细菌纤维素胶原蛋白创伤水凝胶敷料及其制备方法与流程

1.本发明涉及敷料技术领域，尤其是涉及细菌纤维素胶原蛋白创伤水凝胶敷料及其制备方法。


背景技术：

2.皮肤是人体最大的器官，是人体抵御外界伤害的第一道屏障。人体皮肤受伤后，伤口局部即有不同程度的组织坏死和血管断裂出血，数小时内便出现炎症反应，表现为充血、浆液渗出及白细胞游出。机体会有一系列生化程序试图进行修复和重建，基本过程包括止血期、炎症期、细胞增生期以及成熟及重塑期。在此修复期间，伤口敷料作为伤口处的覆盖物，常常起着重要作用。大部分伤口敷料对于伤口的附着能力不佳，容易脱落，脱落后容易受到细菌的感染，导致宿主组织过度和长时间的炎症反应，影响伤口的愈合。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供细菌纤维素胶原蛋白创伤水凝胶敷料的制备方法，细菌纤维素胶原蛋白创伤水凝胶敷料及其制备方法操作简单、成本低，制得的细菌纤维素胶原蛋白创伤水凝胶敷料有很好的伤口附着性和优秀的生物相容性，可以减少伤口粘连，降低换药痛苦和机械损伤。与传统伤口敷料相比，细菌纤维素胶原蛋白创伤水凝胶伤口修复率更好，阻菌率更好。在15天时，伤口修复率达90％。
4.为实现上述目的，本发明提供了细菌纤维素胶原蛋白创伤水凝胶敷料，包括细菌纤维素和胶原蛋白，细菌纤维素以木醋杆菌发酵形成，从富含胶原蛋白的牛腱片中获得ⅰ型胶原蛋白。
5.上述的细菌纤维素胶原蛋白创伤水凝胶敷料，包括三种制备方法：
6.第一种制备方法，包括以下步骤：
7.s2-1、细菌纤维素的制备：28℃条件下，将木醋杆菌在容积为100ml并含有20ml营养培养基的烧瓶中培养120小时，在空气/液体界面形成细菌纤维素薄膜，80℃条件下，将细菌纤维素薄膜浸入2wt％的naoh溶液1小时，然后浸入1wt％的naclo溶液中30分钟，浸泡结束后，用去离子水清洗，然后在120℃条件下，高压灭菌15分钟，得到细菌纤维素；
8.s2-2、胶原蛋白的的制备：从厚度为1cm的牛腱片中获取ⅰ型胶原蛋白碎片，用丙酮处理胶原蛋白碎片后得到肌腱碎片，用蒸馏水清洗5g肌腱碎片，在4℃的条件下，将肌腱碎片浸入10wt％的nacl溶液中24小时，然后用蒸馏水清洗肌腱碎片，然后在室温下浸入0.02mol/l的柠檬酸盐缓冲液中48小时，浸泡结束后，在4℃的条件下，将肌腱碎片浸入500ml 0.5mol/l的乙酸溶液中，混合均匀，静置24小时后形成凝胶，向凝胶中加入5wt％的nacl溶液，沉淀得到胶原蛋白，沉淀出的胶原蛋白用蒸馏水透析72小时后备用；
9.s2-3、通过高速分散器，把处于水介质中的细菌纤维素膜分离，得到细菌纤维素悬浮液，细菌纤维素悬浮液过筛去除过量的水，得到细菌纤维素浆液；在50℃的轨道震荡下，将0.2wt％的尼泊金酯溶解在5wt％的丙二醇中，混合均匀得到混合物，室温条件下，将混合
物加入含有细菌纤维素浆液的烧杯中，混合均匀；然后边晃动边缓慢加入3wt％的羟乙酸纤维素，直至在室温下获得凝胶稠度；然后将8wt％的胶原蛋白和去离子水加入到凝胶中，在室温下摇晃3分钟，得到细菌纤维素胶原蛋白水凝胶敷料。
10.优选的，所述s2-1中营养培养基含有2wt％的葡萄糖、0.5wt％的蛋白胨、0.5wt％的酵母提取物、0.27wt％的磷酸氢二钠和0.115wt％的柠檬酸。
11.优选的，所述s2-2中柠檬酸盐缓冲液的ph值为4.3。
12.优选的，所述s2-2乙酸溶液中含有与肌腱初始重量比例为1:50的胃蛋白酶。
13.优选的，所述s2-3细菌纤维素悬浮液过筛为37目。
14.优选的，所述s2-3制得的细菌纤维素胶原蛋白水凝胶储存在无菌容器中。
15.上述的细菌纤维素胶原蛋白创伤水凝胶敷料，包括三种制备方法：
16.第二种制备方法，包括以下步骤：
