一种人参黄精植物饮料及其制备方法与流程

1.本发明属于饮料制备技术领域，尤其涉及一种人参黄精植物饮料及其制备方法。


背景技术：

2.随着现今社会的发展，生活节奏不断加快，各种压力驱使下人们常常处于睡眠不足、精神萎靡、疲乏无力等亚健康状态，导致免疫力低下，使人容易受到疾病的侵袭。此外，由于当代社会人的超负荷脑力和体力劳动，导致人经常熬夜，加重了机体的消耗，所以一般会出现体质虚弱、精神萎靡、疲乏无力。近年来，中药在抗疲劳方面的应用受到国内外学者的广泛重视。中药毒副作用低，无兴奋中枢、引起焦虑、引发心血管疾病等弊端，并且具有效果明显的优势。
3.但是目前采用中药来实现抗疲劳，改善亚健康状态还存在气味口感欠佳，大众接受度较低，药材利用率低等缺点。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种人参黄精植物饮料及其制备方法，采用药食同源的中药原料，通过酶解、熬制、提取、发酵和澄清等步骤制备而成，极大的提高了原料的利用率，并提高了原料中活性物质的种类和含量，不含添加剂、防腐剂，口感酸甜可口，回味有淡淡的中药清香味，具有明显的提神醒脑抗疲劳的作用。
5.本发明提供了一种人参黄精植物饮料，由包括以下组分的原料制备而成：
6.覆盆子3～8份，肉苁蓉20～29份，人参10～20份，黄精12～18份，甘草4～8份，黑桑葚3～8份，黑玛咖3～8份，大枣3～8份，山药3～8份，枸杞4～8份，芡实4～8份。
7.优选的，由包括以下组分的原料制备而成：
8.覆盆子4～7份，肉苁蓉22～28份，人参12～18份，黄精14～16份，甘草5～7份，黑桑葚4～7份，黑玛咖4～7份，大枣4～7份，山药4～7份，枸杞6.5～7.5份，芡实5～7份。
9.本发明提供了所述人参黄精植物饮料的制备方法，包括以下步骤：
10.1)将覆盆子、肉苁蓉、人参、黄精、甘草、黑桑葚、黑玛咖、大枣、山药、枸杞和芡实混合，用纤维素酶液浸泡、然后加水进行第一熬制，固液分离获得第一提取液和第一滤渣；
11.2)将所述第一滤渣与水混合，进行第二熬制，固液分离获得第二提取液和第二滤渣；
12.3)将所述第一提取液和所述第二提取液混合获得药汁；
13.4)向所述药汁中接入发酵剂进行发酵浸提得发酵浸提液；
14.5)将所述发酵浸提液与澄清剂混合、澄清，静置后过滤获得所述人参黄精植物饮料。
15.优选的，步骤1)中所述纤维素酶液中纤维素酶的含量为10～15wt％，所述浸泡的时间为30～60min。
16.优选的，所述第一熬制的时间为2～5h，所述第一熬制用水的质量为原料总质量的
15～20倍。
17.优选的，步骤2)所述第二熬制的时间为1～3h，所述第二熬制用水的质量为原料总质量的5～10倍。
18.优选的，步骤4)所述的发酵剂包括保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜热链球菌、双歧杆菌和植物乳杆菌中的两种以上。
19.优选的，所述发酵剂的接入浓度为0.1
×
109～1
×
109cfu/l。
20.优选的，所述发酵浸提的温度为36～38℃，所述发酵浸提的时间为60～72h。
21.优选的，所述发酵浸提液与澄清剂的质量比为100：1～8；所述澄清的温度为34～36℃，所述静置的时间为12～16h。
22.本发明还提供了一种抗疲劳药物制剂，包括所述人参黄精植物饮料。
23.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供的抗疲劳人参黄精植物饮料是由多种道地药材熬制而成，不含添加剂、防腐剂，辅以黑桑葚、甘草、枸杞和大枣提高产品的甘味，口感酸甜可口，回味有淡淡的中药清香味，具有明显的提神醒脑抗疲劳的作用。本发明通过提取、发酵、澄清等工艺，极大的提高了药材的利用率，并提高了药材中活性物质的种类和含量。
具体实施方式
24.本发明提供了一种人参黄精植物饮料，由包括以下组分的原料制备而成：覆盆子3～8份，肉苁蓉20～29份，人参10～20份，黄精12～18份，甘草4～8份，黑桑葚3～8份，黑玛咖3～8份，大枣3～8份，山药3～8份，枸杞4～8份，芡实4～8份；优选的，由包括以下组分的原料制备而成：覆盆子4～7份，肉苁蓉22～28份，人参12～18份，黄精14～16份，甘草5～7份，黑桑葚4～7份，黑玛咖4～7份，大枣4～7份，山药4～7份，枸杞5～7份，芡实5～7份；进一步优选的由包括以下组分的原料制备而成：覆盆子5份，肉苁蓉27份，人参12份，黄精15份，甘草5份，黑桑葚6份，黑玛咖6份，大枣6份，山药5份，枸杞6份，芡实6份。
