QSP-PBPK-TD模型构建方法及药源性心功能损伤预测方法

qsp-pbpk-td模型构建方法及药源性心功能损伤预测方法
技术领域
1.本发明涉及药物代谢动力技术领域，尤其涉及一种qsp-pbpk-td模型构建 方法及药源性心功能损伤预测方法。


背景技术：

2.药源性心功能损伤在很大程度上阻碍了抗肿瘤药物的研发与临床应用，同时 也降低了患者的生存质量。药源性心功能损伤临床上通常表现为心肌细胞收缩功 能障碍导致的左心室射血分数(lvef)下降，出现左心室收缩功能障碍，甚至 发展为心力衰竭。为了减少或避免药源性心功能损伤的发生，开发基于临床前心 肌损伤结果评估抗肿瘤药物临床心功能风险预测的方法，对调整给药方案以降低 药物心肌损伤风险具有重要意义。
3.近年来，一种新的临床前研究评估方法已被开发用于精准评估药源性心肌损 伤。通过编码、重编程并定向分化得到的人诱导多能干细胞分化心肌细胞 (hipsc-cms)保留了心肌细胞特有的收缩功能，避免了种属差异和伦理限制， 已被广泛地用于疾病模型构建、心肌毒性药物筛选以及替代治疗。然而，尽管在 临床前测试中，hipsc-cms作为理想的体外研究工具，较好地模拟了药物引起 的心肌细胞形态、结构和功能上的变化，并描述了药物-心肌细胞之间的相互作 用，但是依旧无法准确地预测出药源性心功能损伤风险的发生率。在一项基于 hipsc-cms评价21种酪氨酸激酶抑制剂的心脏毒性试验中，基于体外毒性评价 指标得到的评价参数“心脏安全指数(csi)”无法较好地预测临床报道的21种 酪氨酸激酶抑制剂致心功能障碍的风险。这是因为除了药物-心肌细胞相互作用 外，药物引起的心脏毒性至少还受到以下2个关键因素的影响：心脏中时间依赖 性的药物暴露以及机体对心肌损伤的代偿作用。因此，体外毒性实验仅能反映药 物-心肌细胞之间的作用，而缺少对药物暴露和机体代偿的评价方法。
4.数学建模方法可以根据患者的代谢特点动态地模拟体内药物浓度变化，也可 以基于神经-体液系统对心肌损伤的调控机制预测心脏泵血功能在生理病理条件 下的改变，此外，基于群体统计学的建模还可以通过个体间变异预测药物在人群 中的毒性作用。近年来，陆续有文献报道利用数学模型来模拟体内药物代谢过程 和机体的调控作用，并进一步建立种属间转化方法，对影响药物心脏毒性的因素 进行了一定程度的模拟分析：(1)基于小鼠、大鼠在心脏毒性药物给药后血浆药 物浓度及药物组织分布的变化，建立生理药动学模型(pbpk)，通过输入人的生 理参数进行种属间转化，建立人的pbpk模型，预测心脏毒性药物在人血浆和心 脏组织的暴露量；(2)基于心脏的泵血机制建立定量系统药理学(qsp)模型， 其中关键参数通过大鼠实验获得，继而用异速放大法将模型中的关键参数根据体 重外推，建立人的qsp模型，描述患者在心脏毒性药物给药后心脏泵血功能的 改变。
5.目前药动模型无法整合体外药效实验信息、药物的体内药动学行为和患者的 心血管状态，进而基于体外实验准确地预测体内药源性心功能损伤风险。


技术实现要素：

6.发明目的：本发明的目的是提供一种动态的、系统的、定量描述影响患者的 药物暴露情况、心血管系统对心肌损伤的调节作用和心肌细胞敏感性的 qsp-pbpk-td模型的构建方法；本发明的另一目的是提供一种利用上述 qsp-pbpk-td模型预测药源性心功能损伤方法。
7.技术方案：本发明的一种qsp-pbpk-td模型构建方法，首先，根据药物诱 导的心肌损伤发生机制建立了体外td机制模型，并基于hipsc-cms的实验结 果对模型关键参数进行估算；接着，建立体外-体内转化方法，将体外td机制 模型与文献中已报道的体内pbpk模型与qsp模型桥接，模拟药物对心脏泵血 功能的影响；具体的，包括以下步骤：
8.(1)建立若干个体外td机制模型，从中筛选出适用于所有致心肌细胞数 量改变和/或收缩功能损伤的心功能损伤药物的最优的体外td机制模型，作为 待测药物的pk/td机制模型，其用于定量描述抗肿瘤药对hipsc-cms的心肌损 伤作用；
9.(2)基于机体的药物暴露和心血管基础状态建立qsp-pbpk模型，用于定 量描述机体对心脏损伤的系统调控作用；
10.(3)将最优的体外td机制模型与qsp-pbpk模型桥接，得到qsp-pbpk-td 模型。
11.进一步地，步骤(1)中，最优体外td机制模型的筛选方法为：根据基于 hipsc-cms的体外心肌毒性实验，将获取的毒性指标数据变化应用若干个体外 td机制模型进行模型适用性评估和相关参数的计算，计算结果与实测结果相比 较，筛选出最优的体外td机制模型。
12.进一步地，步骤(1)中，若干个体外td机制模型包括一个完整模型和若 干个简化模型，简化模型为在完整模型的基础上省略部分机制；完整模型为包括 以下三种机制的模型ⅰ：(1)药物引起细胞坏死或凋亡所致心肌细胞数量改变、(2)药物引起心肌细胞能量代谢异常所致收缩功能快速可逆性损伤、(3)药物 引起心肌细胞结构或功能性损伤所致缓慢或不可逆性收缩功能损伤。
13.更进一步地，简化模型包括以下模型
ⅱ‑ⅶ
中任意两个或两个以上：模型
ⅱꢀ
适用于通过引起细胞坏死或凋亡单一机制损伤心肌收缩力的药物；模型ⅲ适用于 通过心肌细胞结构或功能性损伤单一机制损伤心肌收缩力的药物；模型ⅳ适用于 通过心肌细胞能量代谢异常单一机制损伤心肌收缩力的药物；模型
ⅴ
适用于通过 引起细胞坏死或凋亡和心肌细胞结构或功能性损伤两种机制降低心肌收缩力而 不影响能量代谢的药物；模型ⅵ适用于通过引起细胞坏死或凋亡和心肌细胞能量 代谢异常两种机制损伤心肌收缩力而不引起心肌细胞结构或功能性损伤的药物； 模型ⅶ适用于通过引起心肌细胞结构或功能性损伤和能量代谢异常两种机制损 伤心肌收缩力而不引起细胞坏死或凋亡的药物。
14.进一步地，步骤(1)中，体外td机制模型中的参数通过monolix软件拟 合得到。
