用于治疗脓毒症的抑制剂及其应用的制作方法

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种用于治疗脓毒症的抑制剂及其应用。


背景技术：

2.据统计，脓毒症的发病率高达每100000人发生535例，住院死亡率占25-30％，是目前重症监护病房中发病率和死亡率高的重要原因。它是机体的免疫系统在释放炎症介质后对感染的过度炎症反应，导致异常的生理、病理和生化综合征，多数患者伴有凝血功能的异常，全身性的凝血物质功能激活并伴随大出血风险及多脏器衰竭，同时由于凝血物质反应的增加合并对抗凝血机制受到破坏，部分病人还出现弥散性毛细血管内凝血和血管栓塞。外源性致病菌通过激发机体从出现炎症反应到脓毒症发生的过程中涉及到众多不同种类的细胞功能和细胞因子表达变化，这一进程呈现“瀑布样级联反应”特点，不但很难预测，且发生发展迅速，加上缺少特异性的治疗方法，使得脓毒症的诊治均非常困难，预后较差。
3.虽然脓毒症临床治疗水平和发病机制的认识有所加深，但降低院内死亡率仍主要依靠早期抗生素治疗和多器官支持治疗，针对脓毒症免疫和感染的分子机制靶向治疗仍然缺乏。脓毒症患者通常在免疫抑制后死于继发感染，原因是早期过度激活的炎症反应导致免疫功能障碍，早期病原体入侵激活先天免疫，激活的先天免疫细胞向淋巴细胞提供病原体抗原并激活细胞免疫。免疫细胞释放大量细胞因子以触发促炎和抗炎免疫反应，导致免疫调节紊乱、器官功能障碍或衰竭，甚至死亡。因此，调节早期免疫功能紊乱，防治脓毒症引起的免疫抑制已成为研究重点。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的主要目的在于提供一种用于治疗脓毒症的抑制剂及其应用。
5.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
6.第一方面：一种用于治疗脓毒症的抑制剂，所述抑制剂能够通过减少循环免疫细胞释放细胞因子来达到治疗脓毒症。
7.优选地，其中所述抑制剂为cp-673451，该cp-673451的分子式为：
[0008][0009]
优选地，其中所述脓毒症包括早期脓毒症、严重脓毒症和脓毒症休克。
[0010]
本发明的研究构思如下：本发明人团队发现病人在脓毒症期间，b和t淋巴细胞负
性共刺激因子(btla)在免疫细胞上的表达增加，被认为是导致脓毒症诱导的免疫细胞功能障碍的主要因素之一；早期脓毒症的病理生理机制是“细胞因子风暴”引起的多器官损伤。因此，我们假设促进免疫细胞中btla的表达将加速脓毒症期间免疫细胞的功能障碍，从而减弱“细胞因子风暴”的发展，探索脓毒症的治疗药物。为此，本技术团队利用细胞实验进行商用激酶抑制剂药物库高通量筛选上调btla表达的药物，并在动物模型中进行了蛋白和mrna表达层面的验证，确定出pdgfr信号通路抑制剂(cp-673451)上调btla表达作用最明显；由此发明人将pdgfr通路抑制剂药物用于治疗clp脓毒症小鼠，证实了该药治疗后clp脓毒症小鼠重要脏器功能得到了保护，降低了死亡率。进一步对pdgfr通路抑制剂在脓毒症中保护作用的机制探索发现，使用药物治疗后，可以早期抑制clp脓毒症小鼠体内趋化因子cxcl13、ccl1、ccl2和ccl7的释放，降低外周血和重要器官中b和t淋巴细胞的趋化性，继而降低淋巴细胞产生的抗炎因子il-10的分泌，抑制过度抗炎激活；同时减少髓样细胞产生il-1β等细胞因子，从而抑制t细胞和b细胞的激活，减轻早期过度免疫炎症反应，从而缓解脓毒症，达到治疗脓毒症的目的。
[0011]
第二方面：cp-673451在制备治疗脓毒症的药物中的应用。
[0012]
优选地，其中所述药物的剂型为口服给药。