25.在本发明中，所述人参味甘，气温、微寒、气味俱轻，可升可降，阳中有阴，无毒。乃补气之圣药，活人之灵苗也。能入五脏六腑，无经不到，非仅入脾、肺、心而不入肝、肾也。五脏之中，尤专入肺、入脾。其入心者十之八，入肝者十之五，入肾者十之三耳。大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津安神的功效。
26.在本发明所述人参黄精植物饮料组方中，覆盆子为君药，归肝肾经，《开宝本草》：“补虚续绝，强阴建阳，悦泽肌肤，安和脏腑，温中益力，疗劳损风虚，补肝明目”。肉苁蓉为君药：补肾，益精，润燥，滑肠。治男子阳痿，女子不孕，带下，血崩，腰膝冷痛，血枯便秘。《本经》：“主五劳七伤，补中，除茎中寒热痛，养五脏，强阴，益精气，妇人癥瘕”。覆盆子和肉苁蓉配伍共奏补肾壮阳之效。
27.臣药：人参，补阳，补气；黄精，滋阴，中和人参的药性，二者配伍补气效果更佳，能够改善饮用者的精神状态，缓解亚健康，实现抗疲劳的功效。
28.佐药：黑桑葚，黑玛咖，大枣，山药，枸杞，芡实；
29.黑桑葚，能够提供丰富的营养物质，增强免疫力，改善血液循环。
30.黑玛咖，苦入肾，辛入肺，甘入脾，具有补肾益精，健脾益气的作用，具有抗疲劳，增加体力，提高睡眠质量，增强记忆，调节内分泌对抗更年期的功效。
31.大枣具有补虚益气、养血安神、健脾和胃等功效；
32.山药具有健脾益胃，益肺止咳的功效。
33.枸杞具有益精明目，滋补肝肾的功效；
34.芡实具有补中、益精气、令耳目聪明的功效；
35.上述佐药协助君药和臣药，增强抗疲劳的功效；同时黑桑葚、甘草、枸杞和大枣能够提高产品的甘味，使产品口感酸甜可口，提高产品的接受度。
36.使药：甘草，中和诸药，调节口味。
37.本发明所述人参黄精植物饮料组方中的各个中药原料，按照君臣佐使配伍原则复配，调节诸脏器，肝肾同补，增强免疫力，恢复体力，抗疲劳。
38.本发明提供了所述人参黄精植物饮料的制备方法，包括以下步骤：1)将覆盆子、肉苁蓉、人参、黄精、甘草、黑桑葚、黑玛咖、大枣、山药、枸杞和芡实混合，用纤维素酶液浸泡、然后加水进行第一熬制，固液分离获得第一提取液和第一滤渣；2)将所述第一滤渣与水混合，进行第二熬制，固液分离获得第二提取液和第二滤渣；3)将所述第一提取液和所述第二提取液混合获得药汁；4)向所述药汁中接入发酵剂进行发酵浸提得发酵浸提液；5)将所述发酵浸提液与澄清剂混合、澄清，静置后过滤获得所述人参黄精植物饮料。
39.在本发明中，将覆盆子、肉苁蓉、人参、黄精、甘草、黑桑葚、黑玛咖、大枣、山药、枸杞和芡实混合，用纤维素酶液浸泡、然后加水进行第一熬制，固液分离获得第一提取液和第一滤渣。在本发明中，所述原料优选为干制原料，所述原料在使用前优选的进行清洗和除杂；所述清洗用水进行，清除药材表面泥土灰尘。
40.在本发明中，所述纤维素酶液中纤维素酶的含量优选为10～15wt％，进一步优选为11～14wt％，所述纤维素酶液优选的用水溶解纤维素酶获得。在本发明中，所述纤维素酶液的质量和原料总质量的比例优选为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)，进一步优选为(0.8～1.2)：1，更进一步优选为1:1。在本发明中，所述浸泡的时间优选为30～60min，进一步优选为40～50min，所述浸泡的温度优选为50～72℃，进一步优选为55～65℃。在本发明中，纤维素酶在提高纤维素、半纤维素分解的同时，可促进植物细胞壁的溶解使更多的植物细胞内溶物溶解出来并能将不易消化的大分子多糖、蛋白质和脂类降解成小分子物质有利于动物胃肠道的消化吸收。使用纤维素酶浸泡后有利于提高中药材纤维素、半纤维素的分解，同时促进不易消化的大分子降解为利于消化吸收的小分子，从而提高中药材有效成分的利用率。本发明在所述纤维素浸泡后进行固液分离，向固相组分中加水进行第一熬制；本发明在所述第一熬制时，用水的质量为原料总质量的15～20倍，优选为16～19倍；所述第一熬制的时间优选为2～5h，进一步优选为3～4h；在本发明中，所述第一熬制的温度优选为90～110℃，进一步优选为95～105℃；本发明在所述第一熬制结束后，进行固液分离，所述固液分离的方法为过滤，所述过滤采用600目的纱布进行。
41.本发明在获得所述第一滤渣后，将所述第一滤渣与水混合，进行第二熬制，固液分离获得第二提取液和第二滤渣。在本发明中，所述第二熬制用水的质量为原料总质量的5～10倍，优选为6～9倍；所述第二熬制的时间优选为1～3h，进一步优选为1.5～2.5h。在本发明中，所述第二熬制的温度优选为90～110℃，进一步优选为95～105℃；本发明在所述第二熬制结束后，进行固液分离，所述固液分离的方法为过滤，所述过滤采用600目的纱布进行。
