一种双层水凝胶材料、其制备方法及应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及一种双层水凝胶材料、其制备方法及应用。


背景技术：

2.骨肉瘤会对患者的生存质量造成极大的影响，其手术切除后造成的骨缺损恢复仍然面临着诸多的挑战，总体上而言骨肉瘤的术后恢复治疗存在肿瘤复发率较高、骨生长较慢、病损区硬组织功能恢复不良、患者的生存质量差、生存率低等问题。
3.骨肉瘤治疗的术后初期，需要杀灭剩余的肿瘤细胞，待术区清理完成需要募集干细胞进行骨修复，探索一种防止肿瘤复发同时又促进骨再生的治疗方法迫切需要。然而，现有的骨组织工程水凝胶材料仍具有以下缺陷：
4.(1)无法模拟骨肉瘤的治疗过程；
5.(2)不能做到抑制肿瘤细胞的同时促进骨再生；
6.(3)机械强度不理想，无法提供骨组织修复的支架。
7.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供一种双层水凝胶材料及其制备方法，其既能够抑制肿瘤细胞又能够促进骨再生。
9.本发明的另一目的在于提供上述双层水凝胶材料在载药领域中的应用。
10.本发明的第三目的在于提供上述双层水凝胶材料在骨组织工程中的应用。
11.本发明是这样实现的：
12.第一方面，本发明提供一种双层水凝胶材料，包括内层水凝胶和包覆于内层水凝胶上的外层水凝胶，内层水凝胶是由甲基丙烯酰化透明质酸和f127混合后光固化形成，外层水凝胶是由甲基丙烯酸化明胶光固化形成，在内层水凝胶和外层水凝胶上均负载有褪黑素，褪黑素在内层水凝胶上的负载量小于在外层水凝胶上的负载量。
13.在可选的实施方式中，在所述内层水凝胶中，甲基丙烯酰化透明质酸和f127的质量比为1:1-2.0；优选为1:1；
14.优选地，甲基丙烯酰化透明质酸、f127和光引发剂lap溶液的质量体积比为5-10g：2-5g:100ml，光引发剂lap溶液的质量分数为0.2-0.3％；
15.更优选地甲基丙烯酰化透明质酸、f127和光引发剂lap溶液之间的质量体积比为5g:5g:100ml，光引发剂lap溶液的质量分数为0.25％。
16.第二方面，本发明提供一种前述实施方式中任一项的双层水凝胶材料的制备方法，包括：以甲基丙烯酰化透明质酸、f127和褪黑素为原料制备所述内层水凝胶，然后以甲基丙烯酸化明胶和褪黑素为原料在所述内层水凝胶上制备所述外层水凝胶；
17.优选地，外层甲基丙烯酸化明胶和光引发剂lap溶液之间的质量体积比为5-10g:
100ml，光引发剂lap溶液的质量分数为0.2-0.3％。
18.在可选的实施方式中，包括：将甲基丙烯酰化透明质酸、f127和光引发剂lap混合得到第一混合溶液，将第一混合溶液和褪黑素混合得到内层混合液，将内层混合液在光照条件下固化成型得到内层载药水凝胶；
19.将甲基丙烯酸化明胶和光引发剂lap混合得到第二混合溶液，将所述第二混合溶液与褪黑素均匀混合得到外层载药水凝胶混合液，将所述的外层载药水凝胶混合液均匀包裹固化后的内层水凝胶后进行光照固化，以在所述内层载药水凝胶上形成所述外层载药水凝胶。
20.在可选的实施方式中，甲基丙烯酰化透明质酸在所述第一混合溶液中的质量分数为0.05-0.1g/ml，f127在所述第一混合溶液中的质量分数为0.02-0.05g/ml，每毫升所述第一混合溶液对应褪黑素的用量为0.23-2.32mg；
21.优选地，甲基丙烯酰化透明质酸在所述第一混合溶液中的质量分数为0.05-0.10g/ml，f127在所述第一混合溶液中的质量分数为0.02-0.05g/ml，每毫升所述第一混合溶液对应褪黑素的用量为1.1-1.3mg。
22.在可选的实施方式中，甲基丙烯酸化明胶在所述第二混合溶液中的质量分数为0.05-0.10g/ml，每毫升所述第二混合溶液对应褪黑素的用量为2.90-92.91mg；
