一种两性离子聚合物修饰的纳米片的制备方法及其应用

1.本发明涉及高分子材料领域，尤其涉及一种两性离子聚合物修饰的纳米片的制备方法及其应用。


背景技术：

2.退行性骨关节炎(oa)的主要特征是关节润滑功能的散失以及炎症过表达。关节润滑功能丧失会使得关节软骨长期作用于高摩擦力，造成关节软骨损伤以及软骨基质降解；炎症过表达以炎症因子、降解酶、活性氧(ros)含量的升高为主要表现形式，同样会使得软骨细胞活性降低，影响细胞外基质的分泌。 ros主要包括过氧化氢(h2o2)、羟基自由基(
·
oh)和超氧阴离子(o2·-) 等，他们的过表达会造成氨基酸的氧化修饰，进而破坏蛋白质的结构，最终造成软骨损伤。因此，同时实现关节润滑功能的重塑以及活性氧的清除对于oa 的治疗具有重要意义。
3.由于关节腔是一个封闭的系统，关节腔注射是治疗oa的主要手段之一。目前，关节腔注射制剂主要是高分子量和超高分子量透明质酸。虽然这些制剂具有一定的关节润滑和炎症调控功能，但是，它们并不能够清除关节腔内过表达的活性氧。此外，oa也促进透明质酸酶的产生，关节腔注射透明质酸的疗效一般仅能维持3个月左右，需要反复注射才能达到持续性效果。因此，注射一种具备润滑、抗氧化(活性氧清除)且不受到降解酶影响的材料到关节腔中，可以更加有效地实现oa治疗。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于解决现有治疗骨关节炎的关节腔注射制剂抗氧化能力差，且易降解，疗效维持时间短的问题，提供一种两性离子聚合物修饰的纳米片的制备方法，制备得到的两性离子聚合物修饰的纳米片在骨关节炎的治疗中具有非常广阔的应用前景。
5.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种两性离子聚合物修饰的纳米片的制备方法，包括以下步骤：
6.s1、取二硫化钼(mos2)粉末溶于乙醇和水的混合溶剂中，超声制备mos2纳米片；
7.s2、将大分子引发剂psbma macro cta、偶氮二异丁腈(aibn)和甲基丙烯酸(n-羟基琥珀酰亚胺)酯(nhsma)溶解于三氟乙醇(tfe)中，通过聚合反应得到psbma-b-pnhsma嵌段聚合物；
8.s3、将s1中的mos2纳米片和多巴胺盐酸盐(da-hcl)于tris-hcl缓冲液中反应，得到mos2@pda纳米片；
9.s4、将s3中的mos2@pda纳米片和s2中的psbma-b-pnhsma嵌段聚合物于pbs缓冲液中反应，制备得到两性离子聚合物修饰的纳米片 mos2@pda@psbma。
10.优选地，所述s2中将磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯(sbma)、偶氮二异丁腈 (aibn)和4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸(cpad)溶解于三氟乙醇(tfe)中，通过聚合反应得到大分子引发剂psbma macro cta。
11.优选地，所述磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯(sbma)、偶氮二异丁腈(aibn) 和4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸(cpad)的摩尔比为(200～20):2:1。
12.进一步优选，所述s2中大分子引发剂psbma macro cta和甲基丙烯酸(n
‑ꢀ
羟基琥珀酰亚胺)酯(nhsma)的摩尔比为(10～1)：1。
13.进一步优选，所述s3中mos2纳米片的反应浓度为1mg/ml；所述多巴胺盐酸盐(da-hcl)的反应浓度为1mg/ml或2mg/ml。
14.进一步优选，所述s4中mos2@pda纳米片的反应浓度为1mg/ml；所述 psbma-b-pnhsma嵌段聚合物的反应浓度为1mg/ml～10mg/ml；所述pbs 缓冲液浓度为0.1m，ph＝8.0。
15.更进一步优选，所述s3和s4中的反应条件为温度40℃，时间24h。
16.本发明同时提供上述制备方法制备得到的两性离子聚合物修饰的纳米片 mos2@pda@psbma及其在骨关节炎治疗中的应用。
17.本发明所具有的有益效果：
