稳定性制剂及其制备方法与流程

1.本发明属于生物工程技术领域，具体地，本发明涉及包含蛋白的制剂及其制备方法。


背景技术：

2.糖尿病主要有2种类型，胰岛素依赖型糖尿病(i型糖尿病)和非胰岛素依赖型糖尿病(ii型糖尿病)，其中ii型糖尿病患者占90％以上。ii型糖尿病是以糖代谢紊乱为主要特征的代谢综合征，其发病机制至今尚未完全明确，可能与多种因素有关，其中包括环境、生活方式和遗传因素。目前，ii型糖尿病的治疗措施，例如环境加生活方式干预、辅助性药物治疗的效果不显著，胰岛素治疗存在导致肥胖及增加心脑血管疾病风险的弊端，人群发病率和死亡率均居高不下。这些原因促使人们不断寻找新的治疗ii型糖尿病的药物，胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂(glp-1ra)便是其中之一。
3.衍生自前胰高血糖素原(pro-glucagon)的肽包括胰高血糖素样肽-1(glp-1)和胰高血糖素样肽-2(glp-2)，都源自胰高血糖素原基因。胰高血糖素样肽-1(glp-1)是一种内源性肠促胰岛素分泌剂，在稳定血糖中起着重要作用，由胰高血糖素原翻译后加工产生，主要以2种生物等效形式存在：glp-1(7-36)-nh2和glp-1(7-37)，在人体内glp-1(7-36)-nh2所占比例更高。glp-1还具有食欲抑制作用，而且对于心血管疾病和减少糖尿病相关的肾病方面也有有利作用。研究发现，glp-1的主要作用机制如下:
①
以葡萄糖依赖的方式刺激胰岛素分泌；
②
降低胰高血糖素分泌；
③
抑制胃排空；
④
降低食欲；以及
⑤
促进胰腺β细胞的生长和复苏。
4.然而，虽然glp-1是治疗ii型糖尿病的合适候选药物，但是由于人体自身glp-1的作用持续时间十分短暂(半衰期约2分钟)，很不稳定，在体内很快被二肽基肽酶-4(dpp-4)降解。也就是说，人体自身的glp-1并不适合开发为药物用于糖尿病的临床治疗。
5.目前制备长效glp-1的修饰技术包括：脂肪酸链修饰(比如利拉鲁肽和索马鲁肽)、融合fc片段技术(比如杜拉鲁肽)和peg修饰技术(比如洛塞那肽)，但是经修饰的长效glp-1制剂，尤其是融合fc片段的长效glp-1，依然具有片段峰及反相杂质的问题。
6.cn102772787a涉及制备glp-1化合物稳定溶液的办法，所述方法包括在碱性ph条件下加热所述glp-1化合物溶液至40℃以上的温度至少5分钟。所述glp-1化合物为利拉鲁肽，利拉鲁肽具有31个氨基酸，而且是在较高ph条件下进行加热，并不适合常规的生物制品。此外，该专利申请中加热处理解决的是利拉鲁肽聚集的问题，并未针对片段峰的产生和反相杂质提出解决办法。
7.通常肽类、蛋白质由于对温度敏感，容易发生物理或化学降解产生片段以及其它杂质，还容易发生聚集，在碱性条件下还容易发生水解。因此，亟需开发用于长效glp-1的稳定性制剂。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供一种包含glp-1或glp-1类似物的稳定性制剂及其制备方法，所述稳定性制剂显示显著降低片段峰及杂质，所述稳定性制剂的制备包括将所述包含glp-1的制剂在弱酸性条件下加热到55℃-65℃温度的步骤。
9.第一方面，本发明提供了一种稳定性制剂，所述稳定性制剂包含glp-1或glp-1类似物，并且所述稳定性制剂经过在55℃-65℃的温度下进行处理的步骤。
10.在一些实施方案中，所述稳定性制剂的ph为6.5-7.0，经过在55℃-65℃的温度下进行处理的步骤。
11.优选地，所述稳定性制剂的ph为6.5-7.0，经过在55℃-65℃的温度下处理30-90分钟的步骤。
12.优选地，所述稳定性制剂的ph为6.5-7.0，经过在55℃-65℃的温度下处理50-70分钟的步骤。
13.优选地，所述稳定性制剂的ph为6.6-6.8，经过在55℃-65℃的温度下处理30-90分钟的步骤。