[0013]
优选地，其中所述cp-673451的有效剂量为20mg/kg。
[0014]
与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：
[0015]
本发明首次发现了cp-673451(pdgfr抑制剂)能够有效治疗脓毒症，尤其有效治疗早期脓毒症；
[0016]
本发明首次发现了cp-673451在脓毒症中调节早期过度免疫炎症反应的治疗作用及机制，并证实cp-673451是一种有效治疗脓毒症的药物，可以降低脓毒症脏器衰竭程度以及死亡率，可以作为脓毒症诊疗的新型药物。
附图说明
[0017]
为了更清楚地说明本发明具体实施方式，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0018]
图1为药物促进或抑制btla表达结果热图；
[0019]
图2为btla在脾脏免疫细胞中的表达流式细胞分析图；
[0020]
图3为表达btla淋巴细胞的占比；
[0021]
图4为在脾脏组织中btla-mrna水平的表达；
[0022]
图5为所述抑制剂治疗脓毒症的生存曲线；
[0023]
图6为所述抑制剂(cp-673451)通过保护肺组织功能降低脓毒症死亡率；
[0024]
图7为脓毒症小鼠的血清细胞因子阵列图定性分析结果；
[0025]
图8为脓毒症小鼠的血清细胞因子液相芯片定量分析结果；
[0026]
图9为细胞因子在细胞和组织中的qpcr验证结果。
具体实施方式
[0027]
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非
全部。
[0028]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0029]
本发明前期做了关于大量脓毒症治疗药物的筛选，发现cp-673451可以通过降低循环免疫细胞产生和释放细胞因子、趋化因子等免疫介质，降低脓毒症死亡率，可以作为一种有效的脓毒症治疗药物。具体为：
[0030]
首先，筛选鉴定生物活性化合物pdgfr抑制剂上调btla表达。脓毒症期间，b和t淋巴细胞负性共刺激因子(btla)在免疫细胞上的表达增加，被认为是导致脓毒症诱导的免疫细胞功能障碍的主要因素之一。早期脓毒症的病理生理机制是“细胞因子风暴”引起的多器官损伤。因此，我们假设促进免疫细胞中btla的表达将加速脓毒症期间免疫细胞的功能障碍，从而减弱“细胞因子风暴”的发展，探索脓毒症的治疗药物。因此，我们筛选了一个高选择性激酶抑制剂商用药物库通过细胞内western blot检测raw264.7巨噬细胞btla的表达，部分靶向选择性抑制剂促进或降低巨噬细胞中btla的表达。
[0031]
为了更为直观和准确的比较结果，我们将促进和降低btla在raw264.7细胞中表达最明显的20种药物的结果数值转化为热图呈现，具体结果如图1所示，从图1中可以看出，其中促进btla上调的前10的药物包括：cp-673451(血小板衍生生长因子受体抑制剂，pdgfr)，sgi-7079(组蛋白甲基转移酶抑制剂)，ptc-209hbr(b细胞特异性莫罗尼小鼠白血病病毒插入位点1，bmi-1抑制剂)，pr-619(二氢喹氨酰化酶抑制剂，dubs)，奥卡西平(钠通道抑制剂)，gw2580(集落刺激因子-1受体抑制剂，csf-1r)，azd3463(间变性淋巴瘤激酶抑制剂，alk)，普拉特雷酯(二氢叶酸还原酶抑制剂，dhfr)，ldc000067(细胞周期蛋白依赖性激酶9，cdk9的抑制剂)，ddr1-in-1(盘状结构域受体1，ddr1的抑制剂)，其中上调btla表达最强的药物是pdgfr抑制剂cp-673451，因此下述实施例中均选用pdgfr抑制剂cp-673451进行试验。
