蔷薇中抗根癌农杆菌侵染的新的抗性基因的制作方法

no.6在二倍体蔷薇一致性图谱中标示为rchiobhmchr7g0232931(位置：终止＝57131496起始＝57128076)。
13.在根癌农杆菌抗性蔷薇植物中，与根癌农杆菌易感植物相比，位置rosev2_rchiobhmchr7_57128943处的核苷酸从t突变为a。位置rosev2_rchiobhmchr7_57128943周围的上游和下游核苷酸(在根癌农杆菌抗性蔷薇植物中)由seq id no.11表示。
14.根据本发明的另一优选实施方案，位于二倍体蔷薇一致性图谱的56mb至58.5mb之间的连锁群7(lg7)中的一个或更多个基因之一是编码seq id no.7的cdna序列的基因。seq id no.7在二倍体蔷薇一致性图谱中标示为rchiobhmchr7g0232831(位置：起始＝57010720终止＝57017672)。
15.在根癌农杆菌抗性蔷薇植物中，与根癌农杆菌易感植物相比，位置rosev2_rchiobhmchr7_57010803处的核苷酸从c突变为g。位置rosev2_rchiobhmchr7_57010803周围的上游和下游核苷酸(在根癌农杆菌抗性蔷薇植物中)由seq id no.12表示。
16.根据本发明的又一优选实施方案，位于二倍体蔷薇一致性图谱的56mb至58.5mb之间的连锁群7(lg7)中的一个或更多个基因之一是编码seq id no.8的cdna序列的基因。seq id no.8在二倍体蔷薇一致性图谱中标示为rchiobhmchr7g0232901(位置：起始＝57087871终止＝57092473)。
17.编码序列(seq id no.8)的不存在与对根癌农杆菌的易感性相关，并且编码序列(seq id no.8)的存在与对根癌农杆菌的抗性相关。
18.根据本发明的又一优选实施方案，位于二倍体蔷薇一致性图谱的56mb至58.5mb之间的连锁群7(lg7)中的一个或更多个基因之一是编码seq id no.9的cdna序列的基因。seq id no.9在二倍体蔷薇一致性图谱中标示为rchiobhmchr7g0232961(位置：起始＝57174178终止＝57174936)。
19.在根癌农杆菌抗性蔷薇植物中，与根癌农杆菌易感植物相比，位于起始密码子上游241个核苷酸的位置rosev2_rchiobhmchr7_57175177处的核苷酸是a。位置rosev2_rchiobhmchr7_57175177周围的上游和下游核苷酸(在根癌农杆菌抗性蔷薇植物中)由seq id no.13表示。
20.根据本发明的又一优选实施方案，位于二倍体蔷薇一致性图谱的56mb至58.5mb之间的连锁群7(lg7)中的一个或更多个基因之一是编码seq id no.10的cdna序列的基因。seq id no.10在二倍体蔷薇一致性图谱中标示为rchiobhmchr7g0232471(位置：起始＝56575965终止＝56579420)。
21.在根癌农杆菌抗性蔷薇植物中，与根癌农杆菌易感植物相比，位置rosev2_rchiobhmchr7_56578406处的核苷酸从c突变为g。位置rosev2_rchiobhmchr7_56578406周围的上游和下游核苷酸(在根癌农杆菌抗性蔷薇植物中)由seq id no.14表示。
22.考虑到上文，本发明涉及以下最优选的实施方案：
[0023]-根癌农杆菌抗性蔷薇植物，其中位于二倍体蔷薇一致性图谱的56mb至58.5mb之间的连锁群7(lg7)中的一个或更多个基因是编码seq id no.1的cdna序列的基因。
[0024]-根癌农杆菌抗性蔷薇植物，其中位于二倍体蔷薇一致性图谱的56mb至58.5mb之间的连锁群7(lg7)中的一个或更多个基因是编码seq id no.2的cdna序列的基因。
[0025]-根癌农杆菌抗性蔷薇植物，其中位于二倍体蔷薇一致性图谱的56mb至58.5mb之
