一种调节情绪的益生菌组合物、制剂及制备方法和应用与流程

1.本发明属于益生菌技术领域，具体涉及一种调节情绪的益生菌组合物、制剂及制备方法和应用。


背景技术：

2.近年来，人们逐渐从人体中分离出益生菌菌株，从益生菌的菌种定位至菌株水平，开发安全菌株的功能方向，比如干酪乳杆菌、lgg和bb12这些明星菌株，在多种疾病(肥胖、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝和心脑血管等) 中发挥了重要的作用。
3.据世界卫生组织统计，目前全球抑郁症患者已达到3.22亿，占全球范围内总人口数的4.3％。抑郁症严重影响着我们的健康、学习和日常生活。而目前抑郁症的主要治疗是进行药物治疗，存在很大的副作用。因此，一款天然、无毒副作用的抗抑郁制剂已成为科研工作者攻克的难题和研究热点。而国内外研究表示益生菌菌株可显著缓解抑郁和焦虑情绪。因此，筛选出具有本国知识产权的抗焦虑和抑郁情绪的益生菌菌株对于开发新型微生态制剂和功能性健康食品具有重要意义。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种调节情绪的益生菌组合物、制剂及制备方法和应用，耐酸耐胆汁盐肠道定植能力强，并且能够抗焦虑和忧郁情绪，使心情愉悦。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种调节情绪的益生菌组合物，包括鼠李糖乳杆菌 (lactobacillus rhamnosus)和发酵乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)的共发酵物。
7.优选的，所述鼠李糖乳杆菌包括鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus) ai-11，保藏编号为cgmcc no.21745；
8.所述发酵乳杆菌包括发酵乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)ai-25，保藏编号为cgmcc no.21746。
9.本发明还提供了上述益生菌组合物的制备方法，包括以下步骤：将所述鼠李糖乳杆菌和发酵乳杆菌共同接种于mrs肉汤培养基中进行厌氧发酵，发酵液中包含所述益生菌组合物；
10.所述鼠李糖乳杆菌和发酵乳杆菌的接种体积分别为所述mrs肉汤培养基的1％。
11.优选的，所述厌氧发酵的温度为36～38℃，所述厌氧发酵的时间为 20～26h。
12.本发明还提供了一种调节情绪的益生菌制剂，原料包括利用上述制备方法得到的发酵液。
13.优选的，所述益生菌制剂的剂型包括液态菌制剂或菌粉制剂。
14.优选的，所述益生菌制剂包括以所述发酵液作为液态菌制剂，或对所述发酵液进行浓缩后作为液态菌制剂，或从所述发酵液中分离出菌体后重悬得到的液态菌制剂；
15.还包括将所述发酵液干燥后制备得到的菌粉，或从所述发酵液中分离出菌体后制
备菌粉。
16.本发明还提供了上述益生菌组合物或上述益生菌制剂在制备调节肠道菌群、抗焦虑和抑郁情绪的产品中的应用。
17.优选的，所述产品包括食品、饲料或药品。
18.优选的，所述食品包括固体饮料、发酵乳制品或含乳饮料。
19.有益效果：本发明提供了一种调节情绪的益生菌组合物，所述益生菌组合物可耐受ph2.5的胃酸液，2h后的活菌存活率达到100％；同时可耐受 0.09％甚至更高浓度的胆汁盐浓度，保证能够有效经过胃酸环境，到达肠道定植。本发明实施例中，所述益生菌组合物可以很好的预防小鼠焦虑及忧郁情绪，较明星菌株瑞士乳杆菌r52和长双歧杆菌r175有优势，可将所述益生菌组合物用于食品、饲料或药品的生产。
附图说明
20.图1为鼠李糖乳杆菌ai-11(a)和发酵乳杆菌ai-25(b)的革兰氏染色后菌体形态图。
21.生物保藏信息
22.鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)ai-11，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年01月26日。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.21745；
23.发酵乳杆菌(lactobacillus fermentum)ai-25，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年01月26日。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为 cgmcc no.21746。
具体实施方式
24.本发明提供了一种调节情绪的益生菌组合物，包括鼠李糖乳杆菌 (lactobacillus rhamnosus)和发酵乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)的共发酵物。
