一种混合物及其制备方法与流程

1.本发明涉及医用材料技术领域，具体的涉及一种栓塞微球包载大分子药物的制备方法，尤其是涉及包载贝伐单抗药物微球的制备方法。


背景技术：

2.经导管动脉化疗栓塞术(tace),是用导管选择肿瘤供血动脉，将栓塞物注入到病变器官的供应血管内。对于目前不能接受肿瘤切除、肝移植的hcc患者，tace已经成为肝癌治疗的核心手段。目前研究以及应用最为广泛的栓塞剂为栓塞微球。然而，tace的一个主要局限性是残余存活肿瘤会通过激活大量低氧反应基因的表达来诱导血管内皮生长因子(vegf)的持续表达，这导致了新生血管的形成和微血管密度的增加，最终限制了其治疗效果。
3.贝伐单抗是重组的人源化单克隆抗体，是美国第一个获得fda批准上市的抑制肿瘤血管生成的药物，能有效抑制vegf的表达。然而，目前研究表明栓塞微球对贝伐单抗的释药时间为6小时，短暂的释药时间限制了药物在临床上的应用。
4.因此，延长栓塞微球对贝伐单抗的缓释时间对于临床研究具有重要意义，这可以更大程度的提高临床治疗效果。


技术实现要素：

5.本发明在于提供一种包载贝伐单抗栓塞微球的制备方法，以提高栓塞微球对大分子药物的包载，延长药物在栓塞微球内的释放时间。
6.本发明的一个方面，提供了一种混合物，包括：栓塞微球，冻干保护剂，大分子药物，聚电解质，所述聚电解质薄膜通过静电作用与所述大分子药物互相吸附。
7.作为一种优选方案，所述聚电解质包括正电荷聚电解质、负电荷聚电解质。
8.作为一种优选方案，所述正电荷聚电解质包括聚赖氨酸、羧甲基壳聚糖，所述负电荷聚电解质包括海藻酸钠、聚天冬氨酸、透明质酸钠、羧甲基纤维素钠。
9.作为一种优选方案，所述正电荷聚电解质和所述负电荷聚电解质为可降解聚电解质。
10.作为一种优选方案，所述大分子药物包括贝伐单抗，且所述大分子药物的浓度选取5mg/ml-20mg/ml范围内任一浓度值。
11.本发明的第二方面，提供了一种混合物的制备方法，包括：
12.(1)栓塞微球的冻干处理：将所述栓塞微球去除水分，加入1％-3％浓度的蔗糖溶液作为所述冻干保护剂冻干栓塞微球，得冻干球；
13.(2)对大分子药物的包载：将所述冻干球与所述大分子药物的溶液混合，得载药微球；
14.(3)聚电解质膜的包覆：将所述载药微球置于所述负电荷聚电解质的溶液中，温和震荡混合，将混合溶液静置并去除上清液，使用纯化水清洗，后将所述正电荷聚电解质的溶
液加入，温和震荡混合，将混合溶液静置并去除上清液，使用纯化水清洗，重复加入所述负电荷聚电解质的溶液和所述正电荷聚电解质的溶液，得多层聚电解质薄膜。
15.作为一种优选方案，所述负电荷聚电解质的溶液和所述正电荷聚电解质溶液浓度选取0.5mg/ml-2.0mg/ml范围内任一浓度值。
16.作为一种优选方案，在加入下一层聚电解质溶液前，重复2-3遍洗涤步骤。
17.作为一种优选方案，所用的海藻酸钠分子量为10万-150万，聚赖氨酸分子量为10万-150万。
18.作为优选，载药微球外层包裹的聚电解质膜层数大于等于两层时，药物缓释效果优异。
19.本发明的技术方案可以实现以下积极效果：
20.使用冻干法包载大分子药物贝伐单抗，能够有效提高药物载药效率。
21.利用静电吸引的基本原理，微球与带正电的大分子药物结合，使得药物吸附在栓塞微球上，负电荷聚电解质吸附在大分子药物表面，正电荷聚电解质吸附在负电荷聚电解质上，从而使得栓塞微球表面形成聚电解质薄膜，聚电解质薄膜可以减缓大分子药物的释放时间，达到缓释的目的。
22.所选用的聚合物均适用于临床，生物相容性优异，在临床应用中安全系数高。
具体实施方式
