BPMG蛋白在食蟹猴重复超数排卵应答效果预测中的应用

bpmg蛋白在食蟹猴重复超数排卵应答效果预测中的应用
技术领域
1.本发明涉及超数排卵技术领域，更具体地，涉及bpmg蛋白在食蟹猴重复超数排卵应答效果预测中的应用。


背景技术：

2.超数排卵即超排，是指通过人为添加外源性促性腺激素，使动物卵巢内更多的卵泡发育生长，结合人工授精或取卵手术，收集到多于生理数量的胚胎或成熟卵母细胞，是重要的辅助生殖手段，在动物的种群扩繁、生殖力保存等领域广泛应用。食蟹猴在分子进化上十分接近人类，除生理学、解剖学、免疫学以及神经学等方面与人类相似之外，还具有其他动物模型所没有的独特相似性，是生物医学研究中最常用的非人灵长类动物。食蟹猴卵母细胞是一种非常重要的研究材料，但由于食蟹猴一个生殖周期只能产生一个成熟卵母细胞，而生物医学研究中需要大量的优质卵子，从自然周期获取卵母细胞数量远远不能达到实践需求，因此通过超数排卵获取大量优质卵母细胞是满足此类科研和生产需求的不可或缺的关键技术。
3.食蟹猴超排中存在一种“不应答/应答不良”现象，即对供体母猴给予了一系列外源性促性腺激素刺激后，在取卵手术中并不能获取到或仅能获取个位数量的成熟卵母细胞，且这类食蟹猴再次纳入下次超排程序中也难以再次良好应答，对科研生产有极大的不利影响。一只成年雌性食蟹猴成功超排次数可达6次以上，然而不论是文献还是生产实践中，相当一部分雌猴难以达到此超排次数，多数食蟹猴在一到两次超排后便由于应答不良且难以恢复而被淘汰。超排过程往往投入了巨大的人力物力财力和时间，超排失败则意味着极大的成本损失。因此能够在超排前筛选出适合重复超排的食蟹猴或在超排早期预测超排效果具有重大的意义。