15.进一步地，步骤(3)中，pk/td机制模型与qsp-pbpk模型桥接的方法为： (1)基于pbpk模型预测给药后血浆药物浓度经时变化过程，以心脏组织间液 药物浓度c
heart_i
代替最优的pk/td机制模型中的药物暴露量c
ex
，用于驱动体外 心肌损伤的产生；(2)基于pk/td机制模型预测给药后心肌细胞收缩力损伤程 度，以总收缩力contraction代替qsp模型中的e
mc_sv
，实现体外收缩力变化到 体内心功能损伤的转化；(3)pk/td机制模型取代qsp模型中经验性的e
max
模 型。以药物对心肌细胞的毒性有效浓度为衔接点，在模型中纳入包括药
物在体内 的组织分布和药物在心脏的空间分布、培养基和血浆蛋白结合差异因素的影响。
16.另一方面，本发明提供一种利用上述qsp-pbpk-td模型构建方法构建的模 型预测药源性心功能损伤方法，根据体外hipsc-cms实验结果预测药物体内心 脏毒性的方法。然后，基于虚拟临床试验预测心脏毒性药物给药后在不同人群中 的心血管事件发生率。具体的，包括以下步骤：
17.(1)构建包括若干个虚拟患者数据的虚拟患者群，虚拟患者数据包括生理 值、药物的系统清除率、基础心血管状态、药物敏感性；
18.(2)根据虚拟患者的药物暴露水平、心血管基础状态和药物敏感性对虚拟 患者群进行分类；
19.(3)在qsp-pbpk-td模型中输入虚拟患者数据，获得虚拟患者的心脏状 态评价，根据虚拟患者的心脏状态评价与其在步骤(2)中对应的分类，预测药 物在不同亚群中心功能损伤风险的发生率。
20.进一步地，步骤(1)中，通过蒙特卡洛模拟方法构建虚拟患者群。在 qsp-pbpk-td模型中，输入变量包括患者的基本身体指标(身高、体重等)、 多柔比星的系统清除率、基础心血管状态(心率、血压等)以及药物敏感性(基 于体外细胞实验得到的参数k
death
与ec
50_mmp
)。对于上述变量，典型值和变异 区间根据模型优化的参数结果和人群中生理参数的变异情况(通常为
±
30％)确 定。在每一次模拟的过程中，以这些典型值为中心，变异区间为范围，抽取出一 套参数，将这套参数作为一位虚拟患者的生理值，即完成一次蒙特卡洛模拟。将 上述随机抽取过程重复1000次，就产生1000位虚拟患者。
21.进一步地，步骤(2)中，根据药物暴露水平将虚拟患者群划分为高暴露人 群、中等暴露人群和低暴露人群。根据患者的药物暴露水平、心血管基础状态和 心肌细胞敏感性对人群进行划分。根据药物暴露水平将人群划分为高暴露人群 (cl＝60％clpop)、中等暴露人群(cl＝100％clpop)和低暴露人群 (cl＝400％clpop)。根据心血管基础状态将人群划分为心血管健康人群及心血 管疾病人群。
22.进一步地，步骤(2)中，根据心血管基础状态将人群划分为心血管健康人 群及心血管疾病人群。考虑两类常见的心血管疾病：扩张型心肌病被定义为 lvedv对体表面积的指数≥81.5ml/m2；高血压定义为平均动脉压≥115mmhg(收 缩压≥140mmhg，舒张压≥90mmhg)。
23.进一步地，步骤(2)中，根据患者心肌细胞敏感性将虚拟患者群划分为敏 感人群、正常人群和耐受人群。根据患者心肌细胞敏感性将人群划分为敏感 (k
death
＝3.72
×
10-5
h-1
·
μg-1
·
ml，cv＝33.1％；ec
50_mmp
＝244μg/ml，cv＝29.2％)、 正常(k
death
＝2.43
×
10-6
h-1
·
μg-1
·
ml，cv＝9.8％；ec
50_mmp
＝1620μg/ml，cv＝8.51％) 和耐受(k
death
＝1.93
×
10-6
h-1
·
μg-1
·
ml，cv＝18.9％；ec
50_mmp
＝3876μg/ml， cv＝25.9％)人群。
24.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：定量描述影响患者 的药物暴露情况、心血管系统对心肌损伤的调节作用和心肌细胞敏感性，实现基 于体外实验到药物体内心功能损伤风险的转化，并将其应用于具有明确或潜在心 脏毒性的药物，可用于临床前致心功能损伤药物的筛选。
附图说明
25.图1为实施例1中基于心肌细胞损伤发生机制的体外td模型；a：td机 制模型，b：以多柔比星为例构建的pk/td机制模型；f
nor
是正常心肌细胞的比 例，f
inj
是受损心肌细胞的比例，f
dead
是死亡心肌细胞的比例，k
inj
是正常细胞向 受损细胞的转化率常数，k
rec
是受损细胞向正常细胞的恢复速率常数，k
dead
是受 损细胞向死亡细胞的转化率常数，k
in
和k
out
是指mmp、atp和aac的产生和 消除速率常数，e
inj_aac
是指非atp依赖的结构或功能性损伤(如肌节紊乱、细 胞形态改变等)对收缩力的影响，mmp是指线粒体膜电位，aac是表观收缩力， ec
50_mmp
是指对抑制mmp产生最大效应一半时细胞内药物浓度；ka和kb是药物 流入和流出细胞的速率常数，c
ex
和c
in
是培养基和细胞内药物浓度；
26.图2为实施例1中多柔比星不同暴露浓度和暴露时间下，基于td机制模型 预测的hipsc-cms相关毒性指标随时间变化拟合图；a：细胞存活率，b：细胞 收缩里，c：线粒体膜电位，d：atp；红线：模型预测值；蓝点：观察值；
27.图3为实施例1中qsp-pbpk-td模型在多柔比星致心功能损伤风险的预测 和lvef下降值与临床报道对比图；a:基于模型预测和临床报道的多柔比星给 药后患者心功能损伤发生率随累积给药量增加的折线图，b：不同敏感性患者在 240mg/m2(40mg/m2，每3周一次，6次)多柔比星给药后1年时的lvef变化 情况，c：300mg/m2(50mg/m2，每3周一次，6次)累计给药下不同输注时长 患者一年后lvef变化情况；