42.在本发明中，将所述第一提取液和所述第二提取液混合获得药汁。本发明对所述
混合没有特殊限定，采用本领域常规混合手段即可。
43.本发明在获得所述药汁后，向所述药汁中接入发酵剂进行发酵浸提得发酵浸提液。
44.在本发明中，所述发酵剂包括保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜热链球菌、双歧杆菌和植物乳杆菌中的两种以上。在本发明中，所述发酵剂的接入浓度优选为0.1
×
109～1
×
109cfu/l，进一步优选为0.2
×
109～0.9
×
109cfu/l。在本发明中，所述发酵浸提的温度优选为36～38℃，进一步优选为37℃；所述发酵浸提的时间优选为60～72h，进一步优选为62～70h。在本发明中，所述发酵浸提液中的粗多糖含量在0.31mg/ml以上，所述发酵浸提液中含有10种以上氨基酸。
45.本发明在获得所述发酵浸提液后，将所述发酵浸提液与澄清剂混合、澄清，静置后过滤获得所述人参黄精植物饮料。在本发明中，所述澄清剂优选为ztc1 1澄清剂、果汁澄清剂、甲壳素澄清剂或壳聚糖澄清剂；所述发酵浸提液与澄清剂的质量比优选为100：1～8，进一步优选为100:2～7；在本发明所述混合后进行搅拌，本发明对所述搅拌的转速没有特殊限定，搅拌均匀即可。在本发明中，所述澄清的温度优选为34～36℃，进一步优选为35℃；所述静置的时间优选为12～16h，进一步优选为13～15h。本发明在所述静置后，进行过滤，所述过滤采用600目的纱布进行。本发明在所述过滤后获得澄清液，将所述澄清液放置10～20h后取上清液灌装，获得人参黄精植物饮料成品。
46.本发明还提供了一种药物制剂，所述药物制剂包括上述抗疲劳人参黄精植物饮料。在本发明中，所述药物制剂优选为口服液剂，所述口服液剂优选的将上述制备获得的人参黄精植物饮料经高温灭菌后的瓶子灌装并再次灭菌得到口服液剂，所述口服液剂的规格优选为20～50ml/瓶，进一步优选为30ml/瓶；所述口服液剂于疲惫劳累，精神不佳时饮用。
47.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
48.实施例1
49.覆盆子5份，肉苁蓉24份，人参10份，黄精14份，甘草5份，黑桑葚6份，黑玛咖4份，大枣5份，山药4份，枸杞4份，芡实4份。
50.s1，将上述干制原料清洗干净，去除杂质。
51.s2，将所述干制原料放入含纤维素酶的水(纤维素酶的质量百分含量为10％)中浸泡30min，再加水(加水量为原料总质量的15倍)进行第一次熬制(100℃，2h)，过滤后得第一次提取液，然后加水(加水量为原料总质量的5倍)进行第二次熬制(100℃，1h)，过滤后得第二次提取液，将第一次提取液和第二次提取液混合并过滤，得药汁；
52.s3，将发酵剂(包括植物乳杆菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌，植物乳杆菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌的活菌比例为1:1:1，总的菌浓度0.9
×
109cfu/l)，加入所述药汁中，发酵浸提(37℃，60h)，得发酵浸提液，发酵浸提液中的粗多糖含量在0.31mg/ml以上、含有10种以上氨基酸。
53.s4，在所述发酵浸提液中加入ztc1 1澄清剂进行澄清，发酵浸提液与澄清剂的质量比为100:5；并搅拌均匀，静置(12h)后过滤杂质，得澄清液；
54.s5，将上述澄清液放置10h后取上清液罐装，使用经高温灭菌后的瓶子灌装并再次灭菌得到口服液产品，口服液产品为30ml/瓶的成品。
55.实施例2
56.覆盆子7份，肉苁蓉20份，人参12份，黄精14份，甘草5份，黑桑葚5份，黑玛咖4份，大枣5份，山药6份，枸杞4份，芡实5份。
57.s1，将上述干制原料清洗干净，去除杂质。
58.s2，将所述干制原料放入含纤维素酶的水(纤维素酶的质量百分含量为15％)中浸泡30min，再加水(加水量为原料总质量的20倍)进行第一次熬制(100℃，2h)，过滤后得第一次提取液，然后加水(加水量为原料总质量的10倍)进行第二次熬制(100℃，1h)，过滤后得第二次提取液，将第一次提取液和第二次提取液混合并过滤，得药汁；
