一种肾病的细胞治疗药物及其制备方法、应用与流程

1.本发明涉及药物制备技术领域，特别涉及一种肾病的细胞治疗药物及其制备方法、应用。


背景技术：

2.肾病综合症(nephrotic syndrome,ns)是由多种病因引起肾脏疾病的临床综合征，通常表现为大量蛋白尿、低蛋白血症，并伴有高血脂症和不同程度的水肿现象，严重时可导致肾衰竭。肾病综合症为肾内科常见病、多发病，发病原因可由多种因素造成，现有并未有针对性的治疗，通常采用激素疗法、免疫抑制剂，或是生物制剂联合激素疗法。但免疫抑制剂可能会引起药物抵抗现象，也会具有一定的毒副反应，过多的激素治疗也会导致感染、产生不良的副作用。
3.间充质干细胞(mesenchymal stem cells,msc)是一种多能干细胞，在特定的诱导条件下，具有不同的多向分化潜能和增殖能力，可以用作衰老或病变的组织器官的损伤修复。因此，可利用间充质干细胞用于治疗肾病综合征，以期提高治疗效果时，减少毒副反应的产生。但间充质干细胞的免疫细胞较为幼稚，功能活性较低，且个体性能不统一，易受感染。目前，亟需寻找有效药物采用联合方式，辅以间充质干细胞发挥功效。