18.一)本发明通过超声法制备mos2纳米片，然后对其进行多巴胺修饰；通过raft法制备嵌段psbma-b-pnhsma共聚物；将psbma-b-pnhsma嵌段聚合物与经多巴胺改性的纳米片通过“一锅法”制备得到两性离子聚合物修饰的纳米片mos2@pda@psbma。在本发明的上述制备工艺中，各种功能组分之间可以相互促进，能够更好地发挥生物功能，使得制备的mos2@pda@psbma 纳米片能够清除炎症环境中过表达的活性氧，抗氧化能力强，同时不易受到降解酶影响，并具有优异的润滑性能用以保护关节软骨；
19.二)本发明中的制备工艺简单，反应条件温和，不需要特殊设备，适于工业生产与应用推广。
附图说明
20.图1为实施例1中mos2(1-a)和mos2@pda(1-b)的扫描电镜图；
21.图2为实施例1中psbma-b-pnhsma嵌段聚合物的红外光谱；
22.图3为实施例1中mos2@pda@psbma(mpp)纳米片的透射电镜图；
23.图4为实施例4中mos2@pda@psbma(mpp)纳米片催化过氧化氢产生氧气的图；
24.图5为实施例5中mos2@pda@psbma(mpp)纳米片对羟基自由基(
·
oh) 的清除性能试验结果图；
25.图6为实施例6和实施例7中mos2@pda@psbma(mpp)纳米片对细胞内羟基自由基和超氧阴离子清除性能试验结果图；
26.图7为实施例8中mos2@pda@psbma(mpp)纳米片的细胞相容性试验结果图；
27.图8为实施例9中mos2@pda@psbma(mpp)纳米片的润滑性能试验结果图；
28.图9为实施例10中mos2@pda@psbma(mpp)纳米片的光热转化性能实验结果图。
具体实施方式
29.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。
30.实施例1
31.1.超声法制备mos2纳米片
32.称取1.5g mos2粉末溶解于500ml乙醇和水的混合溶剂(乙醇和水的体积比113：
137)中，超声12小时，首先低速离心除去未被制成纳米片的mos2，然后高速离心20分钟，弃去上清液收集纳米片。将得到的纳米片置于真空烘箱中24小时，进一步除去溶剂从而得到mos2纳米片。mos2纳米片的扫描电镜图如附图1-a所示。
33.2.制备psbma-b-pnhsma嵌段聚合物
34.将磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯(sbma，18mmol)、偶氮二异丁腈(aibn， 0.18mmol)和链转移剂4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸(cpad，0.09mmol)溶解于5ml三氟乙醇(tfe)中，通过三冻三抽除去反应体系中的氧气。避光条件下，将反应管放入油浴锅(65℃)中聚合24小时，冰甲醇沉淀3次得到大分子引发剂psbma macro cta。
35.将大分子引发剂psbma macro cta、aibn(0.03mmol)和甲基丙烯酸(n
‑ꢀ
羟基琥珀酰亚胺)酯(nhsma，与大分子引发剂的摩尔投料比为1：10)溶解于 4ml tfe中，通过三冻三抽除去反应体系中的氧气，于65℃油浴中避光反应 24小时，聚合结束后用冰甲醇沉淀3次得到产物psbma-b-pnhsma嵌段聚合物。psbma-b-pnhsma嵌段聚合物的红外光谱如附图2所示。
36.3.制备mos2@pda(mp)纳米片
37.将步骤1制备的mos2纳米片和多巴胺盐酸盐(da
·
hcl)一起溶解于tris-hcl缓冲液中，mos2纳米片的浓度为1mg/ml，da
·
hcl溶解后的浓度为1mg/ml。于40℃反应24小时，离心后用去离子水洗涤3次，真空干燥得到mos2@pda(mp)纳米片。mos2@pda(mp)纳米片的扫描电镜图如附图 1-b所示。
38.4.制备mos2@pda@psbma(mpp)纳米片
39.将步骤3制备的mos2@pda纳米片和步骤2制备的psbma-b-pnhsma 嵌段共聚物溶解于pbs缓冲液(0.1m，ph＝8.0)中，mos2@pda纳米片溶解后的浓度为1mg/ml；psbma-b-pnhsma嵌段共聚物溶解后的浓度分别为10 mg/ml，于40℃反应24小时后，离心后用去离子水洗涤3次，真空干燥得到 mos2@pda@psbma(mpp)纳米片。mos2@pda@psbma(mpp)纳米片的投射电镜图片如图3所示。
40.实施例2
41.1.超声法制备mos2纳米片
42.称取1.5g mos2粉末溶解于500ml乙醇和水的混合溶剂(乙醇和水的体积比113：137)中，超声12小时，首先低速离心除去未被制成纳米片的mos2，然后高速离心20分钟，弃去上清液收集纳米片。将得到的纳米片置于真空烘箱中24小时，进一步除去溶剂从而得到mos2纳米片。