间的连锁群7(lg7)中的一个或更多个基因是编码seq id no.3的cdna序列的基因。
[0026]-根癌农杆菌抗性蔷薇植物，其中位于二倍体蔷薇一致性图谱的56mb至58.5mb之间的连锁群7(lg7)中的一个或更多个基因是编码seq id no.4的cdna序列的基因。
[0027]-根癌农杆菌抗性蔷薇植物，其中位于二倍体蔷薇一致性图谱的56mb至58.5mb之间的连锁群7(lg7)中的一个或更多个基因是编码seq id no.5的cdna序列的基因。
[0028]
根据特别优选的实施方案，本发明的蔷薇植物是杂种蔷薇植物。
[0029]
根据又一特别优选的实施方案，本发明的根癌农杆菌抗性蔷薇植物包含本发明的提供根癌农杆菌抗性的一或更多个基因的至少两个拷贝。
[0030]
根据又一特别优选的实施方案，本发明涉及根癌农杆菌抗性蔷薇植物，其包含四倍体基因组和本发明的提供根癌农杆菌抗性的一个或更多个基因的至少3个拷贝，优选4个拷贝。
[0031]
根据又一特别优选的实施方案，本发明的根癌农杆菌抗性蔷薇植物包含上述定义的抗性提供基因的组合，诸如以下的组合：seq id no.1和seq id no.2或seq id no.11和seq id no.12；seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3或seq id no.11、seq id no.12和seq id no.13；seq id no.1至4；seq id no.1至5或seq id no.11至14。
[0032]
本发明还涉及本发明的根癌农杆菌抗性蔷薇植物的植物部分、细胞或生殖组织。
[0033]
本发明还涉及用于鉴定根癌农杆菌抗性蔷薇植物的方法，该方法包括以下步骤：在所述蔷薇植物的基因组中确定编码选自由seq id no.1至5组成的组的cdna序列的一种或更多种基因或其等位基因拷贝的存在，或在所述蔷薇植物的基因组中确定选自由seq id no.11至14组成的组的一种或更多种序列的存在。
[0034]
本发明将在下文呈现的实施例中进一步详细描述。
实施例
[0035]
材料与方法
[0036]
群体形成与表型筛选
[0037]
四倍体f1现代月季(rosa hybrida)群体是通过用蔷薇登记材料(accession)对四倍体切花月季(cut rose)进行人工授粉创建的。该杂交产生了353个f1，对它们的根癌农杆菌抗性进行测试。也对亲本进行了测试。使用的根癌农杆菌(a.tumefaciens)分离株源自荷兰并于1992年被分离出来。该分离株在人工培养基上增殖并以2.6
×
109菌落形成单位/ml的最终接种密度使用。接种后一周，对于每种登记材料(f1个体和亲本)，将5个生根插条移植到14cm盆中。接种的植物采用随机区组设计，每种登记材料4株植物。每种登记材料的一株植物用水接种。通过用浸在接种物中的手术刀在茎上进行切口来对植物接种。每次切口后，将手术刀再次浸入。生物测定是在长日照条件下进行的，白昼和夜晚的温度分别设置在22℃和20℃。相对湿度设置在70％。对于每株植物，在接种后3周、5周、7周、9周、11周和14周对瘤存在进行评分并测量尺寸。
[0038]
表型数据分析
[0039]
对353种独特f1基因型的1412株植物的总共8572次观察的瘤尺寸和存在进行了评分。使用r中的sommer包(covarrubias-pazaran 2016)用混合模型框架分析响应变量。将基因型和区组两者拟合为随机效应，并且对于瘤尺寸，将观察周包括为固定效应(协变量)。然
后通过将基因型方差除以方差分量之和来计算广义遗传性。获得了每种基因型的最佳线性无偏预测(best linear unbiased predictor，blup)，并用作下游分析的校正的表型。校正的表型以0(其定义群体平均值)为中心，并且偏差以测量单位表示。