技术实现要素：

4.鉴于此，本发明的目的在于提出一种肾病的细胞治疗药物及其制备方法、应用，解决上述问题。
5.本发明的技术方案是这样实现的：
6.一种肾病的细胞治疗药物，包括以下重量份的原料：间充质干细胞复合液34-38份、刺梨提取物15-25份、积雪草苷12-22份、草果酚酸10-18份、葡萄糖酸钙8-12份、胆碱2-6份和核黄素0.1-0.2份。优选地，间充质干细胞复合液36份、刺梨提取物20份、积雪草苷18份、草果酚酸14份、葡萄糖酸钙10份、胆碱4份和核黄素0.2份。
7.进一步说明，该间充质干细胞复合液的制备方法包括以下步骤：
8.(1)取哺乳动物的脂肪组织，破碎，加入磷酸盐缓冲液，4000-5000r/min离心5-8min，弃去上清液，在沉淀中加入复合酶，36-38℃消化5-8min，加入含8-10％胎牛血清的dmem/f12培养基，搅拌，得消化液；所述哺乳动物的脂肪组织、磷酸盐缓冲液、培养基和复合酶的质量比为1：3-4：3-4：0.2-0.4；
9.(2)按质量比为1：0.2-0.3：0.7-0.8，取消化液，加入羧甲基壳聚糖和甘露聚糖肽溶液，以36-38℃、体积浓度5-6％co2条件，培养50-55h后，过滤，得间充质干细胞复合液。
10.进一步说明，步骤(1)中，哺乳动物的脂肪组织、磷酸盐缓冲液、培养基和复合酶的质量比为1：4：4：0.3。
11.进一步说明，步骤(1)中，复合酶为质量比为1：2的胰酶和胶原酶组成。
12.进一步说明，步骤(2)中，消化液、羧甲基壳聚糖和甘露聚糖肽溶液的质量比为1：
0.2：0.8或1：0.3：0.7。
13.进一步说明，刺梨提取物的制备方法包括以下步骤：取刺梨果实，粉碎，加入10倍水熬煮30-40min，得熬煮液；以熬煮液计，加入等量的质量浓度50％乙醇溶液，以吸收剂量4-5kgy，采用
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coγ射线辐照处理30min，过滤，回收乙醇溶液，减压浓缩，得刺梨提取物。
14.进一步说明，该肾病的细胞治疗药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在间充质干细胞复合液中加入刺梨提取物，32-35℃、120r/min搅拌30min，加入积雪草苷、草果酚酸、葡萄糖酸钙、胆碱和核黄素，混合，得肾病的细胞治疗药物。
15.进一步说明，本发明制备的肾病的细胞治疗药物可在预防或治疗肾病综合征的应用。
16.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
17.本发明精挑选间充质干细胞复合液、刺梨提取物、积雪草苷、草果酚酸、葡萄糖酸钙、胆碱和核黄素，科学配比，制备成可用于治疗肾病综合征的细胞治疗药物，组分间相互协同，充分发挥充质干细胞的免疫调节、组织修复功能；胆碱和核黄素与积雪草苷、草果酚酸协同，可形成信号通道，有利于刺激细胞，激发人体免疫系统多个环节，活化间充质干细胞复合液，发挥调理机体免疫的功能，促进机体免疫细胞恢复正常的状态，可起到有效抑制肾脏的纤维化和增殖肥厚；同时，细胞治疗药物含有刺梨提取物、积雪草苷、草果酚酸等多种活性成分，可提高机体对病原微生物的杀伤作用，并抑制炎症细胞的激活，减少并发症、加重机体反应的产生，并提高机体白蛋白的水平。
18.此外，本发明采用羧甲基壳聚糖和甘露聚糖肽制备间充质干细胞复合液，可充分提高间充质干细胞的活性，避免受外界污染，采用
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coγ射线辐照处理刺梨，可进一步协同增强充质干细胞的炎症趋向性，可充分降低白介素-6和基质细胞衍生因子-1的水平，有效改善肾脏的炎症反应，对肾脏组织具有一定的保护作用。
具体实施方式
19.为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
20.本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
21.本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
22.实施例1-2
23.根据配方表成分，制备该肾病的细胞治疗药物，具体步骤为：在间充质干细胞复合液中加入刺梨提取物，35℃、120r/min搅拌30min，加入积雪草苷、草果酚酸、葡萄糖酸钙、胆碱和核黄素，混合，得细胞治疗药物。
24.配方表1
[0025][0026][0027]
其中，间充质干细胞复合液的制备方法包括以下步骤：
[0028]
(1)按质量比为1：3：3：0.2，取哺乳动物的脂肪组织，破碎，加入磷酸盐缓冲液，4500r/min离心6min，弃去上清液，在沉淀中加入质量比为1：2的胰酶和胶原酶组成的复合酶，37℃消化6min，加入含8％胎牛血清的dmem/f12培养基，搅拌，得消化液；
[0029]
(2)按质量比为1：0.3：0.7，取消化液，加入羧甲基壳聚糖和甘露聚糖肽溶液，以37℃、体积浓度5％co2条件，培养50h后，过滤，得间充质干细胞复合液。
[0030]
刺梨提取物的制备方法包括以下步骤：取刺梨果实，粉碎，加入10倍水熬煮30min，得熬煮液；以熬煮液计，加入等量的质量浓度50％乙醇溶液，以吸收剂量4kgy，采用
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coγ射线辐照处理30min，过滤，回收乙醇溶液，减压浓缩，得刺梨提取物。
[0031]
实施例3
[0032]
根据实施例1相同的成分配方和肾病的细胞治疗药物的制备方法，区别在于间充质干细胞复合液和刺梨提取物的制备方法进行调整：
[0033]
该间充质干细胞复合液的制备方法包括以下步骤：
[0034]
(1)按质量比为1：4：4：0.3，取哺乳动物的脂肪组织，破碎，加入磷酸盐缓冲液，4500r/min离心6min，弃去上清液，在沉淀中加入质量比为1：2的胰酶和胶原酶组成的复合酶，37℃消化6min，加入含8％胎牛血清的dmem/f12培养基，搅拌，得消化液；
[0035]
(2)按质量比为1：0.2：0.8，取消化液，加入羧甲基壳聚糖和甘露聚糖肽溶液，以37℃、体积浓度5％co2条件，培养55h后，过滤，得间充质干细胞复合液。
[0036]
刺梨提取物的制备方法包括以下步骤：取刺梨果实，粉碎，加入10倍水熬煮40min，得熬煮液；以熬煮液计，加入等量的质量浓度50％乙醇溶液，以吸收剂量5kgy，采用
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coγ射线辐照处理30min，过滤，回收乙醇溶液，减压浓缩，得刺梨提取物。
[0037]
实施例4
[0038]
根据实施例3相同的成分配方、原料制备方法，区别在于，该肾病的细胞治疗药物的制备方法不同，具体步骤为：在间充质干细胞复合液中加入刺梨提取物、积雪草苷、草果酚酸、葡萄糖酸钙、胆碱和核黄素，35℃、120r/min搅拌30min，得肾病的细胞治疗药物。
[0039]
对比例1-2
[0040]
根据配方表成分，根据实施例3的相同原料制备方法和制备该肾病的细胞治疗药物，得相应的细胞治疗药物。
[0041]
配方表2
[0042]
配方(g)对比例1对比例2间充质干细胞复合液4038刺梨提取物525积雪草苷3022草果酚酸1418葡萄糖酸钙1012胆碱4-核黄素0.2-[0043]
对比例3
[0044]
根据实施例3相同的成分配方和肾病的细胞治疗药物的制备方法，区别在于采用间充质干细胞培养液替换间充质干细胞复合液，间充质干细胞培养液的制备方法：取哺乳动物的脂肪组织，破碎，加入磷酸盐缓冲液，4500r/min离心6min，弃去上清液，在沉淀中质量比为1：2的胰酶和胶原酶组成的复合酶，37℃消化6min，加入含10％胎牛血清的dmem/f12培养基，搅拌，4500r/min离心6min，弃去上清液，采用磷酸盐缓冲液重悬，得间充质干细胞培养液。
[0045]
对比例4
[0046]
根据实施例3相同的成分配方和肾病的细胞治疗药物的制备方法，区别在于采用刺梨汁替换刺梨提取物，刺梨汁的制备方法：取刺梨果实，粉碎，加入10倍水熬煮30-40min，过滤，得刺梨汁。
[0047]
试验例-小鼠肾病综合征的治疗实验
[0048]
取ns模型小鼠80只，每组10只，作为实验组，每组每日给药一次，采用生理盐水将本发明制备的肾药的细胞治疗药物稀释至细胞密度为1
×
105个，剂量为0.2ml/10g，取ns模型小鼠10只作为对照组，给予等量的生理盐水，另取健康小鼠10只作为空白组，给予等量的生理盐水，每组连续给药7周，采用腹腔注射给药，小鼠体重为30～35g，实验期间自由取食、饮水，在最后一次给药5h后处死各组小鼠，分别取血清，采用流式细胞仪检测t淋巴细胞的数量，计算t淋巴细胞的cd4

