一种多巴胺-肝素复合抗凝涂层及其制备方法

1.本发明医用材料技术领域，公开了一种多巴胺-肝素复合抗凝涂层及其制备方法。


背景技术：

2.这里的陈述仅提供与本发明相关的背景技术，而不必然地构成现有技术。
3.医疗器械在临床手术中不可或缺，其中与血液接触的医疗器械更是至关重要，这些医疗器械主要由钛合金(如血管内支架、骨折固定物等)、pvc(如体外循环管道等)、聚氨酯(如中心静脉导管、留置针等)和不锈钢(如手术刀、手术钳等)等材料制备而成。但由于这些医用材料的生物相容性较差，当它们直接与血液接触时，会激活异物引起的凝血响应，即血浆蛋白吸附到材料表面，激活凝血因子或血小板的粘附和激活，促使可溶性纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白，最后导致凝血、炎症等严重的并发症，甚至会导致患者的死亡。
4.最后，纤维蛋白网络形成，可导致血凝块、炎症等严重并发症，甚至死亡。目前，采用静脉抗凝药物进行全身抗凝治疗是预防血栓相关并发症的常用方法，肝素被认为是在血液接触外来物质初期抑制血栓形成最合适的生物分子。但全身性肝素化可导致机体凝血调节能力的破坏，导致自发性出血、凝血困难和超敏反应等并发症。
5.目前，人们尝试通过在医用材料表面结合肝素分子的方法在减少肝素使用量的同时达到增加材料的生物相容性、减少血栓形成的目的。
6.然而，由于医用器械材料表面的化学性质较为稳定，能够用于接枝的活性基团很少，因此肝素分子的接枝受到限制。目前也有利用等离子体处理、聚乙烯亚胺长链分子黏附等方法在医用材料表面引入活性基团的研究，但是仍存在引入活性基团效率低、处理困难以及所用试剂毒性较强等缺陷。


技术实现要素：

7.针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种多巴胺-肝素复合抗凝涂层及其制备方法。
8.为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：
9.第一方面，本发明提供了一种多巴胺-肝素复合抗凝涂层，包括基体材料、构建于基体材料表面的聚多巴胺涂层以及聚多巴胺涂层表面的肝素涂层。
10.第二方面，本发明提供了一种多巴胺-肝素复合抗凝涂层的制备方法，包括如下步骤：
11.采用浸涂法在医用材料上构建聚多巴胺涂层，得到涂有pdam涂层的医用材料；
12.将涂有pdam涂层的医用材料浸渍于羧基被激活的肝素钠溶液中孵育，完成肝素的接枝，得到肝素涂层；
13.或，将涂有pdam涂层的医用材料浸渍于中间体溶液中，实现中间体的接枝，然后将医用材料浸渍于肝素钠溶液或低分子肝素溶液或羧基被激活的肝素钠溶液中，进行肝素的接枝，得到肝素涂层。
14.上述本发明的一种或多种实施例取得的有益效果如下：
15.该方法首先在医用材料基底上构建多巴胺涂层，然后再在一定条件下或通过一定的中间体将肝素固定在医用材料表面，最后将改性后材料用去离子水清洗后室温下真空干燥制得，最终在医用材料上构建具有良好抗凝性能的复合涂层。
16.由于聚多巴胺涂层能够与几乎所有底物稳定结合，因此本发明中所述的复合抗凝涂层能够用于各种医用材料上，其稳定性不会随着材料基底的变化而发生改变，具有普适性。
17.本发明提到的多巴胺-肝素复合涂层能够起到很好的抗凝作用，在减少肝素使用量的情况下增加医用材料表面的生物相容性。
18.本发明采用的涂层制备工艺以浸涂为主，操作简单，制备效率较高，适合大规模生产。该涂层制备所用的材料均为无毒无害的生物分子，且制备过程不会对环境造成污染，可以确保改性后医用材料的安全性。
19.本发明无需改进医用器械的原材料，且无需改进医疗器械的加工设备和工艺，是在目前医用器械材料基础上进行的操作，处理方便，成本较低，能够快速推广应用，实用性较强。且该涂层能够抑制血栓的形成，大大延长医用器械的使用寿命，降低患者治疗过程中的风险，减少患者由于血栓并发症导致的死亡，且能够减少肝素等抗凝药物的使用，具有推广价值。