23.优选地，甲基丙烯酸化明胶在所述第二混合溶液中的质量分数为0.05-0.10g/ml，每毫升所述第二混合溶液对应褪黑素的用量为20-30mg；
24.优选地，在第二混合溶液的制备过程中包括：将甲基丙烯酸化明胶和光引发剂lap混合，然后在50-60℃的条件下处理以使原料融化。
25.在可选的实施方式中，在内层水凝胶和外层水凝胶固化成型时均是在光固化灯的照射下固化0.5-2min；
26.优选地，光固化灯所发出光的波长为400nm-480nm；优选为405nm。
27.第三方面，本发明提供前述实施方式中任一项的双层水凝胶材料或前述实施方式中任一项制备方法制备得到的双层水凝胶材料在载药领域中的应用。
28.第四方面，本发明提供前述实施方式中任一项的双层水凝胶材料或前述实施方式中任一项制备方法制备得到的双层水凝胶材料在骨组织工程中的应用。
29.本发明具有以下有益效果：通过甲基丙烯酰化透明质酸(hama)和f127形成内层水凝胶，利用甲基丙烯酸化明胶(gelma)形成包覆于内层水凝胶上的外侧水凝胶，内外两层水凝胶上均负载有褪黑素，在外层水凝胶上高浓度褪黑素具有抑制肿瘤增殖、分化及转移的功能，在内层水凝胶上低浓度的褪黑素则具有诱导干细胞成骨分化和矿化的能力。
30.此外，gelma和hama/f127具有便携的成形方式和良好的生物兼容性，也可以为骨修复提供良好的力学微环境，同时内层水凝胶可以稳定缓慢释放药物，可以较长时间促进干细胞成骨，从而促进骨修复，因而本载药系统可以应用于骨肉瘤患者的术后恢复治疗中，具有良好的应用前景。
附图说明
31.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对
范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
32.图1为本发明实施例提供的构建的载褪黑素的双层水凝胶载药体系的实物图；
33.图2改变内层结构的f127和hama的用量后的浸出液对bmscs增殖的影响；
34.图3为本发明实施例提供的双层水凝胶载药体系的外层gelma扫描电镜；
35.图4为本发明实施例提供的双层水凝胶载药体系的内层5％hama 5％f127的扫描电镜图；
36.图5为本发明实施例提供的制备的双层水凝胶载药体系的扫描电镜图；
37.图6为本发明实施例提供的双层水凝胶载药体系载外层载各个浓度的褪黑素后浸出液对骨肉瘤细胞mg63和u2os的增殖影响的cck8检测；
38.图7为本发明实施例提供的双层水凝胶载药体系载外层载各个浓度褪黑素后浸出液对大鼠骨髓间充质干细胞增殖影响的cck-8检测结果；
39.图8为本发明实验例提供的双层水凝胶载药系统的外层载药水凝胶浸出液进行的集落实验，集落实验是通过在6孔板均匀种1000个细胞/孔，而后分别加入完全培养基、5％gelma浸出液和5％gelma 褪黑素(100mm)浸出液分别培养细胞，第10天进行结晶紫染色检测集落数量；
40.图9为本发明实施例提供的双层水凝胶载药体系内层载褪黑素后浸出液对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化影响的alp定量检测；
41.图10为进行材料体内降解实验的过程，包括剃毛、消毒、切开皮肤、放入双层水凝胶系统、缝合消毒；
42.图11为降解试验测试前后水凝胶材料的状态图；图11中(a)表示合成的产品中内层、外层和双层水凝胶的实物图；(b)-(d)表示降解试验1周之后取出的双层水凝胶的实物图。
具体实施方式
43.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
44.本发明实施例提供一种双层水凝胶载药体系的制备方法，包括以下步骤：
45.s1、内层水凝胶载药体系的构建
46.以甲基丙烯酰化透明质酸(hama)、f127和褪黑素为原料制备内层水凝胶，在实际操作过程中可以采用光固化的方式进行制备，具体步骤包括：将甲基丙烯酰化透明质酸、f127和光引发剂lap溶液混合得到第一混合溶液，将第一混合溶液和褪黑素混合得到内层混合液，将内层混合液在光照条件下固化成型得到内层水凝胶。