59.s3，将发酵剂(植物乳杆菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌，植物乳杆菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌的活菌比例为1:1:1，总的菌浓度0.8
×
109cfu/l)加入所述药汁中，发酵浸提(37℃，72h)，得发酵浸提液，发酵浸提液中的粗多糖在0.31mg/ml以上、含有10种以上氨基酸。
60.s4，在所述发酵浸提液中加入果汁澄清剂进行澄清，发酵浸提液与澄清剂的质量比为100:2；并搅拌均匀，静置(16h)后过滤杂质，得澄清液；
61.s5，将上述澄清液放置20h后取上清液罐装，使用经高温灭菌后的瓶子灌装并再次灭菌得到口服液产品，口服液产品为30ml/瓶的成品。
62.实施例3
63.覆盆子5份，肉苁蓉27份，人参12份，黄精15份，甘草5份，黑桑葚6份，黑玛咖6份，大枣6份，山药5份，枸杞6份，芡实6份。
64.s1，将上述干制原料清洗干净，去除杂质。
65.s2，将所述干制原料放入含纤维素酶的水(纤维素酶的质量百分含量为12％)中浸泡30min，再加水(加水量为原料总质量的18倍)进行第一次熬制(100℃，2h)，过滤后得第一次提取液，然后加水(加水量为原料总质量的7倍)进行第二次熬制(100℃，1h)，过滤后得第二次提取液，将第一次提取液和第二次提取液混合并过滤，得药汁；
66.s3，将发酵剂(植物乳杆菌和干酪乳杆菌，植物乳杆菌和干酪乳杆菌、双歧杆菌的活菌比例为1:1，总的菌浓度0.7
×
109cfu/l)加入所述药汁中，发酵浸提(37℃，65h)，得发酵浸提液，发酵浸提液中的粗多糖在0.31mg/ml以上、含有10种以上氨基酸。
67.s4，在所述发酵浸提液中加入甲壳素澄清剂进行澄清，发酵浸提液与澄清剂的质量比为100:7；并搅拌均匀，静置(14h)后过滤杂质，得澄清液；
68.s5，将上述澄清液放置15h后取上清液罐装，使用经高温灭菌后的瓶子灌装并再次灭菌得到口服液产品，口服液产品为30ml/瓶的成品。
69.实施例4
70.覆盆子6份，肉苁蓉25份，人参14份，黄精13份，甘草4份，黑桑葚3份，黑玛咖4份，大枣5份，山药4份，枸杞4份，芡实3份。
71.制备方法参见实施例3记载。
72.实施例5
73.覆盆子5份，肉苁蓉28份，人参12份，黄精12份，甘草6份，黑桑葚6份，黑玛咖5份，大枣6份，山药5份，枸杞5份，芡实4份。
74.制备方法参见实施例3记载。
75.试验例1
76.检测实施例1中制备获得的人参黄精植物饮料的形态及营养成分，具体检测方法和结果见表1～表3所示。
77.表1实施例1中制备获得的人参黄精植物饮料的检测结果
78.79.[0080][0081]
表2实施例1中制备获得的人参黄精植物饮料的营养成分表
[0082]
项目每100克(g)nrv％能量66千焦(kj)1％
蛋白质0克(g)0％脂肪0克(g)0％碳水化合物3.8克(g)1％钠40毫克(mg)2％
[0083]
表3实施例1中制备获得的人参黄精植物饮料的粗多糖含量
[0084][0085]
实施例1中制备获得的人参黄精植物饮料的安全性毒理评价
[0086]
实验动物：饲养环境及饲料来源：实验动物房使用许可证号为syxk(川)2011-043.屏障系统，温度20-25℃，相对湿度40％～70％。饲料来源于四川省医学科学院.四川省人民医院实验动物研究所，生产许可证号为scxk(川)2010-01。相关试验动物使用情况见表4。
[0087]
表4实验动物一览表
[0088][0089][0090]
剂量选择与受试物给予方式：
[0091]
急性经口毒性试验：设15000mg/kg.bw一个剂量组，按20m1/kg.bw二次经口灌胃。灌胃前动物禁食16h，不限饮水，首次染毒后观察7天。
[0092]
ames试验：设8、40、200、1000、5000μg/皿五个剂量组及溶剂对照组(蒸馏水)、自发对照组和阳性对照组。
[0093]
骨髓细胞微核试验：设2500mg/kg.bw、5000mg/kg.bw、1000mg/kg.bw三个剂量组，另设溶剂(蒸馏水)对照及环磷酰胺阳性对照组(cp，40mg/kg.bw)。按20ml/kg.bw经口灌胃，两次间隔24h，首次染毒后观察2天。
[0094]
精子畸形试验：设2500mg/kg.bw、5000mg/kg.bw、10000mg/kg.bw三个剂量组，另设溶剂(蒸馏水)对照组和环磷酰胺阳性对照组(cp，40mg/kg.bw)。按20ml/kg.bw经口灌胃，连续给予5天，首次染毒后观察35天。
[0095]