25.本发明对所述鼠李糖乳杆菌的类型并没有特殊限定，实施例中优选鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)ai-11，保藏编号为cgmcc no.21745，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。本发明对所述发酵乳杆菌的类型并没有特殊限定，实施例中优选发酵乳杆菌(lactobacillus rhamnosus) ai-25，保藏编号为cgmcc no.21746，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。
26.本发明所述共发酵物优选为将所述鼠李糖乳杆菌和发酵乳杆菌共同接种于mrs肉汤培养基中进行厌氧发酵，得到的产物即为共发酵物。
27.本发明还提供了上述益生菌组合物的制备方法，包括以下步骤：将所述鼠李糖乳杆菌和发酵乳杆菌共同接种于mrs肉汤培养基中进行厌氧发酵，发酵液中包含所述益生菌组合物；
28.所述鼠李糖乳杆菌和发酵乳杆菌的接种体积分别为所述mrs肉汤培养基的1％。
29.在本发明中，所述鼠李糖乳杆菌和发酵乳杆菌的接种量优选为1:1，且共同接种于mrs肉汤培养基中，进行厌氧发酵，所述厌氧发酵的温度优选为36～38℃，更优选为37℃。本发明所述厌氧发酵的发酵时间优选为20～26h，更优选为24h。本发明对所述mrs肉汤培养基
rhamnosus)，序列相似性高达100％。因此结合形态和分子鉴定，确定ai-11菌株属于鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)。
42.发酵乳杆菌ai-25的单菌落形态为透明色，表面凸起，边缘呈规则圆形，菌株形态为直杆，长短不一，排列规则。经过16s rdna分子鉴定，发现ai-25 菌株的16s rdna序列(seq id no.2)同源性最高的为发酵乳杆菌属 (lactobacillus fermentum)，序列相似性高达100％。因此结合形态和分子鉴定，确定ai-25菌株属于发酵乳杆菌(lactobacillus fermentum)。
43.吸取静置培养20～24h的菌混悬液按1％接种量接种至mrs肉汤培养基中，放置37℃培养箱静置培养20～24h，作传代操作，重复传代3次；于无菌冻存管中加入40％甘油与传代2次的益生菌菌液，体积比例为1:1。放置
ꢀ‑
20℃储存。
44.实施例2
45.菌株的安全性评价
46.将实施例1得到的-20℃冻存的甘油管鼠李糖乳杆菌ai-11和发酵乳杆菌 ai-25接种复苏于正常mrs肉汤培养基中，进行3次转接活化培养(37℃厌氧培养24h)，活化后的培养液用于抗生素敏感性实验。
47.将活化后的鼠李糖乳杆菌ai-11和发酵乳杆菌ai-25取0.5ml，均匀涂布于mrs琼脂平皿表面，待吹干，将庆大霉素、万古霉素、卡那霉素、克林霉素、链霉素、氨苄西林、青霉素、红霉素、氯霉素的药敏纸片贴在琼脂表面，置于37℃培养箱培养24h，观察琼脂表面菌株的生长情况。若抗生素纸片周围出现明显的透明圈，则用直尺测量透明圈的直径以判断供试菌株是否具有药敏性。同时选用金黄色葡萄球菌作为药敏实验的质控菌株。供试菌株是否具有对各种抗生素的抗性依据美国临床和实验室标准化协会 (clinical and laboratory standards institute，clsi)制定的相关标准(见表1) 判断。
48.表1药敏纸片含量及抗药性判断标准
49.50.表2 k-b纸片扩散的实验结果
[0051][0052]
注：表中“s”表示益生菌对抗生素表现出敏感s效果，“i”表示益生菌对抗生素表现出中介i效果，“r”表示益生菌对抗生素表现出耐药r效果，“/”表示益生菌无需进行此抗生素的安全性评估。
[0053]
k-b纸片扩散实验结果显示，鼠李糖乳杆菌ai-11和发酵乳杆菌ai-25 对九种抗生素的敏感性都很高，均不耐药，因此，是安全的。
[0054]
实施例3
[0055]
共培养菌株对胃酸液的耐受性实验
[0056]
将实施例1得到的-20℃冻存的甘油管菌株，接种复苏于正常mrs肉汤培养基中，进行3次转接活化培养，活化后的鼠李糖乳杆菌ai-11和发酵乳杆菌ai-25分别以1％的接种量接种到mrs肉汤培养基中，37℃厌氧培养 24h，取培养好的组合菌按照10％的比例分别接种于ph分别为1.5、2.5、3.5、 4.5的mrs肉汤培养基中，放置37℃培养箱，分别在接种后的第0h、1h、 2h取样作计数处理。
[0057]
结果如表3所示，鼠李糖乳杆菌ai-11和发酵乳杆菌ai-25的组合可耐受ph2.5及以上的酸性环境，在ph 2.5中3h，仍可100％存活，具有较好的耐受能力。
[0058]
表3鼠李糖乳杆菌ai-11
※
发酵乳杆菌ai-25耐酸能力评估(单位：cfu/ml)
[0059][0060]
实施例4
[0061]
共培养菌株体外胆汁盐耐受性实验
[0062]