28.图4.为实施例1中基于建立的qsp-pbpk-pd模型的多柔比星致心功能损 伤的敏感性分析；a：心血管健康或疾病患者在多柔比星临床推荐剂量450mg/m
2 (50mg/m2，每3周一次，治疗9次)给药方案下，患者一年后lvef变化情况， b：基于虚拟临床试验预测药物的在不同亚群中的心功能损伤风险发生率的预测；
29.图5为实施例2中基于模型筛选心脏毒性阳性药物的roc曲线；a：初始 模型，b：纳入游离分数因素模型，c：纳入组织分布因素模型，d：纳入空间分 布因素模型；e：四种模型的的比较；
30.图6为实施例2中基于simcyp软件及药物理化性质模拟预测的心脏组织分 布系数k
p_prediction
与实验动物心脏k
p_observation
的比较；
31.图7为实施例2中基于优化后的模型模拟虚拟临床试验中药物的在不同亚群 中的心功能损伤风险发生率与临床报道的心功能损伤风险发生率的比较。
具体实施方式
32.下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
33.在一实施例中，其提供一种qsp-pbpk-td模型构建方法，首先，根据药物 诱导的心肌损伤发生机制建立了体外td机制模型，并基于hipsc-cms的实验 结果对模型关键参数进行估算；接着，建立体外-体内转化方法，将体外td机 制模型与文献中已报道的体内pbpk模型与qsp模型桥接，模拟药物对心脏泵 血功能的影响；具体的，包括以下步骤：
34.(1)建立若干个体外td机制模型，从中筛选出适用于所有致心肌细胞数 量改变和/或收缩功能损伤的心功能损伤药物的最优的体外td机制模型，作为 待测药物的pk/td机制模型，其用于定量描述抗肿瘤药对hipsc-cms的心肌损 伤作用；
35.最优体外td机制模型的筛选方法为：根据基于hipsc-cms的体外心肌毒 性实验，
将获取的毒性指标数据变化应用7个体外td机制模型进行模型适用性 评估和相关参数的计算，计算结果与实测结果相比较，筛选出最优的体外td机 制模型。
36.如图1a所示，基于心肌细胞损伤发生机制的体外td模型的7个模型包括 一个完整模型和6个简化模型，简化模型为在完整模型的基础上省略部分机制； 完整模型为包括以下三种机制的模型ⅰ：(1)药物引起细胞坏死或凋亡所致心肌 细胞数量改变、(2)药物引起心肌细胞能量代谢异常所致收缩功能快速可逆性损 伤、(3)药物引起心肌细胞结构或功能性损伤所致缓慢或不可逆性收缩功能损伤。
37.简化模型包括以下模型
ⅱ‑ⅶ
中任意两个或两个以上：模型ⅱ适用于通过引 起细胞坏死或凋亡单一机制损伤心肌收缩力的药物；模型ⅲ适用于通过心肌细胞 结构或功能性损伤单一机制损伤心肌收缩力的药物；模型ⅳ适用于通过心肌细胞 能量代谢异常单一机制损伤心肌收缩力的药物；模型
ⅴ
适用于通过引起细胞坏死 或凋亡和心肌细胞结构或功能性损伤两种机制降低心肌收缩力而不影响能量代 谢的药物；模型ⅵ适用于通过引起细胞坏死或凋亡和心肌细胞能量代谢异常两种 机制损伤心肌收缩力而不引起心肌细胞结构或功能性损伤的药物；模型ⅶ适用于 通过引起心肌细胞结构或功能性损伤和能量代谢异常两种机制损伤心肌收缩力 而不引起细胞坏死或凋亡的药物。
38.其中，体外td机制模型中的参数通过monolix软件拟合得到。
39.(2)基于机体的药物暴露和心血管基础状态建立qsp-pbpk模型，用于定 量描述机体对心脏损伤的系统调控作用；
40.(3)将最优的体外td机制模型与qsp-pbpk模型桥接，得到qsp-pbpk-td 模型。
41.具体的，pk/td机制模型与qsp-pbpk模型桥接的方法为：1)基于pbpk 模型预测给药后血浆药物浓度经时变化过程，以心脏组织间液药物浓度 c_(heart_i)代替最优的pk/td机制模型中的药物暴露量c_ex，用于驱动体外心 肌损伤的产生；2)基于pk/td机制模型预测给药后心肌细胞收缩力损伤程度， 以总收缩力contraction代替qsp模型中的e_(mc_sv)，实现体外收缩力变化 到体内心功能损伤的转化；3)pk/td机制模型取代qsp模型中经验性的emax 模型。以药物对心肌细胞的毒性有效浓度为衔接点，在模型中纳入包括药物在体 内的组织分布和药物在心脏的空间分布、培养基和血浆蛋白结合差异因素的影响。
42.在一实施例中，其提供一种利用上述qsp-pbpk-td模型构建方法构建的模 型预测药源性心功能损伤方法，根据体外hipsc-cms实验结果预测药物体内心 脏毒性的方法。然后，基于虚拟临床试验预测心脏毒性药物给药后在不同人群中 的心血管事件发生率。具体的，包括以下步骤：
43.(1)构建包括若干个虚拟患者数据的虚拟患者群，虚拟患者数据包括生理 值、药物的系统清除率、基础心血管状态、药物敏感性；
44.通过蒙特卡洛模拟方法构建虚拟患者群。在qsp-pbpk-td模型中，输入变 量包括患者的基本身体指标(身高、体重等)、多柔比星的系统清除率、基础心 血管状态(心率、血压等)以及药物敏感性(基于体外细胞实验得到的参数k_death 与ec_(50_mmp))。对于上述变量，典型值和变异区间根据模型优化的参数结果 和人群中生理参数的变异情况(通常为
±
30％)确定。在每一次模拟的过程中， 以这些典型值为中心，变异区间为范围，抽取出一套参数，将这套参数作为一位 虚拟患者的生理值，就完成一次蒙特卡洛模拟。将上述随机抽取过程重复1000 次，就产生1000位虚拟患者。
45.(2)根据虚拟患者的药物暴露水平、心血管基础状态和药物敏感性对虚拟 患者群进行分类；