30天喂养试验：设1667mg/kg.bw、333mg/kg.bw、6667mg/kg.bw三个剂量组(分别相当于人体推荐摄入量的25、50、100倍)，另设全价颗粒饲料对照组。采用拌饲法，首次染毒后观察30天。
[0096]
急性经口毒性试验：采用最大耐受剂量法，大、小鼠分别随机分成两组，共4组，每组同系同性10只动物。称取75g受试物加蒸馏水至200ml混匀后备用。大、小鼠二次给予受试物，间隔4h。观察一周内动物的中毒表现及死亡情况，试验结束称体重后处死动物作大体解剖。
[0097]
ames试验：使用经β-萘黄酮与苯巴比妥联合诱导雄性大鼠肝s9，按标准方法制成s9混合液后作为活化系统，用间接致突变物(20μg/皿2-氨基芴用于ta
97
、ta
98
、ta
100
，50μg/皿1,8-二羟基蒽醌用于ta
102
菌)测定s9活性。试验采用ta
97
、ta
98
、ta
100
、ta
102
四种菌株，受试物设8、40、200、1000、5000μg/皿五个剂量组及溶剂对照组(蒸馏水)、自发对照组和阳性对照组。
[0098]
首先配制受试物工作液：准确称取5.0g祥品，加蒸馏水至100ml混匀即为最高工作浓度50mg/ml，试验时取该工作液100μ1加入平皿即为最高受试物终浓度(5000μg/皿)，以最高浓度为基础用蒸馏水5倍往下稀释即得以下浓度。0.103mpa20min高压蒸汽灭菌。在加和不加s9的试验条件下进行平板掺入法试验，每组作三个平行皿，重复试验一次。s9阳性对照物：:ta
97
和ta
98
用0.5μg/皿的4-硝基喹啉-n-氧化物；ta
100
用1.5μg/皿的叠氮化钠(nan2)；ta
102
用1.0μg/皿的丝裂霉素c(mmc)； s9阳性对照物ta
102
用50μg/皿的1,8-二羟基蔥醌，其余三个菌株均采用20μg/皿的2-氨基芴(2-ap)。每皿加入阳性对照的体积为0.1m1。
[0099]
骨髓细胞微核试验：采用30h两次给药法，将小鼠按雌雄分别随机分为5组，每组5只动物，称取2.5g、5.0g、10.0g样品分别加蒸馏水至20ml，另称取0.04gcp加蒸馏水至20ml，混匀即可，两次灌胃间隔24h，于第二次给受试物后6h脱颈椎处死动物，取胸骨髓按《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)中的规定进行制片，固定，giemsa染色后，在油镜下每只小鼠计数1000个嗜多染红细胞(pce)中含微核细胞数，计算微核细胞率(
‰
)。观察200个红细胞中嗜多染红细胞与成熟红细胞的比值(pce/nce)。
[0100]
精子畸形试验：将小鼠随机分为5组，每组5只动物，称取10g、20g、40g样品分别加蒸馏水至80m1，另称取0.04gcp加蒸馏水至20ml(环磷酰胺每天临用时配制)，混匀即可。连续灌胃5天，于首次给受试物后第35天，脱颈椎处死动物取双侧附睾进行制片，按《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)中的规定，甲醇固定，1％伊红染鱼后，在高倍镜下每只动
物计数1000条完整精子，记录精子畸形、畸形类型以及计算精子畸形率。
[0101]
30天喂养试验：采用拌饲法，将大鼠随机分成4组，每组26只大鼠，雌雄各半，配制含受试物的饲料各14kg，分别称取233g、467g、933g受试物，因高剂量样品含量超过5％，故用干酪素补充高剂量组蛋白质(干酪素由北京奧博星生物技术有限公司生产)。先依次加入到3kg饲料中，充分搅拌混匀后，将所剩饲料加入其中至总量14kg，再充分搅拌混匀后，加工成型，钴60照射后备用。每天每只大鼠单笼喂养，连续30天，每天观察动物的一般表现、行为、中毒表现及死亡，每周计算两次进食量，并称一次体重，根据食物摄入量，计算食物利用率，试验结束时禁食后称重并经股动脉放血处死动物，采血用xt-2000i型全自动血细胞分析仪测定血液学指标，用日本奥林巴斯光学株式会社生产的au-400全自动生化分析仪及德国奥林巴斯(欧洲)诊断有限公司提供的试剂盒，测定血生化指标，解剖动物观察内脏改变，称肝、肾、脾、睾丸重，计算其脏体比，取肝、肾、脾、胃肠、睾丸(卵巢)作组织病理学检查。试验期间动物自由进食、饮水。
[0102]
试验数据统计：骨髓微核试验采用卡方检验，精子畸形试验采用秩和检验，30天喂养试验数据经方差齐性检验，方差齐，进行方差分析，如p值小于0.05则用dunnett法进行两两比较；若方差不齐，则进行数据转换，仍不齐，改用秩和检验，如p值小于0.05，则用dunnett’s t3法进行两两比较，上述统计均用spss 11.0for windows软件处理。