14.优选地，所述稳定性制剂的ph为6.6-6.8，经过在55℃-65℃的温度下处理50-70分钟的步骤。
15.在一些实施方案中，所述稳定性制剂的ph为6.7，经过在55℃-65℃的温度下处理30-90分钟的步骤。
16.在一些实施方案中，所述稳定性制剂经过在55℃，56℃，57℃，58℃，59℃，60℃，61℃，62℃，63℃，64℃或65℃的温度下处理50-70分钟的步骤。
17.在一些实施方案中，所述稳定性制剂的ph为6.7，经过在60℃的温度下处理60分钟的步骤。
18.在一些实施方案中，所述glp-1类似物选自人glp-1的直系同源物，人glp-1的突变体，人glp-1的直系同源物的突变体，修饰的人glp-1，修饰的人glp-1的突变体，修饰的人glp-1的直系同源物的突变体，并且所述glp-1类似物保持glp-1的天然生物活性。
19.在一些实施方案中，所述修饰的人glp-1，修饰的人glp-1的直系同源物，修饰的人glp-1的突变体，或修饰的人glp-1的直系同源物的突变体包括选自如下的修饰：聚乙二醇化；糖基化、聚唾液酸化或羟乙基淀粉化；融合麦芽糖结合蛋白；融合白蛋白；通过酰化作用进行的白蛋白融合；融合fc；以及融合peg模拟物。
20.在一些实施方案中，所述glp-1类似物选自艾塞那肽(exenatide)、利拉鲁肽(liraglutide)、利司那肽(lixisenatide)、阿必鲁肽(albiglutide)、杜拉鲁肽(dulaglutide)、索马鲁肽(semaglutide)、贝那鲁肽(beinaglutide)、聚乙二醇洛塞那肽(peg-loxenatide)和苏帕鲁肽(supaglutide)。
21.在一些实施方案中，所述稳定性制剂还包含药物赋形剂，所述药物赋形剂选自缓冲剂，防腐剂，乳化剂，悬浮剂，稀释剂，稳定剂，ph调节剂和表面活性剂中的一种或多种。
22.本领域技术人员已知，如果药物赋形剂在55℃-65℃的温度下处理的情况下不稳定或者降解，所述的药物赋形剂可以在55℃-65℃的温度下处理并冷却后加入到稳定性制剂中。
23.在一些实施方案中，所述缓冲剂选自枸橼酸盐、组氨酸、琥珀酸盐中的一种或多
种。
24.在一些实施方案中，所述表面活性剂选自泊洛沙姆188，聚山梨酯20和聚山梨酯80中的一种或多种。
25.在一些实施方案中，所述稳定剂选自乳糖,蔗糖,海藻糖,甘露醇和纤维二糖中的一种或多种。
26.在一些实施方案中，所述稳定性制剂包含glp-1类似物，缓冲剂，稳定剂和表面活性剂，并且所述稳定性制剂的ph为6.5-7.0，经过在55℃-65℃的温度下处理30-90分钟的步骤，所述glp-1类似物为包含fc结构域的人glp-1-fc融合蛋白，人glp-1的直系同源物fc融合蛋白，人glp-1的突变体fc融合蛋白，或人glp-1的直系同源物的突变体fc融合蛋白，
27.所述缓冲剂选自枸橼酸盐、组氨酸、琥珀酸盐中的一种或多种；
28.所述表面活性剂选自泊洛沙姆188，聚山梨酯20和聚山梨酯80中的一种或多种；并且
29.所述稳定剂选自乳糖,蔗糖,海藻糖,甘露醇和纤维二糖中的一种或多种。
30.在一些实施方案中，所述稳定性制剂包含杜拉鲁肽，枸橼酸盐，聚山梨酯80和甘露醇，
31.并且所述稳定性制剂的ph为6.5-7.0，经过在55℃-65℃的温度下处理30-90分钟的步骤。
32.在一些实施方案中，所述稳定性制剂包含杜拉鲁肽，枸橼酸盐，聚山梨酯80和甘露醇，
33.并且所述稳定性制剂的ph为6.7，经过在60℃的温度下处理50-70分钟的步骤。
34.在一些实施方案中，所述稳定性制剂包含杜拉鲁肽，枸橼酸盐，聚山梨酯80和甘露醇，
35.并且所述稳定性制剂的ph为6.7，经过在60℃的温度下处理60分钟的步骤。
36.在稳定性制剂中包含聚山梨酯80的情况下，在加热处理并冷却后，再加入聚山梨酯80。