/cd8

比值，采用白介素-6检测试剂盒检测白细胞介素-6(interleukin-6，简称il-6)含量，采用全自动生化分析仪检测白蛋白含量；分别取出小鼠肾脏，用冰盐水反复冲洗至无血液，用pbs溶液冲洗后，采用elisa法测定基质细胞衍生因子-1(sdf-1)和环氧化酶cox-2，于530nm处测定吸光度，测定结果以ng/ml蛋白表示，实验结果如下表3：
[0049][0050][0051]
由上表可知，采用本发明实施例1-3制备的细胞治疗药物，可调节cd4

/cd8

的比例平衡，避免免疫系统功能紊乱和引发机体强烈的免疫应答，同时，降低肾组织中白介素-6、基质细胞衍生因子-1和环氧化酶的含量，提升血液中白蛋白含量，可有效改善炎症反应，并无不良反应出现，表明本发明选用间充质干细胞复合液、刺梨提取物、积雪草苷、草果酚酸、葡萄糖酸钙、胆碱和核黄素，科学配比，可有效清除抗原，抑制肾脏的纤维化和增殖肥厚，组分协同，提升对肾病综合症的治疗效果。
[0052]
对比例1-2调整配方组分，不能使组分协同发挥机体免疫调节的功能，cd4

/cd8

的比例偏低；对比例3采用间充质干细胞培养液替换间充质干细胞复合液，表明羧甲基壳聚糖和甘露聚糖肽可充分提高间充质干细胞的功能活性，避免感染；对比例4采用刺梨汁替换刺梨提取物，活性成分减少，对环氧化酶的抑制作用低，白蛋白水平提升不明显。
[0053]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。