47.具体地，hama是通过在透明质酸分子链上引入甲基丙烯基团，从而拥有光敏性的生物水凝胶材料，是一种现有原料，具有便携的成形方式和良好的生物兼容性。f127也是一种现有的原料，f127具有优异的热致凝胶特性和良好的生物安全性，基于f127的材料体系被广泛应用于生物医学领域，例如药物载体，伤口辅料等，f127和hama配合，不仅内层水凝
胶具有更大材料强度，还能延长降解时间，达到很好的缓释效果，为骨修复提供支架的同时促进干细胞成骨成骨分化。
48.褪黑素(melatonin，mt)在骨肉瘤中的研究为临床中骨肉瘤的治疗打开了新视野。mt是人体内的一种神经内分泌激素，为吲哚类激素，化学名为n-乙酰-5-甲氧基色胺，是l-色氨酸的前体。
49.为进一步提出内层水凝胶促进骨再生的能力，对原料的用量进行优化：
50.甲基丙烯酰化透明质酸在所述第一混合溶液中的质量分数为0.05-0.1g/ml，f127在所述第一混合溶液中的质量分数为0.02-0.05g/ml，每毫升所述第一混合溶液对应褪黑素的用量为1.1-1.3mg。将原料的用量控制在上述范围内为宜，以保证较好的促进骨再生的性能。
51.具体地，甲基丙烯酰化透明质酸在第一混合溶液中的质量分数为0.05g/ml、0.06g/ml、0.07g/ml、0.08g/ml、0.09g/ml、0.1g/ml等，也可以为以上相邻浓度值之间的任意值；f127在第一混合溶液中的质量分数为0.02g/ml、0.03g/ml、0.04g/ml、0.05g/ml等，也可以为以上相邻浓度值之间的任意值；每毫升第一混合溶液对应褪黑素的用量为1.1-1.3mg中的任意值。
52.在实际操作过程中，光照条件下固化成型是在光固化灯的照射下固化0.5-2min(如0.5min、1.0min、1.5min、2.0min等)，光固化灯所发出光的波长为400nm-480nm。
53.具体地，在制备内层水凝胶时所采用的光引发剂可以为常规光引发剂lap，要求的使用浓度为0.25％(光引发剂lap(为粉末)/pbs的质量体积比)。
54.s2、gelma/hama/f127双层水凝胶载药体系的构建
55.以甲基丙烯酸化明胶(gelma)为原料在内层水凝胶上制备外层水凝胶，以构建gelma/hama/f127双层水凝胶载药体系。
56.具体地，gelma是一种现有的光敏性的生物水凝胶材料，该材料具有优异的生物相容性，且可由紫外光或可见光激发固化反应，形成适于细胞生长与分化且有一定强度的三维结构。其生物相容性远优于基质胶、纤维蛋白胶，而与胶原性能相近，同时成形性能远优于胶原。
57.在一些实施例中，也可以采用光照固化的方式形成外层水凝胶，具体步骤包括：甲基丙烯酸化明胶和光引发剂lap溶液混合得到第二混合溶液，将第二混合溶液与褪黑素混合得到外层水凝胶褪黑素混合液，将外层水凝胶褪黑素混合溶液均匀地包裹光固化后的内层载褪黑素水凝胶。具体的成型过程可以借助不同尺寸的模型制备两层水凝胶。
58.为提升外层水凝胶抑制肿瘤细胞的性能，发明人对原料的用量进行了优化：外层甲基丙烯酸化明胶和光引发剂lap溶液之间的质量体积比为5-10g:100ml，光引发剂lap溶液的质量分数为0.2-0.3％。甲基丙烯酸化明胶在第二混合溶液中的质量分数为0.05-0.10g/ml，每毫升第二混合溶液对应褪黑素的用量为2.90-92.91mg；优选地，每毫升第二混合溶液对应褪黑素的用量为20-30mg。
59.具体地，通过控制光引发剂的用量，使甲基丙烯酸化明胶在第二混合溶液中的质量分数可以为0.05-0.10g/ml等，也可以为以上相邻浓度值之间的任意值；每毫升第二混合溶液对应褪黑素的用量为2.90-92.91之间的任意值。
60.在一些实施例中，在第二混合溶液的制备过程中包括：将甲基丙烯酸化明胶和光