46.根据药物暴露水平将虚拟患者群划分为高暴露人群、中等暴露人群和低暴露 人群。根据患者的药物暴露水平、心血管基础状态和心肌细胞敏感性对人群进行 划分。根据药物暴露水平将人群划分为高暴露人群(cl＝60％clpop)、中等暴露 人群(cl＝100％clpop)和低暴露人群(cl＝400％clpop)。根据心血管基础状 态将人群划分为心血管健康人群及心血管疾病人群。
47.根据心血管基础状态将人群划分为心血管健康人群及心血管疾病人群。考虑 两类常见的心血管疾病：
48.扩张型心肌病被定义为lvedv对体表面积的指数≥81.5ml/m2；高血压定义 为平均动脉压≥115mmhg(收缩压≥140mmhg，舒张压≥90mmhg)。
49.根据患者心肌细胞敏感性将虚拟患者群划分为敏感人群、正常人群和耐受人 群。根据患者心肌细胞敏感性将人群划分为敏感(k
death
＝3.72
×
10-5
h-1
·
μg-1
·
ml，cv＝33.1％；ec
50_mmp
＝244μg/ml，cv＝29.2％)、正常(k
death
＝2.43
×
10-6
h-1
·
μg-1
·
ml， cv＝9.8％；ec
50_mmp
＝1620μg/ml，cv＝8.51％)和耐受(k
death
＝1.93
×
10-6 h-1
·
μg-1
·
ml，cv＝18.9％；ec
50_mmp
＝3876μg/ml，cv＝25.9％)人群。
50.(3)在qsp-pbpk-td模型中输入虚拟患者数据，获得虚拟患者的心脏状 态评价，根据虚拟患者的心脏状态评价与其在步骤(2)中对应的分类，预测药 物在不同亚群中心功能损伤风险的发生率。
51.上述qsp-pbpk-td模型和预测药源性心功能损伤方法可应用于不同抗肿 瘤药物，如蒽环类药物多柔比星、不同种类的酪氨酸激酶抑制剂等。
52.实施例1：以多柔比星的心脏毒性预测为例
53.药品与试剂
54.常用试剂：盐酸多柔比星注射液(阿拉丁，中国)；atp试剂盒(s0026， 碧云天，中国)；mmp试剂盒(c2006，碧云天，中国)；bca试剂盒(b8012040， 翌圣生物科技(上海)股份有限公司，中国)。
55.细胞培养：hipsc-cms(novocell
tm-cardiomyocyte,南京艾尔普再生医学 科技有限公司，中国)于t25培养瓶中37℃，5％co2条件下进行常规培养。培 养基为含10％胎牛血清(gibco，美国)的rpmi1640培养基(gibco，美国)。 培养所需的细胞培养耗材购于corning(corning，美国)，hipsc-cms培养所需 的铺板液购自南京艾尔普再生医学科技有限公司(help，中国)。
56.1、基于hipsc-cms探究多柔比星暴露浓度与暴露时长对细胞数量、收缩力 及能量代谢的影响
57.将hipsc-cms细胞以1
×
105/cm2密度接种于24孔板中，分别暴露于含0、 1.25、2.5、5、10、20μm多柔比星的培养基中，并于开始培养6、12、24、48、 72h后更换为不含药的培养基。在不同时刻用cytation
tm
5(bio tek，usa)对 部分孔板内的细胞录制视频并拍照，分别用于分析细胞收缩力和细胞数量；另一 部分孔板内的细胞按试剂盒说明书操作检测每孔中atp、mmp水平。外毒性测 定结果显示心肌细胞存活率、收缩力、线粒体膜电位以及细胞内atp含量随着 多柔比星给药浓度增加均显著下降。暴露时长也显著影响了上述指标，但作
用强 度较药物暴露浓度弱。
58.2、建立心肌细胞损伤的td机制模型定量描述药物诱导的心肌损伤的时程 变化
59.(1)模型假设
60.本研究将抗肿瘤药物所致心肌毒性的机制概括为以下三个方面：药物引起细 胞坏死或凋亡所致心肌细胞数量改变、药物引起心肌细胞能量代谢异常所致收缩 功能快速可逆性损伤、心肌细胞结构或功能性损伤所致缓慢/不可逆性收缩功能 损伤。在研究中，我们将心肌细胞分为三个群体：正常细胞、受损细胞和死亡细 胞。正常心肌细胞收缩力正常，设为1；受损心肌细胞收缩能力受到损伤，收缩 力在0～1之间；而死亡心肌细胞收缩力为0。在体外研究中，我们假设心肌细 胞群表现出的收缩力由心肌细胞数量和心肌细胞表观收缩力共同决定，药物产生 的心肌细胞损伤可能是通过减少心肌细胞数量或降低心肌细胞收缩力而产生。由 于受损心肌细胞数量以及受损程度难以测定，我们将正常细胞和受损细胞表现出 的收缩力共同用表观收缩力这一参数进行描述，心肌收缩力则为心肌细胞数量百 分比与心肌细胞表观收缩力的乘积。其中，药物诱导心肌细胞凋亡或坏死而导致 的心肌细胞数量减少可通过直接测定心肌细胞数量百分比变化进行描述。
61.(2)模型结构与常微分表达式
62.以多柔比星为工具药，研究不同暴露浓度与暴露时长对心肌细胞收缩力的变 化情况。整个pk/td模型包括了三个部分：心肌细胞药物暴露、细胞存活率以 及心肌细胞收缩力(图1)。
63.表1 pk/td模型参数列表
64.[0065][0066]
1)心肌细胞药物暴露：基于soininen等人研究开发了一个简化的两室模型，估算了培养基和细胞内多柔比星交换的参数，相关公式如下所示。
[0067]
在hipsc-cms细胞实验中，含有多柔比星的培养基在达到暴露时长后，被更换为不含药的培养基。为了描述心肌细胞接触到的真实药物浓度，这一洗脱过程用公式1.3-1.4描述：
[0068][0069]aex
＝p
×
dose(1.2)
[0070]
其中，t
ex
为暴露时长，dose为暴露浓度，a
ex
为培养基中的药量。
[0071][0072][0073]
其中a
ex
和a
in
是培养基和细胞内多柔比星的量，ka和kb是流入和流出细胞的速率常数，c
ex
和c
in
是培养基和细胞内药物浓度，v
ex
和v
cell
是培养基和细胞内体积。
[0074]
2)细胞存活率：描述了正常、受损和死亡细胞的变化，将正常和受损细胞都视为存活细胞，相关公式如下所示(方程式1.5—1.8)。