将实施例1得到的-20℃冻存的甘油管菌株，接种复苏于正常mrs肉汤培养基中，进行3次转接活化培养，活化后的鼠李糖乳杆菌ai-11和发酵乳杆菌ai-25按分别以1％接种体积接种mrs肉汤，37℃厌氧培养24h，取培养好的组合菌按照10％的比例分别接种于不同浓度的胆汁盐，在接种后的第 0h、1h、2h取样作计数处理。
[0063]
结果如表4所示，鼠李糖乳杆菌ai-11和发酵乳杆菌ai-25的组合(记作鼠李糖乳杆菌ai-11
※
发酵乳杆菌ai-25)可耐受0.09％及以下浓度胆汁盐。
[0064]
表4鼠李糖乳杆菌ai-11
※
发酵乳杆菌ai-25耐牛胆汁盐能力评估(单位：cfu/ml)
[0065][0066]
实施例5
[0067]
共培养菌株预防小鼠抗焦虑和忧郁情绪实验
[0068]
将鼠李糖乳杆菌ai-11和发酵乳杆菌ai-25分别以1％接种量接种mrs 肉汤，37℃厌氧培养24h，于4℃、2500rpm下离心10min，收集菌体，磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤后4℃以下保存。用于后续的实验研究。
[0069]
1、实验分组
[0070]
八周大spf级icr小白鼠进行试验，体重介于20～25g之雄性小白鼠经一周稳定其后进行六周的实验饲养。动物房温度控制在23℃
±
2℃，湿度控制在60％～80％，光照与黑暗各十二小时(07:00～19:00为光照期； 19:00～07:00为黑暗期)。随机分为4组，每组12只。分组如下：
[0071]
①
空白组：喂食普通饲料，灌胃生理盐水；
[0072]
②
实验组：灌胃瑞士乳杆菌r52组；
[0073]
③
实验组：灌胃长双歧杆菌r175组；
[0074]
④
实验组：灌胃鼠李糖乳杆菌ai-11
※
发酵乳杆菌ai-25组；
[0075]
连续灌胃4周，每天0.4ml(1
×
108cfu/ml菌株悬浮液)。
[0076]
2、明暗箱行为学实验
[0077]
在安静环境下，将动物放入长宽高分别为80、80、40cm的箱内(一半有遮挡为暗箱，一半敞箱为明箱)，将动物放入敞箱后开始测定，每次计时 10min，记录单位时间内动物在亮箱中停留的总时间，小鼠在亮处停留时间越长说明小鼠越不焦虑。结果见表5。结果显示鼠李糖乳杆菌ai-11
※
发酵乳杆菌ai-25灌胃的小鼠情绪较空白组稳定，不焦虑，且由于瑞士乳杆菌 r52组和长双歧杆菌组r175。
[0078]
表5小鼠在明暗箱停留的时间(单位：s)
[0079]
分组停留时间空白对照171.30
±
43.99瑞士乳杆菌r52209.91
±
36.85a长双歧杆菌r175221.00
±
43.56a鼠李糖乳杆菌ai-11
※
发酵乳杆菌ai-25256.63
±
38.85
abc
[0080]
注：a表示与空白组比较，p＜0.5；b表示与瑞士乳杆菌r52组比较，p ＜0.5；c表示与长双歧杆菌r175组比较，p＜0.5。
[0081]
3、高架十字迷宫行为学实验
[0082]
实验装置包括两个开臂和两个闭臂，开臂由两个两边长为100cm平台构成无护栏；闭臂由两个两边长为100cm平台构成，合臂边缘有20cm护栏。测试中，将测试小鼠放置在十字中央区域，随即开始记录与观察小鼠在开臂中停留的时间，测试进行5min。与对照相比，在开臂停留时间越短表明小鼠对新环境的探究能力差，从而体现出焦虑抑郁样行为，结果见表6。结果显示鼠李糖乳杆菌ai-11
※
发酵乳杆菌ai-25灌胃的小鼠情绪较空白组稳定，不焦虑，且由于瑞士乳杆菌r52组和长双歧杆菌组r175。
[0083]
表6小鼠在开放臂停留时间(单位：s)
[0084]
分组停留时间空白对照38.21
±
16.42瑞士乳杆菌r5265.50
±
18.04a长双歧杆菌r17540.62
±
14.93鼠李糖乳杆菌ai-11
※
发酵乳杆菌ai-2574.60
±
18.82
ab
[0085]
注：a表示与空白组比较，p＜0.5；b表示与长双歧杆菌r175组比较， p＜0.5。
[0086]
4、强迫游泳行为学实验
[0087]
强迫游泳实验是经典的抑郁模型，通过小鼠在水面漂浮的不动时间可以检测小鼠抑郁行为。强迫游泳实验前，分别将小鼠置于强迫游泳缸(水深10 cm、直径16cm、水温保持在25℃)内进行预适应游泳15min，然后用毛巾擦干，24h后进行强迫游泳6min，计算小鼠后4min在水面漂浮的累计不动时间。不动时间判断标准：小鼠停止挣扎或呈漂浮状态，四肢有轻微动作以保持在水面漂浮即为不动，结果见表7。结果显示鼠李糖乳杆菌ai-11
※
发酵乳杆菌ai-25灌胃的小鼠情绪较空白组稳定，不焦虑，与瑞士乳杆菌 r52组和长双歧杆菌组r175无明显差异。
[0088]
表7小鼠在水平静止时间(单位：s)
[0089][0090][0091]
注：a表示与空白组比较，p＜0.5。
[0092]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。