引发剂混合，然后在50-60℃的条件下处理以使原料融化，以使其能和褪黑素充分混合，后续的光照进行固化。
61.在可选的实施方式中，在外层水凝胶固化成型时是在光固化灯的照射下固化0.5-2min(如0.5min、1.0min、1.5min、2.0min等)；光固化灯所发出光的波长为400-480nm。
62.具体地，在制备外层水凝胶时所采用的光引发剂可以为常规光引发剂lap，要求的使用浓度为0.25％(光引发剂lap(为粉末)/pbs的质量体积比)。
63.本发明实施例还提供一种双层水凝胶材料，可以通过上述制备方法制备而得。具体而言，包括内层水凝胶和包覆于内层水凝胶上的外层水凝胶，内层水凝胶是由甲基丙烯酰化透明质酸和f127混合后光固化形成，外层水凝胶是由甲基丙烯酸化明胶光固化形成，在内层水凝胶和外层水凝胶上均负载有褪黑素，褪黑素在内层水凝胶上的负载量小于在外层水凝胶上的负载量。
64.在使用时，外层gelma载高浓度褪黑素抑制肿瘤细胞生长，低浓度的gelma可以在段时间内降解释放高浓度的褪黑素，而内层hama f127混合而成的水凝胶载低浓度褪黑素可以促进成骨。内外层结构中所载的褪黑素通过有序释放，在初期释放高浓度褪黑素杀灭肿瘤细胞，后期内层持续释放低浓度褪黑素促进骨修复。mt@gelma载药系统为抑制肿瘤增殖分化转移的核心成分，hama/f127混合水凝胶的多孔，多网络结构为药物二级缓释的主要部分，同时也提供骨修复提供良好的支架。
65.需要说明的是，为了在达到抑制肿瘤和促进成骨的效果，本发明实施例通过构建新型双层水凝胶载褪黑素系统来程序性释放不同浓度的褪黑素实现在肿瘤手术初期抑制肿瘤及后期促进骨修复的过程。本发明实施例的外层由gelma负载高浓度的褪黑素后光固化形成，而内层则由hama、f127和低浓度的褪黑素混合后光固化形成，gelma是一种具有良好生物相容性的水凝胶，其具有降解速度快，强度较低等特点，外层gelma在手术初期即快速降解释放出高浓度的褪黑素杀灭肿瘤细胞，同时，外层所载水凝胶的浓度也不至于过度杀伤骨髓间充质干细胞。另一方面内层的hama/f127水凝胶混合光固化后具有较高的强度，可以缓慢释放低浓度的褪黑素促进骨再生，促进骨缺损修复，可以达到药物的多级缓释作用，使得mt发挥更持久的作用。
66.为提升外层水凝胶对肿瘤细胞的抑制效果，提升内层水凝胶促进骨再生的能力，发明人对产品中各组分的含量进行了优化：甲基丙烯酰化透明质酸、f127和光引发剂lap溶液的质量体积比为5-10g：2-5g:100ml，光引发剂lap溶液的质量分数为0.2-0.3％；优选地甲基丙烯酰化透明质酸、f127和光引发剂lap溶液之间的质量体积比为5g:5g:100ml，光引发剂lap溶液的质量分数为0.25％。
67.需要说明的是，本发明实施例所提供的双层水凝胶应用非常广泛，可以在生物医药领域得到广泛的应用，比如本技术实施例所构建的双层水凝胶可以在载药领域得到应用。更为重要的应用是将该双层水凝胶应用于骨组织工程中，用于骨肉瘤患者术后恢复治理。
68.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
69.实施例1
70.本实施例提供一种双层水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
71.(1)内层水凝胶载药体系的构建
72.将5g hama、5g f127和100ml光引发剂lap(浓度为0.25％)，在常温下溶解得到第一混合溶液，将每1ml第一混合溶液与1.16mg褪黑素混合均匀得到内层混合液，将内层混合液注射入小型号模具(模具内腔长、宽、高分别为5*5*2.5，下同)中，每一个小号模具需要60μl的内层混合液，而后采用450nm波长光固化灯固化1min形成内层水凝胶。
73.(2)gelma/hama/f127水凝胶的构建