17.s8-1、每1l的胶原蛋白水溶液中加入由葡萄糖70g、酵母膏5g、na2hpo42g和蛋白胨1g配制的发酵培养基；选取能分泌细菌纤维素的木醋杆菌并将其活化，制备成种子醪液；然后将60wt％菌株浓度的种子醪液与胶原蛋白水溶液均匀混合，发酵培养6天后取出发酵产物；
18.s8-2、发酵产物在质量百分含量为4％-6％的naoh水溶液中，在30℃-40℃的温度下加热6h，然后用纯化水反复冲洗至中性，以除去菌体蛋白和粘附的残余培养基，得到细菌纤维素胶原蛋白水凝胶敷料。
19.上述的细菌纤维素胶原蛋白创伤水凝胶敷料，包括三种制备方法：
20.第三种制备方法，包括以下步骤：
21.s9-1、细菌纤维素的制备：28℃条件下，将木醋杆菌在容积为100ml并含有20ml营养培养基的烧瓶下培养120小时，在空气/液体界面形成细菌纤维素薄膜；80℃条件下，将细菌纤维素薄膜浸入2wt％的naoh溶液1小时；然后浸入1wt％的naclo溶液中30分钟，浸泡结束后；用去离子水清洗，然后在120℃条件下，高压灭菌15分钟，得到细菌纤维素；上述营养培养基含有2wt％的葡萄糖、0.5wt％的蛋白胨、0.5wt％的酵母提取物、0.27wt％的磷酸氢二钠和0.115wt％的柠檬酸；
22.s9-2、细菌纤维素的再处理：将获得的细菌纤维素在冷冻干燥机中冷冻24h，然后在80℃条件下，将其浸入0.01mol/l的2，2，5，5，-四甲基哌啶-n-氧基和0.01mol/l的辣根过氧化物酶水溶液中，并将溶液调整为20wt％，用稀盐酸稀释至溶液ph＝6；然后将其浸入40℃的1wt％的naclo溶液中30分钟，浸泡完成后，用去离子水清洗，得到处理后的细菌纤维素。
23.s9-3、每1l的胶原蛋白水溶液中加入由葡萄糖70g、酵母膏5g、na2hpo42g和蛋白胨1g配制的发酵培养基；然后与处理后的细菌纤维素混合均匀，进行发酵，24小时后取出发酵产物，发酵产物在质量百分含量为1％的naoh水溶液中，在90℃的温度下加热3h；然后用纯化水反复冲洗至中性，以除去菌体蛋白和粘附的残余培养基，经过切割得到细菌纤维素胶原蛋白水凝胶敷料。
24.本发明所述的一种细菌纤维素胶原蛋白创伤水凝胶敷料的制备方法的优点和积极效果是：
25.1、细菌纤维素胶原蛋白创伤水凝胶具有优秀的生物相容性。
26.2、细菌纤维素胶原蛋白创伤水凝胶具有特殊的功能保湿性，能为伤口提供长期的湿性环境，更有利于伤口愈合。
27.3、传统细菌纤维素膜对于创口的贴合性欠佳，细菌纤维素胶原蛋白创伤水凝胶具有脱水收缩性和粘合性，能够更好的与伤口贴附。
28.4、细菌纤维素胶原蛋白创伤水凝胶使用过程中不会出现伤口粘连，减少换药痛苦和机械损伤。
29.5、与传统伤口敷料相比，细菌纤维素胶原蛋白创伤水凝胶成本低。
30.6、与传统伤口敷料相比，细菌纤维素胶原蛋白创伤水凝胶伤口修复率更好，在15天时，伤口修复率达90％。
31.7、与传统伤口敷料相比，细菌纤维素胶原蛋白创伤水凝胶的阻菌率更好。
32.下面通过实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
具体实施方式
33.以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
34.实施例1
35.细菌纤维素胶原蛋白创伤水凝胶敷料的第一种制备方法，包括以下步骤：
36.细菌纤维素的制备：28℃条件下，将木醋杆菌在容积为100ml并含有20ml营养培养基的烧瓶下培养120小时，在空气/液体界面形成细菌纤维素薄膜；80℃条件下，将细菌纤维素薄膜浸入2wt％的naoh溶液1小时；然后浸入1wt％的naclo溶液中30分钟，浸泡结束后；用去离子水清洗，然后在120℃条件下，高压灭菌15分钟，得到细菌纤维素；上述营养培养基含有2wt％的葡萄糖、0.5wt％的蛋白胨、0.5wt％的酵母提取物、0.27wt％的磷酸氢二钠和0.115wt％的柠檬酸；