[0075][0076][0077][0078][0079]
其中f
nor
是正常心肌细胞的比例，f
inj
是受损心肌细胞的比例，f
dead
是死亡心肌细胞的比例。k
inj
是正常细胞向受损细胞的转化率常数，k
rec
是受损细胞向正常细胞的恢复速率常数，k
dead
是受损细胞向死亡细胞的转化率常数。survivalfraction是存活细胞占总细胞的比例。
[0080]
3)心肌细胞收缩力：细胞能量主要由线粒体产生，而mmp反映了线粒体功能，多柔
比星诱导的mmp下降被认为是能量代谢相关损伤的作用靶点。细胞内atp产生被认为与mmp的剩余部分成比例。表观收缩力与atp的剩余部分成正比。相关公式如下所示。
[0081][0082][0083][0084]
contraction＝(f
nor
f
inj
)
·
aac(1.12)
[0085]
其中k
in
和k
out
是指mmp、atp和aac的产生和消除速率常数。mmp是指线粒体膜电位；aac是表观收缩力；ec
50_mmp
是指对抑制mmp产生最大效应一半时细胞内药物浓度。e
inj_aac
是指非atp依赖的结构或功能性损伤(如肌节紊乱、细胞形态改变等)对收缩力的影响，对于多柔比星而言，此参数值估为0。mmp0和atp0代表药物暴露前的mmp和atp水平，归一化后值为1。
[0086]
本研究建立的多柔比星诱发心肌损伤的pk/td机制模型中参数通过monolix软件拟合得到，优化后的参数值见表2。结果如图2所示，基于pk/td机制模型预测的细胞数量、收缩力、线粒体膜电位以及atp随时间的变化趋势与实测值趋势一致，且拟合曲线与实测点接近。
[0087]
表2实施例1中pk/td模型参数优化值
[0088]
[0089][0090]
3、体外td机制模型与pbpk模型和qsp模型的桥接与验证
[0091]
(1)建立td模型的体外-体内转化方法
[0092]
本研究建立了一种基于机制的药源性心肌细胞损伤体外td模型。文献中报道了描述多柔比星系统、组织、细胞多维度暴露水平的pbpk模型和描述心血管系统对心肌损伤调节作用的qsp模型。将体外td机制模型与文献中报道的体内qsp、pbpk模型进行桥接，即完成了pd模型的体外-体内转化。
[0093]
将基于pbpk模型预测的心脏间质液中药物的浓度作为培养基中药物的输入，链接pbpk与pk/td模型，实现药物剂量-暴露-效应的转化。为更精确地描述心肌细胞-药物之间的相互作用，将第二章所构建的基于hipsc-cms建立的体外td机制模型取代qsp模型中经验性的e
max
模型，将td模型中的收缩力替代e
ep_sv
。
[0094]
在2d细胞培养中，单层心肌细胞能够均匀接触介质中的药物，而体内心肌细胞在心脏的3d结构下对心脏间质中药物的接触存在异质性。为了描述体外和体内条件下药物可及性的差异，引入r
access
来描述心肌细胞从心脏介质或间质液中的平均药物可及性。对于2d细胞培养，r
access
设置为1，在体内该参数通过手动调整以实现转化。细胞外药物浓度定义为心脏间质药物浓度和r
access
的乘积，用于驱动td模型中药物诱导心肌损伤的产生，公式如下所示。
[0095]cex
＝c
heart
·raccess
(1.13)
[0096]
(2)qsp-pbpk-td模型及体外-体内转化方法的验证
[0097]
基于上述转化和桥接方法建立了人的多柔比星qsp-pbpk-td模型，该模型可以预测多柔比星给药后心血管系统泵血功能的变化，并以临床上药物诱导心脏毒性发生的“金标准”左心室射血分数(lvef)和人群中的心血管事件发生率作为评价指标。将模型的预测结果与文献报道的实测结果比较，可以对模型进行验证。如图3a所示，qsp-pbpk-td模型预测的心血管系统健康和疾病人群在多柔比星给药后的心血管事件发生率与临床实验结果一致，说明模型具有良好的预测力。为了进一步验证r
access
的可行性，我们应用模型对不同患者以及不同输注时长下患者lvef下降的情况进行了预测。图3b描述了不同敏感性患者在240mg/m2累积给药下，1年后患者的lvef下降情况。模型预测结果显示敏感人群在上述给药方案下lvef下降了初始的30％，与报道的35％相似；对于非敏感人群而言，模型预测患者的lvef下降量与临床报道一致。如图3c所示，该qsp-pbpk-td模型能够较好地重现出
多柔比星诱导的心功能损伤可以通过改变 输注时长而降低的现象。因此，通过模型预测与临床报道的患者lvef下降以及 心功能损伤的发生率，结果显示所构建的qsp-pbpk-td模型对于多柔比星诱导 的心功能损伤具备较好的临床预测能力。
[0098]
(3)基于qsp-pbpk-td模型预测不同亚群应用多柔比星后心功能损伤风 险的发生率
[0099]
1)药物暴露量、心血管系统基础状态与心肌细胞敏感性对多柔比星心脏毒 性的影响
[0100]
为了考察不同因素对药物心脏毒性的影响，本研究对模型中的关键参数进行 了敏感性分析。在敏感性分析中，用药物的清除率(cl)的变化描述暴露对于 lvef的影响、用ec
50_mmp
和k
dead
的变化描述心肌细胞敏感性对lvef的影响、 用lvedv表征患者心血管基础状态差异以描述疾病对lvef的影响。cl、 ec
50_mmp
和k
dead
的值在100倍范围内变化，心血管健康患者的左心室舒张末期 容积设定为100ml，心血管疾病患者的左心室舒张末期容积设定为113ml。模 拟临床推荐给药方案：50mg/m2，每3周给药一次，总频次为9次，累积给药剂 量为450mg/m2，治疗1年多柔比星后患者的lvef变化情况，以评估这些影响 方面相关参数的敏感性。
[0101]