37.第二方面，本发明提供了一种制备稳定性制剂的方法，所述方法包括对包含glp-1或glp-1类似物的制剂在55℃-65℃的温度下进行处理的步骤。
38.在一些实施方案中，所述方法包括对包含glp-1或glp-1类似物的ph6.5-7.0的制剂在55℃-65℃的温度下进行处理的步骤。
39.优选地，所述方法包括对包含glp-1或glp-1类似物的ph6.5-7.0的制剂在55℃-65℃的温度下处理30-90分钟的步骤。
40.优选地，所述方法包括对包含glp-1或glp-1类似物的ph6.5-7.0的制剂在55℃-65℃的温度下处理50-70分钟的步骤。
41.优选地，所述方法包括对包含glp-1或glp-1类似物的ph6.6-6.8的制剂在55℃-65℃的温度下处理30-90分钟的步骤。
42.优选地，所述方法包括对包含glp-1或glp-1类似物的ph6.6-6.8的制剂在55℃-65℃的温度下处理50-70分钟的步骤。
43.在一些实施方案中，所述方法包括对包含glp-1或glp-1类似物的ph6.7的制剂在55℃-65℃的温度下处理30-90分钟的步骤。
90分钟的步骤。
60.在一些实施方案中，所述方法包括对包含杜拉鲁肽，枸橼酸盐，聚山梨酯80和甘露醇的ph6.7的制剂在在60℃的温度下处理50-70分钟的步骤。
61.在一些实施方案中，所述方法包括对包含1-5mg/ml杜拉鲁肽，13-18mm枸橼酸盐，0.01-0.05％聚山梨酯80和4.5-5％甘露醇的ph6.7的制剂在60℃的温度下处理50-70分钟的步骤。
62.在一些实施方案中，所述方法包括对包含杜拉鲁肽，枸橼酸盐，聚山梨酯80和甘露醇的ph6.7的制剂在在60℃的温度下处理60分钟的步骤。
63.在一些实施方案中，所述方法包括对包含3mg/ml杜拉鲁肽，15mm枸橼酸盐，0.02％聚山梨酯80和4.6％甘露醇的ph6.7的制剂在60℃的温度下处理60分钟的步骤。
64.在稳定性制剂中包含聚山梨酯80的情况下，在加热处理并冷却后，再加入聚山梨酯80。
具体实施方式
65.以下所述的是本发明的优选实施方式，本发明所保护的不限于以下优选实施方式。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护范围。所用试剂未注明生产商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
66.在本技术中“glp-1”为天然人glp-1。在本技术中，“glp-1类似物”包括人glp-1的直系同源物，人glp-1的突变体，人glp-1的直系同源物的突变体，修饰的人glp-1，修饰的人glp-1的突变体，或修饰的人glp-1的直系同源物的突变体，所述glp-1类似物保持glp-1的天然生物活性。术语“修饰的”是指改变人glp-1，人glp-1的直系同源物，人glp-1的突变体，或人glp-1的直系同源物的突变体的一种或多种性质，所述改变不改变天然人glp-1，人glp-1的直系同源物，人glp-1的突变体，或人glp-1的直系同源物的突变体的一级氨基酸序列，所述一种或多种性质包括但不限于溶解度、循环半衰期、稳定性、清除率、免疫原性，致敏性和/或可制备性。例如，所述“修饰”包括不改变天然人glp-1，人glp-1的直系同源物，人glp-1的突变体，或人glp-1的直系同源物的突变体的一级氨基酸序列的共价化学修饰。可对天然人glp-1，人glp-1的直系同源物，人glp-1的突变体，或人glp-1的直系同源物的突变体的“修饰”包括但不限于以下中的一种或多种：聚乙二醇化(共价连接一个或多个聚乙二醇(peg)分子或其衍生物)；糖基化(例如n-糖基化)、聚唾液酸化或羟乙基淀粉化(hesylation)；麦芽糖结合蛋白融合蛋白；白蛋白融合蛋白(例如hsa融合蛋白)；通过例如缀合脂肪酸链(酰化作用)进行的白蛋白结合；fc-融合蛋白；以及与peg模拟物融合等。