74.将5g gelma与100ml光引发剂lap(浓度为0.25％)混合，在55℃的水浴锅中加热使原料融化得到第二混合溶液，将每1ml第二混合溶液与23.23mg褪黑素混合均匀得到外层混合液。
75.将外层混合液注射入大型号的模具(长、宽、高分别为7*7*4.45，下同)中，将步骤(1)中得到的水凝胶固体放入外层混合液中，使外层混合液均匀包裹水凝胶固体，而后采用450nm波长光固化灯固化1min，得到如图1所示的产品。
76.图1中为了更好地区分内层水凝胶和外层水凝胶，对内层水凝胶进行了染色。
77.实施例2
78.本实施例提供一种双层水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
79.(1)将5g hama、2g f127和100ml光引发剂lap(浓度为0.25％)混合，在常温下溶解得到第一混合溶液，将每1ml第一混合溶液与0.23mg褪黑素混合均匀得到内层混合液，将内层混合液注射入小型号模具中，而后采用450nm波长光固化灯固化1min形成内层水凝胶。
80.(2)gelma/hama/f127水凝胶的构建
81.将4g gelma与100ml光引发剂lap(浓度为0.25％)混合，在55℃的水浴锅中加热使原料融化得到第二混合溶液，将每1ml第二混合溶液与2.90mg褪黑素混合均匀得到外层混合液。
82.将步骤(1)中得到的水凝胶固体置于大型号的模具中(模具内腔长、宽、高分别为5*5*2.5)，将外层混合液注射入大型号的模具中(长、宽、高分别为7*7*4.45)，使水凝胶固体处于中间位置使外层混合液均匀包裹水凝胶固体，而后采用450nm波长光固化灯固化1min。
83.实施例3
84.本实施例提供一种双层水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
85.(1)将10g hama、5g f127和100ml光引发剂lap(浓度为0.25％)混合，在常温下溶解得到第一混合溶液，将每1ml第一混合溶液与2.32mg褪黑素混合均匀得到内层混合液，将内层混合液注射入小型号模具中，而后采用450nm波长光固化灯固化1min形成内层水凝胶。
86.(2)gelma/hama/f127水凝胶的构建
87.将6g gelma与100ml光引发剂lap(浓度为0.25％)混合，在55℃的水浴锅中加热使原料融化得到第二混合溶液，将每1ml第二混合溶液与92.91mg褪黑素混合均匀得到外层混合液。
88.将步骤(1)中得到的水凝胶固体置于大型号的模具中(模具内腔长、宽、高分别为5*5*2.5)，将外层混合液注射入大型号的模具中(长、宽、高分别为7*7*4.45)，使水凝胶固体处于中间位置使外层混合液均匀包裹水凝胶固体，而后采用450nm波长光固化灯固化1min。
89.试验例1
90.在实施例1基础上仅改变f127和hama浓度，通过cck8实验探究f127和hama浓度对bmscs细胞增殖的影响，结果如图2所示。
91.结果显示：5％f127 10％hama对bmscs的增殖有显著抑制效果，考虑到f127和hama浓度的增加可以增加材料硬度，有利于骨修复提供支架，同时对bmscs的增殖不会产生明显的影响，因而选择5％f127 5％hama配方合成内层材料。
92.注：5％f127 5％hama是指：5gf127、5ghama溶在100ml的光引发剂lap中。
93.试验例2
94.测试实施例1中制备得到产品的外层gelma的结构，结果如图3所示，可以看出gelma具有大量的相对均一的多孔结构。
95.测试实施例1中制备得到产品的内层hama/f127结构，结果如图4所示，可以看出内层孔隙大小均匀一致，较外层结构致密。
96.测试实施例1中制备得到产品双层水凝胶系统的组合在一起的内外层结构，结果如图5所示。
97.试验例3