模型参数敏感性分析结果显示(图4a)：心肌细胞敏感性》药物暴露》疾病 基础状态。这提示对于多柔比星而言，除了考虑患者的体内药物暴露高低外，心 肌-药物敏感性对于患者lvef的影响更加重要，同时为了进行更为精准的临床 用药，患者的心血管基础状态也应成为用药的考虑因素。
[0102]
(2)基于虚拟患者临床试验预测不同亚群中多柔比星致心功能损伤风险的 发生率
[0103]
基于本研究建立的qsp-pbpk-td模型可以在药物研发阶段基于动物实验 和体外细胞实验预测临床心脏毒性。本研究基于蒙特卡洛模拟的方法进行了虚拟 患者临床试验，以虚拟人群中心功能损伤风险的发生率作为心脏毒性大小的评判 标准。在qsp-pbpk-td模型中，输入变量包括患者的基本身体指标(身高、体 重等)、多柔比星的系统清除率、基础心血管状态(心率、血压等)以及药物敏 感性(基于体外细胞实验得到的参数k
death
与ec
50_mmp
)。对于上述变量，典型 值和变异区间根据模型优化的参数结果和人群中生理参数的变异情况(通常为
ꢀ±
30％)确定。在每一次模拟的过程中，以这些典型值为中心，变异区间为范围， 抽取出一套参数，将这套参数作为一位虚拟患者的生理值，就完成了一次蒙特卡 洛模拟。将上述随机抽取过程重复1000次，就产生了1000位虚拟患者。将这些 患者的身体指标和基础心血管作为初值输入qsp-pk-pd模型，经过运算可以得 到每位患者给药之后的心脏状态。根据虚拟患者的心脏初始状态可以将他们分类 为心血管正常患者和患有心血管疾病的患者，并依据他们给药后的心脏状态评价 给药后是否出现了心脏毒性。最后，我们就可以算出在某个给药剂量下，心血管 正常患者和患有心血管疾病的患者使用多柔比星后的心血管事件发生率。
[0104]
本研究中，为了计算0～1000mg/m2多柔比星给药剂量下的心血管事件发生 率，每一给药剂量组均纳入了1000位虚拟患者。临床实践中，多柔比星诱导的 心脏毒性被定义为：lvef降低超过基础值的10％或lvef低于正常值下限(通 常正常值下限设为50％)。为了考察多柔比星在不同亚群中的心脏毒性，本研究 根据患者的药物暴露水平、心血管基础状
态和心肌细胞敏感性对人群进行了划分。 根据药物暴露水平将人群划分为高暴露人群(cl＝60％clpop)、中等暴露人群 (cl＝100％clpop)和低暴露人群(cl＝400％clpop)。根据心血管基础状态将 人群划分为心血管健康人群及心血管疾病人群。本研究考虑了两类常见的心血管 疾病：扩张型心肌病被定义为lvedv对体表面积的指数≥81.5ml/m2；高血压定 义为平均动脉压≥115mmhg(收缩压≥140mmhg，舒张压≥90mmhg)。根据患 者心肌细胞敏感性将人群划分为敏感(k
death
＝3.72
×
10-5
h-1
·
μg-1
·
ml，cv＝33.1％； ec
50_mmp
＝244μg/ml，cv＝29.2％)、正常(k
death
＝2.43
×
10-6
h-1
·
μg-1
·
ml，cv＝9.8％； ec
50_mmp
＝1620μg/ml，cv＝8.51％)和耐受(k
death
＝1.93
×
10-6
h-1
·
μg-1
·
ml， cv＝18.9％；ec
50_mmp
＝3876μg/ml，cv＝25.9％)人群，k
death
、ec
50_mmp
的典 型值与变异区间基于【jc wu et al】报道的对多柔比星敏感、正常和耐受人群 hipsc-cms实验结果与本研究建立的pd模型得到。在本研究中，虚拟临床试验 总共纳入87000名虚拟患者，其中高暴露患者28000，中等暴露患者29000名， 低暴露患者30000名；心血管正常的患者45762名，患有心血管并发症的患者 31238名；心肌细胞敏感患者35000，正常患者30000名，耐受患者22000名。
[0105]
图4b虚拟患者临床试验结果显示，对于心肌-药物敏感人群而言，无论是何 种暴露水平或疾病状态，都不推荐使用多柔比星。对于中、低敏感人群而言，药 物暴露高低的影响较为明显。当心功能损伤发生风险设置在5％时，对于低敏感 无心血管疾病人群而言，高暴露人群的安全剂量(500mg/m2)远小于低暴露人 群(800mg/m2)。在非高敏感人群中，心血管疾病对安全剂量的影响较为明显。 对于高敏感人群而言，无论是否存在心血管疾病，也无论其体内药物暴露高低与 否，均不存在多柔比星的安全剂量。虚拟临床实验结果表明与药物暴露和疾病状 态相比，心肌-药物敏感性是影响多柔比星诱导的心功能损伤的关键因素，这提 示我们可以通过体外实验考察药物对不同个体来源心肌细胞的损伤作用，从而计 算药物在人群中心肌损伤风险的可能剂量范围，从而避免部分临床患者用药后发 生心功能损伤。
[0106]
实施例2
[0107]
以酪氨酸激酶抑制剂(tki)的心脏毒性预测为例
[0108]
1、心肌细胞损伤的td机制模型的构建
[0109]
(1)数据获取
[0110]
文献中将hipsc-cms暴露于多柔比星及21种酪氨酸激酶抑制剂(具体药物 及相关理化性质见表3)培养，并于72h测定细胞数量和细胞活力数据指标。以 多柔比星为工具药对照，目的是消除不同实验室间hipsc-cms敏感性或检测手 段等因素的差异，基于从文献中获取的实验数据构建的pk/td机制模型
[0111]
表3酪氨酸激酶抑制剂理化性质列表
[0112]
[0113][0114]ainformationfromfdalabelandreview
[0115]binformationobtainedfromchemdrawsimulations
[0116]cinformationunlabeledmeansobtainedfromdrugbank
[0117]dinformationobtainedfrom16502356