附图说明
20.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
21.图1为实施例1～4中所述涂层1～4的构建方案示意图；
22.图2为实施例1～4中涂层1～4接触角测试结果；
23.图3为涂层1～4和空白pvc片的atr-ftir红外光谱测试结果；
24.图4为肝素浓度测定的标准曲线；
25.图5为实施例1～4中所述涂层1～4的肝素含量柱状图；
26.图6为涂层1～4和空白pvc片的溶血率柱状图；
27.图7为涂层1～4和空白pvc片的抗凝效果验证-aptt检测。
具体实施方式
28.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
29.第一方面，本发明提供了一种多巴胺-肝素复合抗凝涂层，包括基体材料、构建于基体材料表面的聚多巴胺涂层以及聚多巴胺涂层表面的肝素涂层。
30.多巴胺在有氧化剂且弱碱性环境下会发生自聚合形成聚多巴胺，聚多巴胺能够在多种基底材料(包括贵金属、金属氧化物、无机及有机高分子材料等)表面实现黏附形成聚多巴胺涂层，基于聚多巴胺涂层中含有大量可以参与反应官能团的特点，聚多巴胺涂层表面可以进行二次修饰从而制备功能性材料表面。
31.在一些实施例中，肝素与聚多巴胺涂层之间直接接枝，或，通过中间体进行接枝。
32.优选的，所述中间体选自戊二醛和赖氨酸，所述赖氨酸为羧基被激活的赖氨酸。
33.第二方面，本发明提供了一种多巴胺-肝素复合抗凝涂层的制备方法，包括如下步骤：
34.采用浸涂法在医用材料上构建聚多巴胺涂层，得到涂有pdam涂层的医用材料；
35.将涂有pdam涂层的医用材料浸渍于羧基被激活的肝素钠溶液中孵育，完成肝素的接枝，得到肝素涂层；
36.或，将涂有pdam涂层的医用材料浸渍于中间体溶液中，实现中间体的接枝，然后将医用材料浸渍于肝素钠溶液或低分子肝素溶液或羧基被激活的肝素钠溶液中，进行肝素的接枝，得到肝素涂层。
37.在一些实施例中，肝素钠溶液的羧基激活方法，包括如下步骤：将肝素钠溶液在wsc溶液中激活；
38.所述wsc溶液为0.2～0.5mg/ml n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、0.5～2mg/ml n-(3-二甲氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺(edc)和9.5～9.8mg/ml2-(n-morpholino)乙磺酸水合物(mes)的混合物。
39.在一些实施例中，所述中间体选自戊二醛和赖氨酸，所述赖氨酸为羧基被激活的赖氨酸。
40.在一些实施例中，低分子肝素溶液的制备方法为：
41.肝素钠在与冰醋酸和亚硝酸钠的混合溶液中低温裂解，终止反应后，透析，得到带醛基的低分子肝素钠溶液。
42.优选的，向带醛基的低分子肝素钠溶液中加入nabh3cn，得混合溶液，然后将涂有pdam涂层的医用材料浸渍于混合溶液中，利用nabh3cn将低分子肝素与医用材料表面的pdam涂层进行偶联。
43.优选的，当中间体为戊二醛时，中间体溶液为无水乙醇、1,1,2-三氟三氯乙烷和戊二醛水溶液的混合溶液；
44.将涂有pdam的医用材料置于该混合溶液中，接枝戊二醛；
45.然后将其浸泡于肝素钠溶液中，接枝肝素，得到多巴胺-肝素复合抗凝涂层。
46.优选的，赖氨酸的羧基被激活的方法为：采用wsc溶液激活赖氨酸中的羧基。被激活的赖氨酸可以提供更多的氨基活性基团，使赖氨酸更容易与富含氨基的pdam涂层结合。
47.以下实施例中的医用材料基底均采用医用pvc片。
48.实施例1
