的乙酸乙酯与上相进行萃取，除去
乙酸乙酯层。剩下的液体中加入1.5g脱色活性炭，水域锅中120rmp，50℃，脱色1h后于离心机中以4000rmp，离心15分钟，除去活性炭。冷冻干燥剩下的液体得淡黄色粉末，将黄色粉末溶解于30ml的60℃的乙醇中，降温，在0℃结晶抽滤分离结晶产物，得到的晶体再次热乙醇溶解，降温结晶，抽滤分离结晶产物，洗涤烘干得虫草素晶体。下相经超滤膜，获得蛋白溶液。经过生物活性分析测定，这个过程虫草素提取总回收率为68.6%，蛋白质的总回收率为23.16%。
36.实施例4将四甲基溴化铵离子液体和粗蛋白水溶液配成溶液通入已经固定了碱性蛋白酶的微通道的微反应器（其中，微反应器的结构参考nutritional targeting modification of silkworm pupae oil catalyzed by a smart hydrogel immobilized lipase）中进行水解，离子液体浓度为5 mm,流速为0.5 μl/min，粗蛋白水溶液和离子液体水溶液的料液比为1：50，反应温度为20℃，其水解后溶液中的多肽浓度为0.93 mg/ml。
37.实施例5将四甲基溴化铵离子液体和蛋白质配成溶液通入已经固定了碱性蛋白酶的微通道的微反应器（其中，微反应器的结构参考nutritional targeting modification of silkworm pupae oil catalyzed by a smart hydrogel immobilized lipase）中进行水解，离子液体浓度为1000 mm,流速为10 μl/min，粗蛋白水溶液和离子液体水溶液的料液比为1：50，反应温度为80℃，其水解后溶液中的多肽浓度为6.23 mg/ml。
38.实施例6将四甲基溴化铵离子液体和蛋白质配成溶液通入已经固定了碱性蛋白酶的微通道的微反应器（其中，微反应器的结构参考nutritional targeting modification of silkworm pupae oil catalyzed by a smart hydrogel immobilized lipase）中进行水解，离子液体浓度为250 mm,流速为2.5 μl/min，粗蛋白水溶液和离子液体水溶液的料液比为1：50，反应温度为60℃，其水解后溶液中的多肽浓度为22.98 mg/ml。
39.实施例7蛋白水解后的产物用活性炭对多肽溶液进行脱色，随后经超滤、阳离子交换层析和凝胶层析得高活性组分，取凝胶色谱纯化后第三个馏分1ml于37℃真空离心浓缩仪中挥干溶剂，用超纯水重溶样品。于适量样品中加入dtt溶液使其终浓度为10mmol/l，于56℃水浴中还原1h。加入吲哚-3-乙酸溶液使其终浓度为50mmol/l，避光反应40min。使用自填脱盐柱脱盐，于45℃真空离心浓缩仪中挥干溶剂，之后将处理好的样品通过液质联用（lc-ms/ms）分析。
40.质谱分析结果使用软件peaks studio8.5 de novo的方法进行多肽序列解析，得到相应的肽段信息（图3）。
41.结果为agapppap、lsggldi、vasatpl、apdvptk和aclgvgpa，其中apdvptk和aclgvgpa为新多肽，其ace酶抑制活性的ic
50
为156.27和345.75 μm，对α-葡萄糖苷酶抑制活性的ic
50
为938.92和892.14 μm。
42.本发明一种基于大米蛹虫草子实体制备虫草素和降血压肽的方法，低成本、高效率地实现同时提取与分离虫草素和蛋白质。对虫草素粗产品继续纯化获得高纯度样品，使用离子液体强化的固定化酶微流场技术水解蛋白质制备天然活性肽，进一步提高大米蛹虫
草的经济利用价值。