[0118]einformationobtainedfrom27956204
[0119]finformationobtainedfrom32590030
[0120]
(2)模型构建
[0121]
1)首先将文献中多柔比星对hipsc-cms的损伤数据带入实施例1中建立的多柔比星的qsp-pbpk-td模型，调节心肌细胞指标的敏感性以调节hipsc-cms敏感性的差异。
[0122]kdead0
＝k
dead
·
index
kdead
(2.1)
[0123]
ec50
mmp0
＝ec50
mmp
·
index
ec50mmp
(2.2)
[0124]
其中k
dead
是实施例1中得到的多柔比星受损细胞向死亡细胞的转化率常数，k
dead0
是文献中多柔比星对受损细胞向死亡细胞的转化率常数；ec
50_mmp
是实施例1中多柔比星对抑制mmp产生最大效应一半时细胞内药物浓度；index
kdead
、index
ec50mmp
分别表示不同来源心肌细胞细胞数量和细胞活力指标敏感性差异。
[0125]
2)药物暴露：调节心肌细胞指标的敏感性后，以调整后hipsc-cms的敏感性构建酪氨酸激酶抑制剂的td模型，由于实验过程中药物持续暴露，无撤药步骤，培养基中的给药浓度即为药物的暴露浓度。
[0126]cin
＝c
ex
(2.3)
[0127]
其中c
ex
是培养基内药物浓度，c
in
是实际作用于细胞的药物浓度。
[0128]
3)细胞存活率：体外hipsc-cms实验现象证明细胞数量的损伤存在“阈值”现象，低浓度酪氨酸激酶抑制剂处理细胞并不会出现心肌细胞的凋亡或坏死，高浓度药物培养细胞则会诱导心肌细胞凋亡或坏死，在原先的td模型上进行一定程度的修改。
[0129]cef
＝c
in-c
th
(2.4)
[0130][0131][0132][0133]
其中c
ef
是实际有效诱导细胞坏死的药物浓度，c
th
是有效诱导细胞坏死的药物浓度阈值，f
nor
是正常心肌细胞的比例，f
inj
是受损心肌细胞的比例，f
dead
是死亡心肌细胞的比例。k
inj
是正常细胞向受损细胞的转化率常数，k
rec
是受损细胞向正常细胞的恢复速率常数，k
dead
是受损细胞向死亡细胞的转化率常数。survivalfraction是存活细胞占总细胞的比例。
[0134]
4)心肌细胞收缩力：心肌细胞收缩力损伤的假设与实施例1中一致，公式如前公式1.9-1.12。建立的酪氨酸激酶抑制剂诱发心肌损伤的pk/td机制模型中参数通过monolix软件拟合得到，优化后的参数值见表4。
[0135]
表4实施例2中pk/td模型参数优化值表
[0136]
[0137][0138]
2、酪氨酸激酶抑制剂pk模型的建立
[0139]
(1)临床文献数据的收集
[0140]
纳入和排除标准为(1)给药剂量为临床推荐给药方案，(2)单独给药，未 同时给予其他药物，(3)数据可以呈现完整pk血浆药物浓度曲线
[0141]
(2)药物pk模型的建立
[0142]
根据推荐给药方案收集文献中的21种酪氨酸激酶抑制剂药物的临床血药浓 度数据，利用软件建立合适的房室模型用于描述用药患者体内的血药浓度曲线， 模型的选择基于最佳拟合方法和其他统计参数，如aic、bic或bicc。
[0143]
3、体外td机制模型与pbpk模型和qsp模型的桥接与验证
[0144]
(1)td模型的体外-体内转化
[0145]
在2.1部分建立了基于机制的药源性心肌细胞损伤体外td模型，以2.2部 分的pk
模型代替实施例1中的多柔比星系统、组织、细胞多维度暴露水平的pbpk模型，再将体外td机制模型与文献中报道的体内qsp、pk模型进行桥接，即完成了pd模型的体外-体内转化。
[0146]
假设血浆药物浓度c
plasma
即为体内损伤心脏的药物暴露浓度，将基于pk模型预测的c
plasma
带入作为培养基中药物的输入，链接患者pk与体外pk/td模型，实现药物剂量-暴露-效应的转化。为更精确地描述心肌细胞-药物之间的相互作用，将第二章所构建的基于hipsc-cms建立的体外td机制模型取代qsp模型中经验性的e
max
模型，将td模型中的收缩力替代e
ep_sv
。
[0147]
(2)qsp-pk-td模型及体外-体内转化方法的验证
[0148]
基于上述转化和桥接方法建立了人的酪氨酸激酶抑制剂qsp-pbpk-td模型，用于预测酪氨酸激酶抑制剂给药后心血管系统泵血功能的变化，基于虚拟患者临床试验中心血管正常的虚拟患者用药后的心血管事件发生率区分心脏毒性阳性药物与阴性药物，将结果与fda及临床实验报道相比较，区分效果如图5a所示。以fda及临床实验报道的药物相关的心衰事件发生率作为评价指标，可以对模型进行进一步验证。
[0149]
(3)利用qsp-pk-td模型进行体外-体内转化的进一步探究与优化
[0150]
1)潜在因素纳入
[0151]
最初假设药物作用于患者心肌细胞暴露的有效浓度c
eff,vivo
等于患者的血浆总药物浓度c
plasma,total
，即：
[0152]ceff,vivo
＝c
plasma,total
(2.8)
[0153]
但实际情况下作用于心肌细胞的药物有效浓度受药物理化性质等因素影响，药物分布和体内、体外环境的不同显示出药物毒性的差异，导致药物体内-体外转化不够准确。为了探索药物心毒性转化翻译过程中必须要考虑的因素，在模型中考虑依次纳入以下的潜在可能性，再次重复(2)中qsp-pk-pd的模型验证过程，对比真实患者的心衰发生率和虚拟患者的心衰发生率，将更正后模型模拟的药物模拟结果与原本模型的模拟结果比较，选择合适的因素逐步纳入模型。
[0154]
a.培养基和血浆血浆蛋白结合差异
[0155]