98.运用得到的双层水凝胶中的外层水凝胶载药的抗肿瘤效果，在实施例1基础上仅改变褪黑素的浓度，例如，褪黑素的浓度为12.5mm时表示褪黑素和gelma的质量体积比为12.5mg：4.3051mlgelma时，采用外层浸出液处理骨肉瘤细胞系mg63和u2os后分别于第3d进行cck-8增殖检测，结果如图6所示。
99.测试方法：浸出液的方法是按照文献常规报道进行，将水凝胶和药物合在一起后，37℃环境中泡在完全培养基中24小时即得浸出液。按照合成前水凝胶和药物形成体积比完全培养基＝1:50比例获得。
100.从图6可以看出，外层水凝胶抗肿瘤效果显著。
101.在实施例1基础上仅改变褪黑素浓度，采用外层浸出液处理大鼠bmscs，检测外层水凝胶杀伤骨肉瘤细胞的同时对bmscs的影响，结果如图7所示。从图7可以看出，当外层水凝胶载褪黑素的浓度小于100mm时的浸出液对bmscs的增殖没有明显的影响，而当外层水凝胶载褪黑素的浓度为100mm开始出现对bmscs细胞增殖的显著抑制，并且这种抑制效果随着外层载褪黑素的量增大而增大。
102.试验例4
103.测试实施例1中得到的外层水凝胶载褪黑素的浸出液对mg63和u2os的增殖的作用，结果如图8。
104.测试方法：细胞以1000个细胞/孔的密度均匀接种到6孔板中。待细胞贴壁后，相应地将不同的浸出液(完全培养基，gelma浸出液，gelma 褪黑素浸出液)分别加入。进一步培养10天后，用4％聚甲醛固定细胞，用0.1％结晶紫染色。拍摄染色菌落的图像，记录菌落的数量，并在不同组内进行比较。每个实验独立重复三次。
105.结果显示，gelma 褪黑素(100mm)组的浸出液对mg63和u2os的增殖有抑制作用。
106.注：100mm是褪黑素溶解在最初f127 hama溶液中的浓度，溶解之混匀后方才将f127 hama 褪黑素三者的混合物光固化。
107.试验例5
108.在实施例1基础上仅改变加入褪黑素的量，通过对混合不同浓度的褪黑素测试得
到的双层水凝胶中的内层水凝胶是否具备促进成骨分化的效果以及最佳的促进干细胞成骨分化的浓度。
109.测试方法：利用其浸出液处理大鼠bmscs，7天后，利用定量alp实验其检测对bmscs成骨分化的影响，结果如图9所示。
110.从图9可以采用alp定量分析的方法看出，在成骨诱导第7天的时候bmscs在不同浓度的内层浸出液的作用下成骨分化的能力出现了差异，其中当内层的载药浓度为5mm时，其浸出液对bmscs成骨分化的促进最强。
111.试验例6
112.测试实施例1中得到的双层水凝胶的可降解性，结果如图10所示，图10中(a)-(e)表示测试方法的具体操作过程。
113.测试方法：在6周大的sd大鼠的背部放入双层水凝胶结构，并进行缝合。7天后取出材料，结果显示双层水凝胶结构出现了明显的降解，其中外层均已完全降解，具体测试结果见表1。图11中(a)表示合成的产品中内层、外层和双层水凝胶的实物图；(b)-(d)表示降解试验之后取出的双层水凝胶的实物图。
114.表1可降解性试验的具体测试结果
[0115][0116]
综上所述，本发明立足于骨肉瘤患者术后恢复时对于剩余肿瘤细胞的杀伤和对骨缺损修复的促进，构建gelma hama/f127双层水凝胶支架；聚焦mt@gelma hama/f127抑制肿瘤并促进骨修复的双重作用，通过构建mt@gelma/hama/f127双层水凝胶载药系统以解决骨肉瘤肿瘤易复发，成骨缓慢这一难题，该双层水凝胶体系具有骨诱导性、肿瘤抑制性、载药缓释潜能，为骨肉瘤患者术后恢复治理提供重要的理论指导。
[0117]
发明人通过体内实验，探明本发明实施例中所制备的双层水凝胶具有良好的生物相容性和良好的降解性，同时体外实验表明搭载高浓度的褪黑素的外层水凝胶浸出液能有效抑制肿瘤细胞的生长，而负载低浓度的褪黑素的内层水凝胶能显著提高骨髓间充质干细胞成骨分化。最终达到抑肿瘤促成骨的作用，为骨肉瘤患者的术后恢复提供新的思路和方向。
[0118]
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。