[0032]
本技术中脓毒症动物模型制作和给药方式如下：
[0033]
雄性c57bl/6小鼠(8周龄，22
±
1g)通过手术诱发脓毒症：
[0034]
1)浓度为3％和2％异氟烷分别用于诱导和维持麻醉；
[0035]
2)沿小鼠腹正中线切开，切口大小1cm左右。夹出盲肠外置，距离盲肠远端1cm处，采用4.0#丝线扎紧；
[0036]
3)在结扎盲肠远端中部用16号注射器针头穿透盲肠，将其收纳回腹部，并逐层缝合；
[0037]
4)给小鼠皮下注射1ml复方氯化钠注射液，小鼠在盲肠结扎穿刺后未服用抗生素；
[0038]
5)将小鼠随机分为对照组(clp组)和治疗组(clp cp-673451组)：其中clp cp-673451组小鼠分别在clp(盲肠结扎穿孔)脓毒症模型小鼠建立后2、24、48和72小时通过口服给予实验药物(20mg/kg，每日一次)，而其中clp组小鼠接受等量的磷酸盐缓冲液(ph值7.2
–
7.4)。
[0039]
实施例1：cp-673451对脓毒症模型小鼠btla表达的影响
[0040]
为了验证cp-673451对脓毒症模型小鼠btla表达的影响，本技术利用雄性c57bl/6小鼠(8周龄，22
±
1g)，构建小鼠盲肠结扎穿孔脓毒症模型(按照前述脓毒症动物模型制作方法构建盲肠结扎穿孔脓毒症模型小鼠)，取clp造模后第1天小鼠的脾脏进行流式细胞分
析，具体如图2和图3所示，从图中可以发现经过cp-673451治疗后小鼠脾脏免疫细胞中btla表达量高于对照组；而且cp-673451主要上调了小鼠脾脏中cd4

、cd8

t淋巴细胞和b淋巴细胞中的btla表达水平，在cd4

t淋巴细胞(p＝0.02)和b淋巴细胞(p＝0.001)中促进作用最为明显，具有统计学意义。
[0041]
另外，对clp组与clp cp-673451治疗组进行btla-mrna荧光定量pcr检测，具体如图4所示，从图中可以看出btla-mrna的表达与btla蛋白表达趋势一致，cp-673451也增加了clp造模后第1、3天小鼠脾脏细胞中btla信使核糖核酸(mrna)表达水平的升高，且差异具有统计学意义。
[0042]
实施例2：cp-673451对脓毒症模型小鼠存活率的影响
[0043]
为了验证cp-673451治疗对脓毒症模型小鼠7天存活率的影响。构建小鼠盲肠结扎和穿孔(clp)模型后，观察并记录小鼠的生存率；结果如图5所示，和对照组相比，使用cp-673451的治疗组(clp造模后2、24、48和72小时给予cp-673451口服治疗)增加了小鼠的存活率，且差异具有统计学意义(n＝25；p＝0.015)，说明cp-673451有效提高了小鼠的生存率。
[0044]
实施例3：cp-673451对脓毒症模型小鼠重要器官的影响
[0045]
为了验证cp-673451对脓毒症小鼠重要器官的影响，本技术团队在clp造模后2、24、48和72小时分别予以cp-673451口服治疗，其中取clp造模后第1天小鼠的肺脏组织进行苏木精和伊红染色观察肺组织病理变化，结果如图6所示，从图中可以看出，正常对照组小鼠肺组织肺泡完整，无炎症细胞浸润，无肺泡间隔增厚；而脓毒症组肺组织有大量炎症细胞浸润，肺泡损伤严重，明显肺间隔增厚；cp-673451治疗组肺组织局部少量炎症浸润，无明显肺泡破损，局部少量肺泡间隔增厚。经过cp-673451治疗后的肺组织和clp组比较，肺泡结构完整，炎症细胞浸润程度和肺泡间隔增厚均有减轻，说明cp-673451能够有效治疗脓毒症引起的肺损伤。
[0046]
实施例4：cp-673451对脓毒症模型小鼠细胞因子水平的影响
[0047]