以hipsc-cms为药物体外心脏毒性研究工具时，在培养基中加入不同药物浓度的研究药物培养一定的时间后，利用不同检测方法得到需要的心肌细胞各类pd指标结果，代入构建好的模型中计算药物对应的心肌损伤参数。此时在体外模型中，我们认为药物作用于hipsc-cms的有效浓度c
eff,vitro
等于培养基中添加的总药物浓度c
medium,total
，即：
[0156]ceff,vitro
＝c
medium,total
(2.9)
[0157]
事实上，只有游离的药物可以与细胞膜上的靶点结合发挥效应，培养基中药物的游离分数f
u,medium
也需要考虑，所以作用于hipsc-cms的实际有效浓度c
eff,vitro
等于培养基中的游离药物浓度c
medium,free
，即：
[0158]ceff,vitro
＝c
medium,free
＝c
medium,total
*f
u,medium
(2.10)
[0159]
同样在患者体内，需要考虑患者血浆中药物的游离分数f
u,plasma
，因此假设作用于患者心肌的有效药物浓度c
eff,vivo
等于患者的血浆游离药物浓度c
plasma,free
，即：
[0160]ceff,vivo
＝c
plasma,free
＝c
plasma,total
*f
u,plasma
(2.11)
[0161]
因此基于hipsc-cms的体外实验数据进行体内-体外转换时，需要同时考虑培养基中药物的游离分数f
u,medium
和血浆药物游离分数f
u,plasma
：
[0162][0163]
查找文献研究中已测定的心肌细胞培养基中药物的游离分数f
u,medium
，将收集到f
u,medium
的药物模型中纳入该参数，模型进一步的验证结果如图5b的roc曲线所示所示。
[0164]
b.药物在体内的组织分布
[0165]
血浆中的游离药物透过毛细血管壁进入组织间液，药物的脂溶性、分子大小、酸性或碱性解离度、血浆蛋白结合及组织的亲和性等都会影响药物在体内的分布。根据文献中已有的酪氨酸激酶抑制剂药物在动物心脏分布的药物研究结果或基于酪氨酸激酶抑制剂药物的理化性质利用simcyp软件模拟患心脏分布，得到相应药物的心脏分布系数k
p
，因而进一步假设患者心肌的有效药物浓度c
eff,vivo
等于分布于患者心脏组织间液的药物浓度c
plasma,heart
，即：
[0166]ceff,vivo
＝c
plasma,heart
＝c
plasma
*k
p
(2.13)
[0167]
分别查找文献研究中实验动物的心脏组织药物浓度分布和血浆药物浓度，得到药物心脏分配系数k
p_observation
部分药物缺少动物实验的心脏组织药物浓度测定，利用simcyp软件和表3中的药物理化性质模拟预测了这部分药物心脏组织分布系数k
p_prediction
，同时模拟了已收集到心脏药物分布药物的k
p_prediction
与k
p_observation
相比较，用于评估模拟结果的准确性，验证结果如图6所示，大部分药物的模拟结果k
p_prediction
与实验测得的k
p_observation
十分相近。在a部分的基础上纳入组织分布因素，重新验证模型预测结果的准确性，如图5c的roc曲线所示。
[0168]
c.药物在心脏的空间分布
[0169]
药物经血液运输到达心脏组织，离毛细血管近的心肌细胞可以接触到更多的药物，心脏细胞损伤程度更大，反之远离毛细血管的心肌细胞接触到的药物更少，心肌细胞损伤程度更低，在心脏组织中药物浓度并不均一。
[0170]
在利用hipsc-cms进行高通量筛选的体外实验中，在培养皿或孔板中培养的hipsc-cms为2d的培养结构，因此药物对2d心肌细胞的毒性效应e
2d
与在2d结构中的毒性效应系数k
2d
的关系可简单描述为：
[0171]e2d
＝c
2d
*k
2d
(2.14)
[0172]
同理药物对3d心肌结构的毒性效应e
3d
与药物对3d结构的毒性效应系数k
3d
的关系可描述为：
[0173]e3d
＝c
3d
*k
3d
(2.15)
[0174]
而当体外药物达到50％毒性效应时：
[0175]e2d,50
＝ic
50,2d
*k
2d
(2.16)
[0176]
当体内药物达到50％毒性效应时：
[0177]e3d,50
＝ic
50,3d
*k
3d
(2.17)
[0178]
假设心肌的有效药物浓度c
eff,vivo
等于3d心脏组织的药物浓度c
3d
，综合上述各式可得：
[0179][0180]
ic
50,3d
可以直接从收集到的文献中获取或根据文献中药物对3d心脏组织对应指
标测定的数据计算得到，再代入同一文献中或自己的实验数据的ic
50,2d
进行 转换。在b部分的基础上纳入空间分布因素，重新验证模型预测结果的准确性， 如图5d的roc曲线所示。
[0181]
d.此外，药物引起其他心血管疾病如dasatinib可能会引起患者出现肺动脉 高压(pah)，进而诱发或加重患者心力衰竭，虽然这类疾病因素无法纳入模型， 但在分析结果时应进行考虑。
[0182]
2)模型优化结果分析
[0183]
综合考虑上述所有潜在的因素，基于虚拟患者临床试验中心血管正常的虚拟 患者用药后的心血管事件发生率再次区分心脏毒性阳性药物与阴性药物，区分效 果的改变如下图5e所示，可以看到区分效果存在显著改善。
[0184]
同时将模型预测的心血管事件发生率与fda报告及文献报道的实际结果比 较，验证修正后qsp-pk-pd模型的准确性，心脏毒性阳性药物的临床心功能损 伤风险的预测和与临床报道对比如图7所示。ponatinib，pazopanib，sorafenib 三种心脏毒性阳性药物临床心功能损伤风险的预测值过高(》30％)，因此未画图 展示。但心脏毒性阳性药物的临床心功能损伤风险总体预测极为准确，模型优化 结果好。