37.胶原蛋白的的制备：从厚度为1cm的牛腱片中获取ⅰ型胶原蛋白碎片；用丙酮处理胶原蛋白碎片以去除多余的脂肪组织，得到肌腱碎片；用蒸馏水清洗5g肌腱碎片；在4℃的条件下，将肌腱碎片浸入10wt％的nacl溶液中24小时；然后用蒸馏水清洗肌腱碎片，然后在室温下浸入0.02mol/l的柠檬酸盐缓冲液(ph值为4.3)中48小时，浸泡结束后；在4℃的条件下，将肌腱碎片浸入500ml0.5mol/l的乙酸溶液(含有与肌腱初始重量比例为1:50的胃蛋白酶)中，混合均匀，静置24小时后形成凝胶；向凝胶中加入5wt％的nacl溶液，沉淀得到胶原蛋白，沉淀出的胶原蛋白用蒸馏水透析72小时后备用；
38.通过高速分散器，把处于水介质中的细菌纤维素膜分离，得到细菌纤维素悬浮液；细菌纤维素悬浮液过筛去除过量的水，得到细菌纤维素浆液；在50℃的轨道震荡下，将0.2wt％的尼泊金酯溶解在5wt％的丙二醇中，混合均匀得到混合物；室温条件下，将混合物加入含有细菌纤维素浆液的烧杯中，混合均匀；然后边晃动边缓慢加入3wt％的羟乙酸纤维素，直至在室温下获得凝胶稠度；然后将8wt％的胶原蛋白和去离子水加入到凝胶中，在室温下摇晃3分钟，得到细菌纤维素胶原蛋白水凝胶敷料。制得的细菌纤维素胶原蛋白水凝胶储存在无菌容器中。
39.实施例2
40.细菌纤维素胶原蛋白水凝胶敷料的第二种制备方法，包括以下步骤：每1l的胶原蛋白水溶液中加入由葡萄糖70g、酵母膏5g、na2hpo
4 2g和蛋白胨1g配制的发酵培养基。选取
能分泌细菌纤维素的木醋杆菌并将其活化，制备成种子醪液；然后将60wt％菌株浓度的种子醪液与胶原蛋白水溶液均匀混合，发酵培养6天后取出发酵产物。
41.发酵产物在质量百分含量为4％-6％的naoh水溶液中，在30℃-40℃的温度下加热6h，然后用纯化水反复冲洗至中性，以除去菌体蛋白和粘附的残余培养基，得到细菌纤维素胶原蛋白水凝胶敷料。
42.实施例3
43.细菌纤维素胶原蛋白水凝胶敷料的第三种制备方法，包括以下步骤：28℃条件下，将木醋杆菌在容积为100ml并含有20ml营养培养基的烧瓶下培养120小时，在空气/液体界面形成细菌纤维素薄膜；80℃条件下，将细菌纤维素薄膜浸入2wt％的naoh溶液1小时；然后浸入1wt％的naclo溶液中30分钟，浸泡结束后；用去离子水清洗，然后在120℃条件下，高压灭菌15分钟，得到细菌纤维素；上述营养培养基含有2wt％的葡萄糖、0.5wt％的蛋白胨、0.5wt％的酵母提取物、0.27wt％的磷酸氢二钠和0.115wt％的柠檬酸；
44.将获得的细菌纤维素在冷冻干燥机中冷冻24h，然后在80℃条件下，将其浸入0.01mol/l的2，2，5，5，-四甲基哌啶-n-氧基和0.01mol/l的辣根过氧化物酶水溶液中，并将溶液调整为20wt％，用稀盐酸稀释至溶液ph＝6；然后将其浸入40℃的1wt％的naclo溶液中30分钟，浸泡完成后，用去离子水清洗，得到处理后的细菌纤维素。
45.每1l的胶原蛋白水溶液中加入由葡萄糖70g、酵母膏5g、na2hpo
4 2g和蛋白胨1g配制的发酵培养基；然后与处理后的细菌纤维素混合均匀，进行发酵，24小时后取出发酵产物，发酵产物在质量百分含量为1％的naoh水溶液中，在90℃的温度下加热3h；然后用纯化水反复冲洗至中性，以除去菌体蛋白和粘附的残余培养基，经过切割得到细菌纤维素胶原蛋白水凝胶敷料。
46.对比例1
47.胶原蛋白敷料的制备：从厚度为1cm的牛腱片中获取ⅰ型胶原蛋白碎片；用丙酮处理胶原蛋白碎片以去除多余的脂肪组织，得到肌腱碎片；用蒸馏水清洗5g肌腱碎片；在4℃的条件下，将肌腱碎片浸入10wt％的nacl溶液中24小时；然后用蒸馏水清洗肌腱碎片，然后在室温下浸入0.02mol/l的柠檬酸盐缓冲液(ph值为4.3)中48小时，浸泡结束后；在4℃的条件下，将肌腱碎片浸入500ml0.5mol/l的乙酸溶液(含有与肌腱初始重量比例为1:50的胃蛋白酶)中，混合均匀，静置24小时后形成凝胶；向凝胶中加入5wt％的nacl溶液，沉淀得到胶原蛋白，沉淀出的胶原蛋白用蒸馏水透析72小时；将胶原蛋白配置成10mg/ml的胶原蛋白悬浊液，取5ml的胶原蛋白悬浊液加入50μl 2mg/ml的卡波姆940和50μl的三乙醇胺，混合均匀制得胶原蛋白敷料。