[0103]
结果判定：
[0104]
急性经口毒性试验：根据ld50数值，判定受试物的毒性分级。
[0105]
ames试验：受试物组回变菌落数增加一倍以上(即回变菌落数等于或大于2乘以未处理对照数)，并有剂量反应关系或至少某一测试点有可重复的并有统计学意义的阳性反应，即可认为该受试物诱变试验阳性。
[0106]
骨髓细胞微核试验：试验组与对照组相比，试验结果微核率有明显的剂量反应关系并有统计学意义时，即可确认为阳性结果。若统计学上差异有显著性，但无剂量反应关系时，则须进行重复试验。结果能重复者可确定为阳性。
[0107]
精子畸形试验：每个剂量组应分别与相应的阴性对照组进行比较，畸形率至少为阴性，对照组的倍量或经统计有显著意义，并有剂量反应关系，即可判定为阳性。
[0108]
结果
[0109]
急性经口毒性试验：给受试物后大、小鼠的一般表现和行为均未见异常，观察期内未见动物死亡，试验结束时处死动物，大体解剖肉眼未见异常。人参黄精植物饮料对大、小鼠急性经口mtd值均大于15000mg/kg.bw，按急性毒性分级属无毒级。
[0110]
表5大小鼠急性经口毒性试验结果
[0111][0112]
三项遗传毒性试验(ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验以及小鼠精子畸形试验)结果未见致突变作用。
[0113]
30天喂养试验，可见动物生长发育正常，体重持续增长，体态活泼，被毛光滑柔顺，大、小便未见异常改变。试验期间未见动物出现中毒症状及死亡。三个剂量组雌雄大鼠的每周体重、每周进食量、每周食物利用率、总食物利用率、脏体比值、血液学指标及末期血生化指标检测结果与对照组比较，雄鼠除低剂量组第二周进食量增加有显著性差异(p《0.05)，中剂量组的血红蛋白、红细胞和白细胞均降低有显著性差异外(p《0.01,p《0.05,p《0.01)，中剂量组的谷草转氨酶降低有显著性差异(p《0.01)，低、中剂量组的总蛋白升高均有显著性差异(p《0.01，p《0.05)；雌鼠除中剂量组的肌酐升高有显著性差异外(p《0.05)，低剂量组的血红蛋白降低有显著性差异外(p《0.01,)；其余各项指标；均无显著性差异(p》0.05)。以上所测值均在本室正常值范围内。组织病理学检查结果，除动物自发病变外，未见受试物高剂量组引起动物中毒性损伤改变。
[0114]
上述检测委托四川省疾病预防控制中心进行。
[0115]
试验例2
[0116]
实施例1中制备获得的人参黄精植物饮料增强免疫力功能动物试验
[0117]
实验动物：由四川省中医药科学院实验动物中心提供的昆明种小鼠160只，全雌，体重18-22g；生产许可证号为scxk(川)2013-19spf级；饲料来源于四川省医学科学院.四川省人民医院实验动物研究所，生产许可证号为scxk(川)2010-01。试验动物房为屏障系统，使用许可证号为syxk(川)2011-043。温度20-25℃，相对湿度40-70％。
[0118]
剂量选择与受试物给予方式：设667mg/kg.bw、1333mg/kg.bw、2000mg/kg.bw三个剂量组(分别相当于人体推荐摄入量的10倍、20倍、30倍)，分别称取8.33g、16.67g、25.00g受试物加蒸馏水至250ml混匀，用完再配，另设蒸馏水阴性对照组，每组40只动物。分为免疫一组、二组、三组、四组，其中一组用于小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验；二组用于nk细胞活性测定及淋巴细胞转化实验；三组用于抗体生成细胞实验、血清溶血素测定和迟发性变态反应实验；四组用于小鼠碳廓清实验。小鼠按20ml/kg.bw体重一次经口灌胃，至少连续
给予30天，每周称一次体重，调整灌胃体积。
[0119]
主要仪器和试剂：100μ1微量注射器、二氧化碳培养箱、电子分析天平、723分光光度仪、离心机、2010型酶标仪、手术器械、srbc、hank’s液、dnfb、sa缓冲液、琼脂糖、印度墨汁、na2co3、rpmi1640。
[0120]
试验方法
[0121]
脏器/体重比值测定：试验结束时称体重后处死动物，取脾脏和胸腺在电子分析天平上称重，并计算脏/体比值。
[0122]
迟发型变态反应(dth)(足跖增厚法)：给小鼠腹腔注射2％压积srbc(0.2m1/每鼠)致敏4天后，测量左后足跖厚度，然后在测量部位皮下注射20％(v/v)srbc(20μ1/每鼠)，于注射后24h测量左后足跖厚度，同一部位测量三次，取平均值，以攻击前后足跖厚度差值(足跖肿胀度)来表示dth的程度。