[0040]
遗传分析
[0041]
基因型分型：使用wagrhsnp axiom snp阵列对由f1植物、亲本和广泛种质登记材料组成的组进行基因型分型。该芯片包含68,893个由两种探针从每个方向靶向的snp。使用r包fitpoly进行初始质量控制和剂量调用(非默认设置：p.阈值(p.threshold)＝0.95，调用.阈值(call.threshold)＝0.65，峰.阈值(peak.threshold)＝0.975)。在r中使用定制脚本进行进一步的qc。将非分离性snp(最常见的基因型具有》81％的频率的snp)和丢失数据超过10％的snp标志物去除，从而产生包含46,539个标志物的数据集。共298个f1个体被成功进行了基因型分型。
[0042]
通过使用局部blast(设置：-evalue 1-outfmt 6-max_target_seqs 1-max_hsps 1)将侧翼序列与参考(从(https://lipm-browsers.toulouse.inra.fr/pub/rchiobhm-v2/)下载)进行blast，将snp映射到蔷薇基因组组装(raymond等人2018)。在r中使用自定义脚本，仅保留对齐长度大于50且相同匹配的百分比大于85的blast命中。
[0043]
关联分析：使用r中的sommer包(covarrubias-pazaran 2016)用混合模型gwas框架进行标志物-性状分析，其中snp被拟合为固定效应，并且基因组关系矩阵(grm)被拟合为随机效应，以解释群体结构和残留多基因效应(不是由感兴趣的snp引起的遗传效应)。通过将grm拟合为随机效应来分析校正的表型，也类似地计算了基因组遗传性。
[0044]
注释分析：从两个文件中提取了qtl区中的基因预测。第一个文件是没有重复的eugene annotation v1.1(rchiobhm-v2-egn-r1.1.without_te.gff)。第二个文件是使用blast2go获得的基因预测(rchiobhm-v2-egn-r1.blast2go.20170310.mapping)。这两个文件均从https://lipm-browsers.toulouse.inra.fr/pub/rchiobhm-v2/获得(raymond等人2018)。
[0045]
如果基因预测包含以下术语中的至少一个，则该基因被认为是抗性基因：阿拉伯半乳聚糖、atagp17、纤维素合酶样、cslb-05、纤维合成酶样、csla-09、防御(defense)、网状蛋白(reticulon)、bti1(atrtnlb1)、bti2、(atrtnlb2)、bti3、(atrtnlb4)、rab8、gtp酶、微管、驱动蛋白、肌球蛋白、肌动蛋白、亲环蛋白、输入蛋白、转运蛋白、cak2m、激酶、磷酸酶、(pp2c)、vip1、胱天蛋白酶、galls、相互作用、cak2m、胱天蛋白酶、组蛋白、组蛋白、pcsn5-1、dna、连接酶、iva、核小体、组装、caf-1、组蛋白、h3、伴侣ga1、组蛋白、脱乙酰基酶、h4、h3-11、h2a、myb、转录、因子、wrky、wrky17(gelvin 2010；lacroix和citovsky2013)。
[0046]
对总共60种广泛的种质登记材料(包括抗性来源)进行了全基因组测序。在将读段映射到月季(rosa chinensis)参考基因组(raymond等人2018)后，读段被qc并且snp被判定。
[0047]
使用snp进行验证
[0048]
我们通过以下挖掘高效用snp：1)在qtl区中选择抗性基因；2)鉴定那些基因中显示出独特或几乎独特存在于来源中的等位基因的snp；3)仅保留可以为其设计kasp测定的snp。
[0049]
设计了kasp测定，并首先对一小组登记材料进行测试，以确定它们是否扩增。然后