细胞因子的产生和释放是淋巴细胞参与免疫应答的关键。研究发现，脓毒症期间淋巴细胞是参与脓毒症“细胞因子风暴”的重要细胞。脓毒症的严重程度与“细胞因子风暴”有关，因此控制“细胞因子风暴”以减少宿主抗感染反应引起的自身损害是合理的；btla在脓毒症期间调节淋巴细胞活动中发挥了作用。因此，为了验证btla通过调节细胞因子的释放来调节淋巴细胞的活性。我们首先通过小鼠细胞因子阵列试剂盒观察了cp-673451对脓毒症模型小鼠细胞因子水平的影响，该试剂盒可同时检测111种小鼠细胞因子的表达。首先收集正常对照组、clp组、clp cp-673451组血浆，其中clp组、clp cp-673451组取造模后24和72小时样本；然后根据小鼠细胞因子阵列试剂盒操作步骤，进行实验检测；另外，采用液相芯片试剂盒对clp组、clp cp-673451组造模后，24小时血浆中细胞因子的变化进行更全面检测，根据液相芯片试剂盒操作步骤进行实验操作；最后结合细胞因子阵列和细胞因子液相芯片检测实验结果，筛选出ccl1、ccl2、ccl7、ccl17、ccl27、cxcl11、il-1β、il-2、il-4、il-6、il-10、tnf-α、cxcl13因子，并采用荧光定量pcr对上述因子mrna表达变化进行验证。首先，构建lps刺激raw264.7细胞炎症模型，采用200ng/ul lps刺激raw264.7细胞，并在刺激8、16和24小时收集细胞样本，提取rna，进行上述因子荧光定量pcr的检测；然后，构建clp小鼠模型，造模后24小时取材，游离出肝组织和脾脏，提取rna，进行上述因子荧光定量pcr的检测。
[0048]
细胞因子阵列试剂盒定性检测结果显示，脓毒症后cxcl13、ang-2、ccl11、cxcl1、il-6和il-1ra的释放增加，但采用cp-673451治疗后明显减少约28.5
±
3.59％；相比之下，采用cp-673451治疗后，igfbp-5、cxcl5和igfbp-2的释放均减少约32.4％
±
2.69％，其中cxcl13因子在小鼠脓毒症和cp-673451给药治疗后变化最明显(图7)；液相芯片细胞因子检测实验结果显示，clp组中ccl1,ccl2,ccl7,ccl17,ccl27,cxcl11，il-1β,il-2,il-4,il-6,il-10,tnf-α因子在脓毒症24小时显著增高，cp-673451治疗组ccl1，ccl2，ccl7，ccl17，ccl27，cxcl11，il-1β，il-2，il-4，il-6，il-10，tnf-α因子在给药治疗24小时显著降低(图8)；荧光定量pcr进行给药治疗后细胞因子m-rna表达验证(图9a，b)，结果显示：cxcl13、ccl1、ccl2，ccl7，il-1β和il-10是具有统计学差异。通过细胞因子阵列、细胞因子液相芯片、荧光定量pcr，从蛋白表达、mrna表达共同证实脓毒症后给予cp-673451治疗是通过上调btla，抑制细胞因子cxcl13、ccl1、ccl2，ccl7，il-1β和il-10来调节淋巴细胞活性和炎症反应，达到抑制机体炎症因子风暴，降低脏器损伤。
[0049]
综上所述，本发明发现并验证了脓毒症治疗药物cp-673451，该药物通过抑制循环免疫细胞释放细胞因子il-10、il-1β和趋化因子cxcl13、ccl1、ccl2和ccl7的释放，降低循环外周血和重要器官中b和t淋巴细胞趋化性，通过抑制脓毒症过度炎症反应，保护重要脏器功能，降低脓毒症死亡率。因此，cp-673451是一种有效的脓毒症治疗药物，在脓毒症患者的治疗中有重要临床应用前景和价值。
[0050]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。