49.构建多巴胺涂层：采用浸涂法在医用pvc片上构建聚多巴胺(pdam)涂层。
50.首先，将医用pvc片分别用去离子水和乙醇超声清洗20分钟，以去除表面杂质。
51.将2mg/ml多巴胺盐酸盐充分溶解于5mmol/l的tris盐缓冲液中，并用氢氧化钠和盐酸将溶液的ph调整至8.5，得到多巴胺溶液。所述的tris盐缓冲液配置方法如下：将0.097g三羟甲基氨基甲烷(tris)溶于80ml去离子水中，或tris与去离子水的质量按比例变化，可制备5mmol/l的tris盐缓冲液。
52.将医用pvc片浸入上述多巴胺溶液中，在25℃下沉积24小时。沉积后，用去离子水将医用pvc片超声清洗3min，以去除吸附不牢固的聚多巴胺。
53.最后，将带有pdam涂层的医用pvc在25℃下真空干燥，得到带有pdam涂层、表面富含氨基的医用pvc片。
54.实施例2
55.涂层1的制备：
56.首先，配置水溶性碳二亚胺(wsc)溶液，所述溶液中包含0.24mg/ml的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、1mg/ml的n-(3-二甲氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺(edc)和9.76mg/ml的2-吗啉乙磺酸(mes)。
57.然后，将1mg/ml的肝素钠在上述wsc溶液中提前激活20min，以激活肝素的羧基，使肝素钠更容易与富含氨基的pdam涂层结合。
58.将实施例1中制备的带有pdam涂层的医用pvc片浸入到被激活的肝素钠溶液中孵育12h，将孵育后的医用pvc材料用去离子水超声冲洗3min，以去除结合不牢固的肝素钠，完成肝素的接枝。
59.最后，将肝素接枝后的医用pvc片在25℃下真空干燥，得到带有复合抗凝涂层的pvc片，并命名为涂层1。
60.实施例3
61.涂层2的制备：
62.首先，将80ml无水乙醇、2.5ml 1,1,2-三氟三氯乙烷和5ml质量分数为25％的戊二醛水溶液混合配制成复合溶液。将实施例1中制备的带有pdam涂层的医用pvc片置于复合溶液中，在37℃温度下浸泡30min。随后，将pvc片取出，用去离子水超声洗涤3min后，将其浸泡在浓度为1mg/ml的肝素钠溶液中30min，再用去离子水超声清洗3min。以上步骤重复三次后，将肝素接枝后的医用材料在25℃下真空干燥，得到带有复合抗凝涂层的pvc片，并命名为涂层2。
63.实施例4
64.涂层3的制备：
65.在去离子水中充分溶解1mg/ml肝素钠，加入1mg/ml冰醋酸调节ph至2.3～3.0。加入2mg/ml亚硝酸钠后，肝素钠在5℃下充分裂解3.5h。然后用氢氧化钠将溶液调至ph 6.5～7.0，终止反应。所得溶液在0.1mol/l nh4hco3溶液中透析(mwco 3500da)，得到带醛基的低分子肝素钠溶液。
66.将实施例1中制备的带有pdam涂层的医用pvc片置于上述的低分子肝素钠溶液中，并加入2mg/ml nabh3cn，在37℃条件下孵育12h，将孵育后的医用pvc材料用去离子水超声冲洗3min，以去除结合不牢固的肝素钠。最后，将肝素接枝后的医用pvc片在25℃下真空干燥，得到带有复合抗凝涂层的pvc片，并命名为涂层3。
67.实施例5
68.涂层4的制备：
69.首先，制备水溶性碳二亚胺(wsc)溶液，所述wsc溶液与实施例2过程一致。
70.然后将1mg/ml的赖氨酸盐酸盐在wsc溶液中提前激活20min，以激活赖氨酸中的羧基。
71.将实施例1中制备的带有pdam涂层的医用pvc片浸入到被激活的赖氨酸溶液中孵育12h，将孵育后的医用材料用去离子水超声冲洗3min，以去除结合不牢固的赖氨酸，完成
赖氨酸的接枝。