67.在一些实施方案中，所述glp-1类似物包含在人glp-1序列或其直系同源物上1-10个氨基酸的缺失，取代或插入，从而具有延长的体内半衰期，以及保留的天然生物活性。
68.在一些实施方案中，所述glp-1类似物包括在人glp-1序列或其直系同源物上1-5个氨基酸残基上进行c
12-24
长链脂肪酸的修饰，从而具有延长的体内半衰期，以及保留的天然生物活性。
69.在一些实施方案中，所述glp-1类似物为融合蛋白，所述融合蛋白包括fc结构域。
70.在本技术中，“fc结构域”由抗体的铰链区、ch2和ch3恒定区结构组成。fc结构域具
有较长的血浆半衰期。当与glp-1或glp-1类似物融合在一起时，fc结构域可提供较长的半衰期，或者参与如fc受体结合、蛋白a结合、补体结合等功能。在本技术中使用的“fc结构域”是指来自天然抗体的野生型fc，或他们的变体，所述野生型fc为例如,人类igg1，igg2，igg3或igg4的fc，所述变体包括一个或多个氨基酸的缺失、取代和/或添加。在一些实施方案中，所述fc变体具备野生型fc的活性，如与fc受体的结合，并且延长了fc融合蛋白的体内半衰期，例如现有技术中已知的突变的fc结构域。
71.在一些实施方案中，所述融合蛋白是所述glp-1或glp-1类似物的c末端与所述fc结构域的n末端直接连接或者通过肽接头连接，反之亦然。所述肽接头是本领域熟知的肽接头。
72.在一些实施方案中，本技术中的glp-1类似物包括但不限于艾塞那肽(exenatide)、利拉鲁肽(liraglutide)、利司那肽(lixisenatide)、阿必鲁肽(albiglutide)、杜拉鲁肽(dulaglutide)、索马鲁肽(semaglutide)、贝那鲁肽(beinaglutide)、聚乙二醇洛塞那肽(peg-loxenatide)和苏帕鲁肽(supaglutide)。
73.艾塞那肽是从蜥蜴唾液中分离出的glp-1类似物，由39个氨基酸组成，与人glp-1有53％的同源性。其n端第2位是甘氨酸(glp-1为丙氨酸)，不易被dpp-4酶降解，氨基酸序列中c端同glp-1相比，多出9个氨基酸残基(pssgappps)，不易被肽链内切酶降解，因此具有较长的半衰期和较强的生物活性。艾塞那肽能降低ii型糖尿病患者糖化血红蛋白(hba1c)水平和餐后血糖，并能减轻体重。
74.利拉鲁肽是将人glp-1(7-37)链第34位赖氨酸用精氨酸取代，在第26位的赖氨酸上连接由谷氨酸连接的16碳棕榈酸侧链，与人glp-1具有97％的序列同源性，可以结合并激活glp-1r。glp-1经脂肪链修饰后，可以与白蛋白结合，对dpp-4和中性内肽酶(nep)具有更高的酶稳定性，从而具有较长的血浆半衰期。利拉鲁肽的消除半衰期为13h，每日只需注射1次。除降低血糖外，利拉鲁肽通过抑制食欲减少能量摄入从而达到降低体重的目的，但成本和每日注射的需要可能限制其在肥胖症中的应用。
75.利司那肽是每日1次的短效glp-1ra药物，从结构上看，利司那肽是在艾塞那肽结构的基础上去掉第38位的脯氨酸，并在第39位的丝氨酸后连接6个赖氨酸，所述6个赖氨酸残基增加了分子结构的刚性，从而使其药物性质得以改善。与每天注射2～3次的艾塞那肽相比，利司那肽是更加稳定的结构，降低了在体循环中的蛋白降解，延长了循环时间，确保每日注射1次即可。
76.阿必鲁肽是每周1次皮下注射的长效glp-1ra，从结构上看，阿必鲁肽是将glp-1(7-36)链第8位上的丙氨酸用甘氨酸取代，再将2条经修饰的glp-1肽链融合在人血清白蛋白(hsa)上，从而大大延长了半衰期。
77.杜拉鲁肽是每周只需给药1次的长效glp-1ra药物，从结构上看，杜拉鲁肽是将glp-1(7-37)链第8位用甘氨酸取代丙氨酸，第22位用谷氨酸取代甘氨酸，第36位用甘氨酸取代精氨酸，再经
“‑