23.栓塞微球对大分子药物的包载
24.实施例1
25.将贝伐单抗用注射用水溶解为5mg/ml-20mg/ml备用。用滤纸吸除微球水分，称取1g微球，取2.5ml-10ml贝伐单抗溶液加入至微球内，在室温下温和震荡120min，在预先选择的时间点(5、30、60和120分钟)提取150μl上清液。通过高效液相色谱检测上清液药物的浓度，通过差量法得到微球载药效率，记为a1。
26.实施例2
27.将贝伐单抗用注射用水溶解为5mg/ml-20mg/ml备用。用滤纸吸除微球水分，称取1g微球，加入1ml-10ml浓度为1％-3％的蔗糖作为冻干保护剂，将其放置于-20℃冰箱进行冷冻，用冻干机将微球冻干。取2.5ml-10ml贝伐单抗溶液加入至冻干后的微球内，在室温下温和震荡120min，在预先选择的时间点(5、30、60和120分钟)提取150μl上清液。通过高效液相色谱检测上清液药物的浓度，通过差量法得到微球载药效率，记为a2。
28.在微球表面覆盖聚电解质膜
29.实施例3
30.选取带负电的海藻酸钠和带正电荷的聚赖氨酸作为生物可降解聚电解质，称取5mg-20mg海藻酸钠，加入10ml ph为5.0-7.0的注射用水，最终浓度为0.5mg/ml-2.0mg/ml。采用逐层堆积方法，首先将0.5ml-2.0ml海藻酸钠聚电解质溶液添加到实施例2所述载药微球溶液中，温和震荡混合15min-60min，然后将混合溶液静置并去除上清液，加入10ml纯化水清洗多余的海藻酸钠溶液，该清洗步骤重复两次。将10ml浓度为0.5ml-2.0ml聚赖氨酸聚电解质溶液添加到载药微球溶液中，温和震荡混合15min-60min，将混合溶液静置并去除上清液，加入10ml纯化水清洗多余的聚电解质，该清洗步骤重复两次。所有上清液及洗涤液均
需要收集在小瓶内保存，并通过hplc方法检测上清液及洗涤液内贝伐单抗浓度，得到在包裹一层电解质薄膜后微球实际载药效率，记为a3。
31.实施例4
32.选取实施例3包裹一层电解质薄膜样品，首先加入0.5ml-2.0ml海藻酸钠聚电解质溶液，温和震荡混合15min-60min，然后将混合溶液静置并去除上清液，加入10ml纯化水清洗多余的海藻酸钠溶液，该清洗步骤重复两次。将10ml浓度为0.5ml-2.0ml聚赖氨酸聚电解质溶液添加到载药微球溶液中，温和震荡混合15min-60min，将混合溶液静置并去除上清液，将10ml浓度为0.5ml-2.0ml聚赖氨酸聚电解质溶液添加到载药微球溶液中，温和震荡混合15min-60min，将混合溶液静置并去除上清液，加入10ml纯化水清洗多余的聚电解质，该清洗步骤重复两次。所有上清液及洗涤液均需要收集在小瓶内保存，并通过hplc检测上清液及洗涤液内贝伐单抗浓度，得到在包裹两层电解质薄膜后微球实际载药效率，记为a4。
33.以上实施例中关于载药数据a1、a2、a3、a4的详细数据详见表1。
34.实施例5
35.选取带负电的透明质酸钠和带正电荷的聚赖氨酸作为生物可降解聚电解质，称取5mg-20mg透明质酸钠，加入10ml ph为5.0-7.0的注射用水，最终浓度为0.5mg/ml-2.0mg/ml。采用逐层堆积方法，首先将0.5ml-2.0ml透明质酸钠聚电解质溶液添加到实施例1和实施例2所述载药微球溶液中，温和震荡混合15min-60min，然后将混合溶液静置并去除上清液，加入10ml纯化水清洗多余的透明质酸钠溶液，该清洗步骤重复两次。将10ml浓度为0.5ml-2.0ml聚赖氨酸聚电解质溶液添加到载药微球溶液中，温和震荡混合15min-60min，将混合溶液静置并去除上清液，加入10ml纯化水清洗多余的聚电解质，该清洗步骤重复两次。重复加入海藻酸钠和聚赖氨酸电解质，得到两层聚电解质薄膜。