43.2.制备psbma-b-pnhsma嵌段聚合物
44.将磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯(sbma，9mmol)、偶氮二异丁腈(aibn， 0.18mmol)和链转移剂4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸(cpad，0.09mmol)溶解于5ml三氟乙醇(tfe)中，通过三冻三抽除去反应体系中的氧气。避光条件下，将反应管放入油浴锅(65℃)中聚合24小时，冰甲醇沉淀3次得到大分子引发剂psbma macro cta。
45.将大分子引发剂psbma macro cta、aibn(0.03mmol)和甲基丙烯酸(n
‑ꢀ
羟基琥珀酰亚胺)酯(nhsma，与大分子引发剂的摩尔投料比为1：5)溶解于 4ml tfe中，通过三冻三抽除去反应体系中的氧气，于65℃油浴中避光反应 24小时，聚合结束后用冰甲醇沉淀3次得到产物psbma-b-pnhsma嵌段聚合物。
46.3.制备mos2@pda(mp)纳米片
47.将步骤1制备的mos2纳米片和多巴胺盐酸盐(da
·
hcl)一起溶解于 tris-hcl缓冲液中，mos2纳米片的浓度为1mg/ml，da
·
hcl溶解后的浓度为2mg/ml。于40℃反应24小时，离心后用去离子水洗涤3次，真空干燥得到mos2@pda(mp)纳米片。
48.4.制备mos2@pda@psbma(mpp)纳米片
49.将步骤3制备的mos2@pda纳米片和步骤2制备的psbma-b-pnhsma 嵌段共聚物溶解于pbs缓冲液(0.1m，ph＝8.0)中，mos2@pda纳米片溶解后的浓度为1mg/ml；psbma-b-pnhsma嵌段共聚物溶解后的浓度为5 mg/ml，于40
℃
反应24小时后，离心后用去离子水洗涤3次，真空干燥得到mos2@pda@psbma(mpp)纳米片。
50.实施例3
51.1.超声法制备mos2纳米片
52.称取1.5g mos2粉末溶解于500ml乙醇和水的混合溶剂(乙醇和水的体积比113：137)中，超声12小时，首先低速离心除去未被制成纳米片的mos2，然后高速离心20分钟，弃去上清液收集纳米片。将得到的纳米片置于真空烘箱中24小时，进一步除去溶剂从而得到mos2纳米片。
53.2.制备psbma-b-pnhsma嵌段聚合物
54.将磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯(sbma，1.8mmol)、偶氮二异丁腈(aibn， 0.18mmol)和链转移剂4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸(cpad，0.09mmol)溶解于5ml三氟乙醇(tfe)中，通过三冻三抽除去反应体系中的氧气。避光条件下，将反应管放入油浴锅(65℃)中聚合24小时，冰甲醇沉淀3次得到大分子引发剂psbma macro cta。
55.将大分子引发剂psbma macro cta、aibn(0.03mmol)和甲基丙烯酸(n
‑ꢀ
羟基琥珀酰亚胺)酯(nhsma，与大分子引发剂的摩尔投料比为1：1)溶解于 4ml tfe中，通过三冻三抽除去反应体系中的氧气，于65℃油浴中避光反应 24小时，聚合结束后用冰甲醇沉淀3次得到产物psbma-b-pnhsma嵌段聚合物。
56.3.制备mos2@pda(mp)纳米片
57.将步骤1制备的mos2纳米片和多巴胺盐酸盐(da
·
hcl)一起溶解于 tris-hcl缓冲液中，mos2纳米片的浓度为1mg/ml，da
·
hcl溶解后的浓度为1mg/ml。于40℃反应24小时，离心后用去离子水洗涤3次，真空干燥得到mos2@pda(mp)纳米片。
58.4.制备mos2@pda@psbma(mpp)纳米片
59.将步骤3制备的mos2@pda纳米片和步骤2制备的psbma-b-pnhsma 嵌段共聚物溶解于pbs缓冲液(0.1m，ph＝8.0)中，mos2@pda纳米片和 psbma-b-pnhsma嵌段共聚物溶解后的浓度均为1mg/ml；于40℃反应24 小时后，离心后用去离子水洗涤3次，真空干燥得到mos2@pda@psbma(mpp) 纳米片。
60.实施例4 mos2@pda@psbma(mpp)纳米片催化过氧化氢(h2o2)产生氧气试验