72.将1mg/ml的肝素钠在上述wsc溶液中提前激活20min，然后再将上述接枝赖氨酸的医用pvc片浸入到被激活的肝素钠溶液中孵育12h，将孵育后的医用pvc材料用去离子水超声冲洗3min，以去除结合不牢固的肝素钠。
73.最后，将肝素接枝后的医用pvc片在25℃下真空干燥，得到带有复合抗凝涂层的pvc片，并命名为涂层4。
74.图2为实施例1-4中涂层1～4接触角测试结果；图中所示医用pvc片涂覆多巴胺-肝素复合涂层后，表面接触角明显降低，说明其亲水性增强，因此可以表示带有复合涂层的pvc片表面性能发生了变化，生物相容性增强；
75.图3为涂层1～4和空白pvc片的atr-ftir红外光谱测试结果；图中1039cm-1
处的峰为肝素的特征峰，空白pvc片的红外光谱在1039cm-1
处无特征峰，而涂层1～4的红外光谱图中均存在1039cm-1
的峰，证明肝素接枝成功。
76.肝素表面含量测试：
77.建立肝素浓度测定的标准曲线：
78.以pbs缓冲液为溶剂，配置浓度为40μg/ml、20μg/ml、16μg/ml、10μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、0μg/ml一系列的肝素钠溶液。以质量分数为0.2％的氯化钠溶液为溶剂配置浓度为0.005％的甲苯胺蓝溶液。向10ml离心管中加入2.5ml不同浓度的肝素钠溶液，再加入2.5ml的甲苯胺蓝溶液，振荡混合2h后，离心后去除肝素-甲苯胺蓝的络合物。再加5ml的正己烷后振荡10min，去除溶液中残留的络合物。然后以等量0.2％nacl溶液和pbs缓冲液的混合液为空白对照，利用紫外分光光度计测试甲苯胺蓝溶液在631nm处的吸光度光度值，建立肝素钠浓度测定的标准曲线，如图4所示。
79.将样品剪成一定面积的小块，浸泡在2.5mlpbs缓冲液中，与等量的甲苯胺蓝振荡混合2h后，离心后去除肝素-甲苯胺蓝的络合物。再加5ml的正己烷后振荡10min，去除溶液中残留的络合物。然后以等量0.2％nacl溶液和pbs缓冲液的混合液为空白对照，利用紫外分光光度计测试甲苯胺蓝溶液在631nm处的吸光度光度值，与标准曲线进行对照，得到样品表面肝素含量，如图5所示。
80.溶血率测试：
81.取8ml含0.0109mol/l柠檬酸钠溶液的新鲜血液，用10ml生理盐水稀释。将经过不同处理的医用pvc片剪裁成10
×
10mm的样品，分别浸入0.5ml稀释的血液中，在37℃条件下孵育1h。然后取出样品后，向血液中加入9ml生理盐水，稀释后的血液以2000rpm离心5分钟，并用紫外分光光度计在545nm波长下测定离心后上清液的吸光度。0.5m稀释后的血液中加入9ml去离子水，以2000rpm离心5min后，取其上清液为阳性对照，以生理盐水为阴性对照，在545nm处测定吸光度，溶血率计算公式如下所示。
[0082][0083]
其中，x1为样品吸光度；x2为阳性对照吸光度；x3为阴性对照吸光度。最后得到各组样品溶血率如图6所示，涂覆多巴胺肝素复合涂层后，医用pvc片的溶血率明显降低，低于1％(国家标准为医用器械的溶血率不超过5％)，说明本发明中的复合涂层具有良好的血液相容性。
[0084]
凝血性能测试：
[0085]
取含0.0109mol/l柠檬酸钠溶液的新鲜血液，在3000rpm转速下离心10min，获得贫血小板血浆。将经过不同处理的医用pvc片剪裁成10
×
10mm的样品，浸泡在与500μl贫血小板血浆中在37℃下孵育1h。然后取出样品后，使用aptt试剂盒测定贫血小板血浆的aptt，如图7所示，涂覆多巴胺肝素复合涂层后，浸泡过医用pvc片的贫血小板血浆的aptt明显延长15s以上，(延长10s以上具有临床意义)。说明本发明中的复合涂层具有良好的抗凝作用。
[0086]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。