36.实施例6
37.选取带负电的羧甲基纤维素钠和带正电荷的聚赖氨酸作为生物可降解聚电解质，称取5mg-20mg羧甲基纤维素钠，加入10ml ph为5.0-7.0的注射用水，最终浓度为0.5mg/ml-2.0mg/ml。采用逐层堆积方法，首先将0.5ml-2.0ml羧甲基纤维素钠聚电解质溶液添加到实施例1和实施例2所述载药微球溶液中，温和震荡混合15min-60min，然后将混合溶液静置并去除上清液，加入10ml纯化水清洗多余的羧甲基纤维素钠溶液，该清洗步骤重复两次。将10ml浓度为0.5ml-2.0ml聚赖氨酸聚电解质溶液添加到载药微球溶液中，温和震荡混合15min-60min，将混合溶液静置并去除上清液，加入10ml纯化水清洗多余的聚电解质，该清洗步骤重复两次。重复加入海藻酸钠和聚赖氨酸电解质，得到两层聚电解质薄膜。
38.实施例7
39.选取带负电的海藻酸钠和带正电荷的羧甲基壳聚糖作为生物可降解聚电解质，称取5mg-20mg海藻酸钠，加入10ml ph为5.0-7.0的注射用水，最终浓度为0.5mg/ml-2.0mg/ml。采用逐层堆积方法，首先将0.5ml-2.0ml海藻酸钠聚电解质溶液添加到实施例1和实施例2所述载药微球溶液中，温和震荡混合15min-60min，然后将混合溶液静置并去除上清液，加入10ml纯化水清洗多余的海藻酸钠溶液，该清洗步骤重复两次。将10ml浓度为0.5ml-2.0ml羧甲基壳聚糖聚电解质溶液添加到载药微球溶液中，温和震荡混合15min-60min，将混合溶液静置并去除上清液，加入10ml纯化水清洗多余的聚电解质，该清洗步骤重复两次。重复加入海藻酸钠和聚赖氨酸电解质，得到两层聚电解质薄膜。
40.载药微球体外模拟释药实验
41.实施例8
42.载药后的微球在模拟人体生理环境的磷酸盐缓冲液(pbs,ph＝7.4，10mm)中进行释放，载药后的微球过滤掉上清液，用新鲜磷酸盐缓冲液(pbs,ph 7.4，10mm)清洗表面后，称取0.2g放入装有50ml磷酸盐缓冲液(pbs,ph 7.4，10mm)的密闭玻璃管中并置于37℃恒温箱中进行释放，在0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，12h，24h，36h，48h取出4ml释放介质，再补充相同体积的新鲜介质。取出的溶液通过hplc法测试累计释放率，未加聚电解质膜组记为b1，载药微球外加1层聚电解质膜组记为b2，载药微球外加2层聚电解质膜组记为b3，相关数据详见表2。
43.表1载药效率对照表格
[0044][0045]
由表1可知，通过将微球冻干，再加入贝伐单抗可以大幅提升微球载药量及载药效率。这是因为微球在冻干后再加入贝伐单抗，除了静电吸附作用力之外，微球内吸力能极大提高其载药效率。通过比较a2、a3、a4数据可以发现，在载药微球外包裹聚电解质膜不会影响最终的载药效率。
[0046]
表2各组载药微球的累计释放率(％)
[0047][0048][0049]
从表2中可以得知，b1组为未加聚电解质膜的累积释放率，0.5h时的累计释放率便高达52.9％，48h后的累积释放率达到92.3％；当对载药微球外加一层聚电解质膜时，b2组显示0.5h时累计释放率为27.5％，4h后累积释放率超过50％；而当对载药微球外加两层聚电解质膜时，b3组显示0.5h的累计释放率仅为9.2％，48h后的累计释放率也仅有43.2％，这表明聚电解质膜可以延缓大分子药物的释放，达到缓释的目的。