61.采用生理盐水，将h2o2溶液稀释至1.0mmol/l。将实施例1制备的 mos2@pda@psbma(mpp)纳米片及其对照材料mos2(m)纳米片、 mos2@pda(mp)纳米片分散于生理盐水中，起浓度为200μg/ml。将其与h2o2溶液等体积混合，置于37℃恒温孵箱中进行培育2小时。将孵育后的溶液取出，通过拍照记录产生的氧气气泡。实验结果如图4所示，mpp纳米片共孵育的溶液产生了更多的氧气气泡。
62.实施例5 mos2@pda@psbma(mpp)纳米片对羟基自由基(
·
oh)的清除试验
63.将实施例1制备的不同浓度的mos2@pda@psbma(mpp)纳米片及其对照材料mos2(m)纳米片、mos2@pda(mp)纳米片分散于200μm h2o2溶液中，按照等体积添加浓度为1.0mm的对苯二甲酸溶液，避光放置于37℃恒温水浴中孵育12小时后，进行荧光光谱扫描。激发波长设置为312nm，发射波长的扫描范围设置为350-600mn。试验结果如附图5所示，相较于m和mp纳米片，mpp纳米片具有更好的
·
oh清除效果，在100μg/ml浓度下，其清除效率可以达到93.42％。
64.实施例6 mos2@pda@psbma(mpp)纳米片对细胞内羟基自由基清除性能检测试验
65.按照50000细胞/孔的密度将raw 264.7细胞接种在24孔板中。待细胞完全贴壁后，用含有脂多糖(lps，1μg/ml)的培养基刺激细胞12小时，然后继续用含有实施例1制备的mos2@pda@psbma(mpp)纳米片及其对照材料mos
2 (m)纳米片、mos2@pda(mp)纳米片的培养基继续培养24小时。最后，用 dcfh-da荧光探针标记并采用荧光显微镜观察细胞内羟基自由基表达情况。试验结果如附图6所示，在lps诱导下，细胞内产生的羟基自由基明显增加，当培养基中加入纳米片后，细胞内表达的羟基自由基被清除，其中mpp纳米片的清除效果最好。
66.实施例7 mos2@pda@psbma(mpp)纳米片对细胞内超氧阴离子清除性能检测试验
67.本实施例基本内容与实施例6一致，其不同之处在于，采用dhe荧光探针标记细胞并观察细胞内超氧阴离子的表达。
68.实验结果如附图6所示，在lps诱导下，细胞内产生的超氧阴离子明显增加， mos2纳米片不具备超氧阴离子清除性能，mp和mpp都可以清除细胞内表达的羟基自由基，其中mpp纳米片的清除效果最好。
69.实施例8 mos2@pda@psbma(mpp)纳米片的细胞相容性
70.本实施例中选用的细胞为大鼠软骨细胞。首先，将大鼠软骨细胞培养至对数生长期，培养基为含有10％fbs和1％双抗的dmem/f12培养基。其次，将软骨细胞接种于96孔板中，接种密度为5000细胞/孔。待细胞完全贴壁后，将细胞培养基更换为含有不同浓度mpp纳米片的培养基(mpp纳米片由实施例1制备得到)，培养1天后往每个孔中加入cck-8试剂，继续培育3小时后，采用酶标仪测试450nm处的吸光度。实验结果如附图7所示，低浓度mpp纳米片共培养下，细胞存活率超过80％，体现良好的细胞相容性。
71.实施例9 mos2@pda@psbma(mpp)纳米片的润滑性能检测试验
72.本实施例中选用的基材是牛软骨截取的片材，测试频率分别是1hz，3hz 和5hz，测试时间是10min；压力分别设置为1n，2n和5n。比较不同纳米片溶液的润滑性能。实验结果如附图8所示，mpp相较于mos2和mp纳米片，具有更好的润滑性能，其摩擦系数可以低至0.05。
73.实施例10 mos2@pda@psbma(mpp)纳米片的光热转化试验
74.将实施例1制备的mos2@pda@psbma(mpp)纳米片配置成0.1mg/ml 的纳米片溶液，然后808激光器设置不同功率的激光(0.2，0.5和1.0w
·
cm-2
)照射溶液，利用红外热成像仪记录温度变化。试验结果如附图9所示，mpp具有光热转性能，在1w/cm2激光功率下，可以升温至40℃，这一温度利于关节炎治疗。
75.综上，实施例4-实施例10的试验数据充分说明，本发明制备的 mos2@pda@psbma纳米片能够清除炎症环境中过表达的活性氧，抗氧化能力强，具有良好的细胞相容性的，优异
的润滑性能和光热转性能，可以有效保护关节软骨，适用于关节炎的治疗。
76.本发明的说明书和附图被认为是说明性的而非限制性的，在本发明基础上，本领域技术人员根据所公开的技术内容，不需要创造性的劳动就可以对其中一些技术特征做出一些替换和变形，均在本发明的保护范围内。