[0123]
cona诱导的小鼠淋巴细胞转化试验(mtt法)：无菌取脾，在装有无菌hank's液平皿中，用镊子将脾磨碎，制成细胞悬液，200目筛过滤，用hank's液洗2次，每次离心10min(1000r/min)，然后取沉淀悬浮于1ml的完全培养液中，台酚兰染色计数(应在95％以上)。将细胞浓度调整为3x106个/ml，然后将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml，一孔加75μ1cona液，另一孔作对照，置5％co2，孵箱37℃培养72h培养结束后，每孔轻轻吸去上清液0.7ml，加入0.7ml不含小牛血清的rpmi1640培养液，同的加入mtt50μ1/孔继续培养4h，培养结束后，每孔加入1ml酸性异丙醇，使紫色结晶完全溶解，然后分装到96孔培养板，每孔做3个平行孔，用2010型酶标仪，以570nm波长测定光出度值。
[0124]
抗体生成细胞检测(jerne改良玻片法)：每只小鼠腹腔注射2％压积srbc0.2ml，将免疫5天后的小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏放在盛有hank’s液的平皿内，磨碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，离心(1000r/min)10min，用hank’s液洗2遍，最后将细胞悬浮在5ml rpmi1640培养液中，台酚兰染色计数(应在95％以，上)，并将细胞浓度调整为5x106个/m1，制成脾细胞悬液。将琼脂糖配制成1％水溶液，水浴煮30min，与等量双倍浓度hank’s液混合，分装小试管，每管0.5ml，再向管内加10％(用sa缓冲液配制)压积srbc 50μl，脾细胞悬液各20μl做两个平行样，迅速混匀后，倾倒于琼脂糖薄层玻片上，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中孵育1.5h，然后将补体加入到玻片架凹槽内，继续温育1.5h，计数溶血空斑数。补体制备是采集豚鼠血，分离出血清(至少5只豚鼠的混合血清)，将1ml压积srbc加入到5ml豚鼠血清中，4c冰箱放置30min，经常振荡，离心取上清，分装，-70c保存。用时以sa缓冲液按1:15稀释。
[0125]
血清溶血素测定(血凝法)：每只小鼠腹腔注射2％srbc 0.2ml免疫，继续灌胃5天后，摘除眼球取血于离心管内，放置1小时，剥离，2000r/min离心10分钟，收集血清，用生理盐水将血清作倍比稀释，每份稀释12孔，将不同稀释度的血清置于血凝板中，每孔100μl，再加入0.5％srbc悬液100μl，混匀，置湿盒37℃ 3小时后观察结果，记录每孔的凝集程度，计算抗体积数。
[0126]
小鼠碳廓清试验：于小鼠尾静脉注射用5倍生理盐水稀释的印度墨汁，按0.1ml/1ug墨汁注入后立即计时，于注入墨汁后第2、10min分别从内眦静脉丛取血20μ1，加到2ml na2co3溶液中，以na2co3溶液作空白对照，用723分光光度计在600nm处测定光密度值。取血后将小鼠处死，取肝、脾称重，计算吞噬指数。
[0127]
小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验(半体内法)：每只小鼠腹腔注射用ns洗涤3次后的20％鸡红细胞悬液1ml，30分钟后，颈椎脱臼处死，将其固定在鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2ml，转动鼠板1分钟，吸出腹腔洗液1ml，平均滴于2张载玻片上，置湿盒37℃30分钟，取出在生理盐水漂洗、晾干、固定，4％giemsapbs染色3分钟，蒸馏水漂洗凉干，镜检。计算吞噬百分率及吞噬指数。
[0128]
nk细胞活性测定(乳酸脱氢酶ldh测定法)：颈椎脱臼处死动物，取出脾脏，撕碎，过200目筛网后，用hank's液洗3次，每次1000r/min离心10min，取细胞浆，灭菌水裂解红细胞，台酚兰染色计数(应在95％以上)，用完全1640培养液配成2x107个/ml细胞悬液。将各只小鼠的细胞悬液取300μ1分置于96孔培养板中，每孔100μ1，每孔加靶细胞(yac-1细胞，4x105个/ml)100μ1，同时做靶细胞自然释放孔(靶细胞100μ1 培养液100μl)及最大释放孔(靶细胞100μ1 2.5％triton100μl)各3孔，37℃ 5％co2培养4小时，取出1500r/min离心5min。将各孔上清液100μ1置于另一培养板中，每孔再加入100μl质基液；10分钟后加1mo1/l hcl 30μ1终止反应，在490nm处测定od值，计算nk细胞活性率。