(gly-gly-gly-gly-ser)3-ala
‑”
偶联桥融合到经修饰的人免疫球蛋白g4(igg4)的恒定区(fc)上，为二聚体结构，平均生物半衰期长达90小时。杜拉鲁肽是首个疗效上与利拉鲁肽相当的大分子glp-1ra。而且，杜拉鲁肽每周给药1次的给药频率能大幅提高患者的依从性。
78.相比于艾塞那肽，利拉鲁肽和利司那肽分别是仅仅30多个氨基酸长度的单链多
肽，杜拉鲁肽为单链275个氨基酸长度的二聚体肽，二者相差将近240个氨基酸长度。以利拉鲁肽为例，杜拉鲁肽的氨基酸长度是利拉鲁肽氨基酸长度的8.9倍，氨基酸长度差距如此之大，本领域技术人员知晓二者的物理化学性质也相距甚远。例如，具有fc区的glp-1-fc融合蛋白涉及fc区域的氧化以及相应的完整主峰损失的问题。现有技术中用于艾塞那肽，利拉鲁肽和利司那肽的稳定性制剂或者稳定化方法并不一定适用于与他们相差大约240个氨基酸长度，并且为双链二聚体结构的杜拉鲁肽。
79.本发明预料之外地发现，在中性偏弱酸性的条件下在55℃-65℃的温度下，加热处理包含glp-1或glp-1类似物的制剂30min-90min的时间，尤其是针对包含fc结构域的glp-1-fc融合蛋白或glp-1类似物fc融合蛋白，所述制剂能够在长达3周的时间片段峰及反相杂质依然保持在较低的水平，相比于未经处理的包含glp-1或glp-1类似的制剂显示显著降低的片段峰和反相杂质。因此，本发明的所述制剂显示显著提高的稳定性。
80.反相色谱结果中除了rp主峰以外的其它部分统称为反相杂质。
81.尤其是，经过所述处理，本发明的制剂在60℃的处理，相比于在50℃和70℃下的处理，在3周的时间单体峰下降速度降低高达40％，片段形式的融合蛋白下降速度也降低将近40％。而且，在0-60分钟的时间内，加热时间越长，单体峰下降速率越低，lmw增长速率越低，glp-1-fc融合蛋白主峰下降速率越低。当加热温度达到60℃时，可以显著降低片段峰及反相杂质的形成，提高制剂稳定性。
82.实施例
83.本发明实施例中使用的glp-1-fc融合蛋白为杜拉鲁肽(dulaglutide)；
84.样品制备：使用cho-k1细胞表达glp-1-fc融合蛋白，纯化后用于后续实验；
85.简写：
86.ps80：聚山梨酯80
87.pfs：预灌封注射器
88.lmw：低分子量
89.hmw：高分子量
90.sec：尺寸排阻
91.反相(rp)色谱用于监控片段形式的glp-1-fc融合蛋白的形成，fc区域的氧化以及相应的完整主峰损失。尺寸排阻(sec)色谱用于监控聚合物的形成和相应的单体损失。
92.通过将含有15mm枸橼酸盐，4.6％甘露醇，ph 6.7的蛋白溶液分别置于不同温度的水浴保持不同时间，进行加热处理，处理完毕后，冷却至室温，加入0.02％ps80，混匀，最后将制剂过0.22um的滤膜，灌装至pfs中，放入40℃稳定箱进行稳定性考察。
93.实施例1
94.加热温度考察：
95.实验设计见下表：
96.[0097][0098]
稳定性结果如下：
[0099][0100]
f4/f5/f6加热后出现大量浑浊沉淀，故取消后续的配液过程。表明加热温度高于70℃时，不利于制剂稳定性。
[0101]
从上表结果可以看出，f3的单体峰下降速率明显低于f1和f2，主要是因为lmw形成速率降低，表明片段峰较少。同时f3的rp主峰下降速率明显低于f1和f2。因此，上述结果表明，当加热温度达到60℃时，可以显著降低片段峰及反相杂质的形成，提高制剂稳定性。
[0102]
实施例2
[0103]
加热时间和加热温度的考察：
[0104]
实验设计见下表：
[0105][0106]
稳定性结果如下：
[0107]
[0108][0109]
从上表可以看出，加热时间越长，sec单体峰下降速率越低，lmw增长速率越低，rp主峰下降速率越低。当加热时间达到60min时，sec单体峰基本无变化，与不加热组别相比，制剂稳定性得到显著改善。