48.对比例2
49.细菌纤维素软膏可以应对一般的普通外伤，且成本更低。其制备方法如下：28℃条件下，将木醋杆菌在容积为100ml且含有20ml营养培养基的烧瓶下培养120小时，在空气/液体界面形成细菌纤维素薄膜；80℃条件下，将细菌纤维素薄膜浸入2wt％的naoh溶液1小时；然后浸入1wt％的naclo溶液中30分钟，浸泡结束后；用去离子水清洗，然后在120℃条件下，高压灭菌15分钟，得到细菌纤维素。上述营养培养基含有2wt％的葡萄糖、0.5wt％的蛋白胨、0.5wt％的酵母提取物、0.27wt％的磷酸氢二钠和0.115wt％的柠檬酸。将细菌纤维素配置成10mg/ml的细菌纤维素悬浊液，取5ml的细菌纤维素悬浊液加入50μl2mg/ml的卡波姆
940和50μl的三乙醇胺，混合均匀制得细菌纤维素敷料。
50.动物试验
51.选取36只生长状况良好的成年雄性大鼠，体重为200g
±
20g，随机分为六组：五个治疗组和一个对照组。五个治疗组包括实施例1的gi组，实施例2的gii组，实施例3的giii组，对比例1的giv组，对比例2的gv组，对照组为gvi组。每组六只成年雄性大鼠。术前通过肌肉注射盐酸氯胺酮(25mg/kg)和盐酸甲苯噻嗪(5mg/kg)诱导全身麻醉。在背部区域剃毛和准备之后，用直径为6毫米的圆形手术刀在背部区域的中线切开六个伤口(间距为2厘米)。伤口深度达到表皮、真皮、皮下组织和肌肉层直至浅筋膜。所有外科手术都遵循标准的无菌操作流程。
52.第一个区域的伤口用实施例1制得的敷料填充，第二个区域的伤口用实施例2制得的敷料填充，第三个区域的伤口用实施例3制得的敷料填充，第四个区域的伤口用对比例1制得的敷料填充，第五个区域的伤口用对比例2制得的敷料填充，第六个区域的伤口仅填充血块作为对照组。
53.在所有治疗期间每天使用一次伤口敷料。大鼠在术后均即刻接受单剂量12.5mg/kg的曲马多镇痛剂的腹膜内给药。
54.然后将动物转移到适当隔离和有识别物的单独笼子中，并保证充足的食物和水，保持环境卫生。控制室温为22℃
±
2℃，湿度为60％-70％，每天光照12小时，每天监测大鼠的健康情况。在术后3天、7天、15天和30天分别观察大鼠的恢复情况，测量gi组、gii组、giii组、giv组、gv组和gvi组伤口组织修复情况(伤口大小的平均值
±
标准误差)。结果如表1所示：
55.表1
[0056][0057][0058]
潮湿条件下的阻菌性
[0059]
按照yy/t0471.5接触性创面敷料试验方法第5部分阻菌性潮湿条件下的阻菌性步骤测定。水凝胶敷料的厚度为3mm，试验中的肉汤瓶中应无粘质沙雷菌生长。结果如表2所示：
[0060]
表2
[0061]
创面敷料阻菌率/％阻菌性实施例196.73未检出实施例297.25未检出实施例397.44未检出对比例193.64未检出对比例293.05未检出
[0062]
因此，本发明采用上述细菌纤维素胶原蛋白创伤水凝胶敷料的制备方法，制得的细菌纤维素胶原蛋白创伤水凝胶敷料有很好的伤口附着性和优秀的生物相容性，可以减少伤口粘连，降低换药痛苦和机械损伤。与传统伤口敷料相比，细菌纤维素胶原蛋白创伤水凝胶伤口修复率更好，在15天时，伤口修复率达90％。与传统伤口敷料相比，细菌纤维素胶原蛋白创伤水凝胶的阻菌率更好。
[0063]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。