[0129]
试验数据统计：试验数据采用spss 10.0forwindows软件包平。对照组与剂量组的数据经方差齐性检验，方差齐，进行方差分析，如p值小于0.05，则用dunnett进行两两比较；若方差不齐，则进行数据转换，仍不齐，改用秩和检验，如p值小于0.05，则用dunnett’s t3法进行两两比较。
[0130]
结果判定：在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能、nk细胞活性四个方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品具有增强免疫力功能作用。
[0131]
试验结果
[0132]
人参黄精植物饮料对小鼠体重的影响
[0133]
表6各组小鼠的初始体重(x
±
s)
[0134]
[0135]
表7各组小鼠的中期体重(x
±
s)
[0136][0137][0138]
表8各组小鼠的结束体重(x
±
s)
[0139][0140]
表9人参黄精植物饮料对小鼠体重增重的影响(x
±
s)
[0141][0142][0143]
由表6～9可见，免疫一组、免疫二组、免疫三组及免疫四组动物的初始体重与阴性对照组相比，经方差齐性检验，方差齐(p》0.05)，且方差分析结果(p》0.05)，说明各组动物与阴性对照组之间的初始体重是均衡的。免疫一、二、三、四组各剂量组动物试验中期、末期的体重以及试验期间小鼠体重的增长与阴性对照组相比较均无显著性差异(p》0.05)。
[0144]
表10人参黄精植物饮料对小鼠脏器/体重比值的影响(x
±
s)
[0145][0146]
由表10可见，连续灌胃30天后，三个剂量组动物的足趾肿胀与阴性对照组相比，经统计学处理，无显著对照组相比，经统计学处理，均无显著性差异(p》0.05)。人参黄精植物饮料对小鼠细胞免疫功能的影响
[0147]
表11对小鼠迟发性变态反应(dth)的影响(x
±
s)
[0148][0149][0150]
表12对cona诱导的小鼠淋巴细胞转化试验的影响(x
±
s)
[0151][0152]
由表12可见，连续灌胃小鼠30天后，三个剂量组动物的淋巴细胞增殖能力与阴性对照组相比，经统计学处理，无显著性差异(p《0.05)。
[0153]
表13对小鼠抗体生成细胞的影响(x
±
s)
[0154][0155]
由表13可见，连续灌胃30天后，三个剂量组动物的溶血空斑数与阴性对照组相比，经统计学处理，无显著性差异(p》0.05)。
[0156]
表14对小鼠血清溶血素的影响(x
±
s)
[0157][0158][0159]
由表14可见，连续灌胃30天后，三个剂量组动物的血清溶血素与阴性对照组相比，经统计学处理，中、高剂量组动物有显著性差异(p《0.05、p《0.01。)
[0160]
表15对小鼠单核-巨噬细胞碳廓清功能的影响(x
±
s)
[0161][0162]
由表15可见，连续灌胃30天后，三个剂量组动物的碳廓清能力和阴性对照组相比经统计学处理，无显著性差异(p》0.05)。
[0163]
表16对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响(x
±
s)
[0164][0165]
由表16可见，连续灌胃30天后，三个剂量组动物的吞噬率和吞噬指数与阴性对照组相比，经统计学处理，无显著性差异(p》0.05)。
[0166]
表17对小鼠nk细胞活性的影响
[0167][0168][0169]
由表17可见，连续灌胃30天后，三个剂量组动物的nk细胞活性与阴性对照组相比，经统计学处理，低、高剂量组动物有显著性差异(p《0.01、p《0.01)。
[0170]
可知，人参黄精植物饮料连续灌胃小鼠30天后，对小鼠的体重、脏器/体重比值无明显影响；三个剂量组动物的抗体积数与阴性对照组比较，中、高剂量组有显著性差异(p《0.05、p《0.01)，小鼠体液免疫试验结果阳性；三个剂量组动物的nk细胞活性与阴性对照组比较，低、高剂量组动物有显著性差异(p《0.01、p《0.01)，小鼠nk细胞活性试验结果阳性；小鼠细胞免疫试验结果阴性；小鼠单核一巨噬细胞吞噬功能试验结果阴性。依据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)可以判定，人参黄精植物饮料对动物具有增强免疫力的功能。