对两个共有相同抗性亲本的f1群体进行扩增的kasp测定，以鉴定与根癌农杆菌抗性最高度相关的snp。精细作图后，snp用于筛选一组广泛的种质以确定种质中抗性等位基因的存在。
[0050]
结果
[0051]
瘤发生率(具有可见瘤的植物百分比)从22.5％3wai(接种后周数)增加到65.7％14wai。在14wai无瘤的484株植物中，35种基因型在所有4次重复中均无症状(总共140株植物)，并且另外54种基因型在3次重复中均无症状。其余无症状植物属于在瘤评分中表现出更多异质性的基因型。平均瘿尺寸从5.69mm 3wai增加至14.66mm 14wai(表1)，最大瘿尺寸为62.65mm。参考(例如抗性/易感性和用于实验之间的归一化)在14wai时的平均瘿尺寸(以mm计)如下：rs-1075：48.8，rs-1183：38.6，rs-1408：36.28，rs-1418：0，rs-9052：15.9。
[0052]
表1：在为期14周的实验期间瘤发生率的进展。
[0053][0054]a瘿尺寸的平均值和标准误差。未显示瘤的植物被排除在计算之外。
[0055]
当查看来自混合模型的参数估计值时，瘿尺寸随时间显著增加，平均每周增加0.76mm(表2)，并且基于目测，个体植物之间的瘤生长速率没有显著差异。
[0056]
表2：固定效应的参数估计值
[0057][0058]
对于这两个性状，区组效应解释了瘿尺寸和瘤发育前周数两者的非常小的方差(《1％，表3)。广义遗传性的范围为从瘿尺寸的0.67到瘤发育前周数的0.41(表3)。
[0059]
表3：随机效应的方差分量。
[0060][0061]a广义遗传性
[0062]
两个性状的校正表型的分布差异很大。瘿尺寸显示出双峰分布，并且亲本具有差异明显的极端性状值，而对瘤前周数观察到多峰分布。对于瘿尺寸，具有最小瘿尺寸的模式包含最大数目的个体(如果使用5的截止值，则为83％，如果使用0的截止值，则为72％)。
[0063]
瘿尺寸的分布与以下情况相容：其中单基因构成抗性的基础，该基因是显性的，并且抗性亲本含有抗性等位基因的2个拷贝，但抗性等位基因的外显性不完全。瘿尺寸为5mm或更小的校正表型的登记材料的平均瘿尺寸(14wai)为2.4mm，而校正表型高于5mm的登记材料的平均瘿尺寸(14wai)为20.8mm。
[0064]
瘿尺寸和瘤发育前周数的校正表型的基因组遗传性(狭义遗传性的代表)分别为0.57和0.51。这表明遗传学解释了个体之间的差异的一部分，但其他未知因素(例如环境)也解释了表型差异的一部分。基因组遗传性为可以用全基因组显著性标志物解释的方差提供了上限。
[0065]
使用混合模型，三个连锁群上的snp在多检验bonferroni校正后具有显著性(显著性阈值1.07*10-6
)：lg1、lg5和lg7。lg7上最显著的snp解释了高达53％的表型方差，而其他两个lg(lg1和lg5)上最显著的snp仅解释了16％的表型方差(使用线性回归)。
[0066]
查看显著性snp处的等位基因剂量，lg1和lg5上的snp共分离，表明这些snp应该映射到同一lg。使用多元回归，lg1和lg5上的三个标志物中仅有一个保持显著性的事实证实了这一观点。等位基因替代效应表明，对于最显著性的snp ax-86888149(表4)，在f1中观察到三种基因型类别，并且评分为2或3的植物具有几乎但不完全相同的小的瘿尺寸，并且评分为4的植物具有显著更大的瘿尺寸。这种情况与可加性和完全显性两者不相容，但与不完全显性相容。
[0067]
表4：ax-86888149的每种基因型的瘿尺寸的平均值和标准误差。
[0068][0069]a仅示出了所有重复均为14wai无症状的登记材料的数目
[0070]b示出了所有含有指定基因型的个体植物的数目
[0071]
在qtl区lg7(56mb和58.5mb之间)发现了五个抗性基因(表5)。
[0072]
表5：lg7上qtl峰附近参与农杆菌抗性的抗性基因
[0073]