技术实现要素：

4.本发明为了克服现有技术中存在的上述问题，首先提供了bpmg蛋白在食蟹猴重复超数排卵应答效果预测中的应用。
5.本发明的目的通过以下技术方案实现：
6.bpmg蛋白在食蟹猴重复超数排卵应答效果预测中的应用。
7.目前食蟹猴超数排卵供体母猴的筛选主要是通过b超探查母猴的生殖系统，检查子宫和卵巢的健康状况，并结合性激素测定判断其所处的生殖周期且是否与b超结果相符，将生殖系统状况良好的母猴纳入超排猴群。这种方法在超排猴群的建立中是必不可少的，然而卵泡发育的影响因素异质性较大，仅从生殖系统的形态学判断其是否适合纳入超排是不够的，且在重复超排的猴群中，b超检查的准确性相较于首次超排会大打折扣，难以在超排前通过这种方式预测超排效果，只能在某次超排失败后将这些母猴淘汰。目前应用最多的在食蟹猴超排过程中预测超排应答效果的方式为b超检查，在超数排卵的中后期对供体母猴的卵巢进行卵泡发育情况、窦卵泡数量及大小的探查，可以一定程度上预测最终的超
排效果，但准确度不高。且由于卵泡发育在超排初期并不明显，难以通过b超探查到卵泡的发育情况，所以目前并没有可靠方法能够在超排程序的初期对取卵日超排效果的预测。食蟹猴的超数排卵程序通常需要对每只供体母猴进行连续10天以上的促性腺激素注射，此过程中会消耗大量的人力和昂贵的激素，若最终超排失败则意味着重大的损失和浪费。因此，如果能够越早预测超排效果则可以越早终止超排程序而减少损失，且有更多时间来调整科研实验计划。在本次实验中采用的是dia非标定量的技术，该技术将质谱整个扫描范围分为若干个窗口，并且高速、循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂以及检测。因此，与传统的dda技术相比，dia可以将样本中的全部碎片信息都收集，数据利用度大大提高，缺失值少，具有较高的低丰度蛋白的检测率。
8.从蛋白质定性分析中可以得知，bpmg水平在失败组中第二次超排较第一次升高。bpgm是一种糖酵解中间体，在缺氧状态下是红细胞供氧的重要调节剂，能够将1,3-bpg转化为2,3-bpg，2,3-bpg的升高有利于氧分子从血红蛋白向外周组织卸载，是组织缺氧的适应性变化。氧气对卵母细胞的成熟至关重要，目前卵泡内的氧气调节并不清楚。目前唯一一篇针对bpgm在卵母细胞中表达的研究通过比较不同氧含量培养体外成熟的coc和卵丘细胞，发现bpgm在体外成熟培养的卵母细胞中表达失调，成熟的卵母细胞内血红蛋白丰富，表明其潜在的氧调节功能，然而在体外成熟中，血红蛋白显著降低。因此bpgm与血红蛋白的稳定相互作用是卵母细胞成熟和发育潜力的重要影响因素。
9.优选的，bpmg蛋白作为食蟹猴超数排卵良好应答预测的负调控因子，通过检测重复超排程序中每次超排第一天供体母猴血浆中bpmg的水平，分析其在此次超排第一天和上次超排第一天的变化情况，在重复超排前即可预测此次超排效果。
10.因此，进行重复超排时，在每次超排第一天第一针fsh前采集食蟹猴血液，检测并记录血浆bpmg的水平，在此次超排前将bpmg水平与上次超排进行对比，若此次超排中供体母猴血浆的bpmg水平较上次升高且幅度大于两倍，则可能预示此次超排应答失败。
11.当然，食蟹猴超数排卵时，以按照下列步骤去筛选实验：
12.步骤一：根据月经记录筛选猴群中月经周期规律的健康雌性食蟹猴20只，在观察到食蟹猴月经后记为超排d1，第一针fsh的注射由d1晚上八点开始，而后早晚八点各一针，持续至d10早上注射后停止。hcg扳机在d11晚上注射，于注射34～36小时后实施腹腔镜取卵术。fsh和hcg均为肌肉注射。20只食蟹猴共重复超排四次，每次间隔时间不少于两个月。
13.步骤二：保定食蟹猴后，采血选择前肢头静脉或后肢小隐静脉，目标区域剃去毛发，随后用碘伏和75％酒精棉球对皮肤消毒，采血针扎入血管出血后迅速连接edta-k2抗凝采血管，每次采集血液2ml。轻轻上下晃动使edta-k2与血液充分混合，防止局部凝血。静置20分钟后，4500rpm离心5分钟，将血浆分装至1.5ml离心管中，标上编号并放置于-80℃待检。血液采集于超排d1、d2和d5的下午。
14.步骤三：将腹腔镜取卵术回收的成熟卵母细胞(mⅰ mⅱ)数小于等于6枚定义为超排失败。从经历了三次超排刺激后的20只食蟹猴中，选取3只仅第一次超排成功第二、三次均失败的食蟹猴作为失败组，3只三次超排刺激均成功的食蟹猴为成功组。整理出以上食蟹猴第一至三次超排d1的血浆、第二次超排的d2血浆，共24个血浆样本。分为失败组第一次超排d1(f-1-d1)、失败组第二次超排d1(f-2-d1)、失败组第二次超排d2(f-2-d2)、失败组第三次超排d1(f-3-d1)、成功组第一次超排d1(s-1-d1)、成功组第二次超排d1(s-2-d1)、成功组
第二次超排d2(s-2-d2)和成功组第三次超排d1(s-3-d1)八个组。
15.步骤四：上述样本的蛋白质组检测获取蛋白质组数据后f-1-d1、f-2-d1和f-3-d1三组间两两对比，s-1-d1、s-2-d1和s-3-d1三组间两两对比，成功组与失败组同次超排d1之间对比，第二次超排中成功组和失败组各自d1与d2对比，以及第二次超排中成功组d2和失败组d2间比较，联合或独立分析各组间差异数据。
16.步骤五：将样品变性提取、萃取纯化后于碳酸氢铵中复溶，然后用bradford法定量。质谱采用lc-ms/ms串联质谱，下机的dda数据使用maxquant整合的andromeda引擎完成鉴定，接着利用该结果进行谱图库构建。对于大规模的dia数据，使用构建好的谱图库信息去完成数据的去卷积提取，使用mprophet算法完成数据的分析质控，从而获得大量可靠的定量结果。本流程还会完成go、pathway等功能注释分析。并基于定量结果，完成不同比较组间差异蛋白的查找，最后进行相应差异蛋白富集分析和探讨。
17.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
18.本发明通过检测重复超排程序中每次超排第一天供体母猴血浆中gpld1的水平，分析其在此次超排第一天和上次超排第一天的变化情况，在重复超排前即可预测此次超排效果。蛋白质作为生命活动的最终执行者，相较于基因组学和转录组学，蛋白质组学通过鉴定组织、细胞中已经表达出来的蛋白质类别、表达水平、修饰和互作，进而分析其在生理、病理过程中发挥的功能，是一种更为直接的生物信息学分析方法。将同一批食蟹猴均重复超排四次，分析四次超排成功的食蟹猴和仅第一次成功的食蟹猴在超排第一天、超排第二天的血浆中的蛋白质组学变化，比较可重复超排和不可重复超排食蟹猴之间蛋白表达的差异，拟筛选出能够预测食蟹猴个体是否可重复超排的标志性蛋白分子，以及能够在超排前或超排第二天预测最终超排效果的蛋白分子，以及在超排早期甚至超排前筛选出可重复超排个体，实现超排高效化，大大节省食蟹猴超数排卵的时间和经济成本。
19.上述预测为食蟹猴重复超数排卵应答效果预测提供了新的方法，具有实际的应用价值。
附图说明
20.图1为本发明dia定量实验流程图；
21.图2为本发明组间差异蛋白数量柱状图。
具体实施方式
22.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
23.下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
24.一、超数排卵实验过程
25.根据月经记录筛选猴群中月经周期规律的健康雌性食蟹猴20只，在观察到食蟹猴月经后记为超排d1，第一针fsh的注射由d1晚上八点开始，而后早晚八点各一针，持续至d10早上注射后停止。hcg扳机在d11晚上注射，于注射34～36小时后实施腹腔镜取卵术。fsh和
hcg均为肌肉注射。20只食蟹猴共重复超排四次，每次间隔时间不少于两个月。
26.二、蛋白质组学检测及结果分析
27.保定食蟹猴后，采血选择前肢头静脉或后肢小隐静脉，目标区域剃去毛发，随后用碘伏和75％酒精棉球对皮肤消毒，采血针扎入血管出血后迅速连接edta-k2抗凝采血管，每次采集血液2ml。轻轻上下晃动使edta-k2与血液充分混合，防止局部凝血。静置20分钟后，4500rpm离心5分钟，将血浆分装至1.5ml离心管中，标上编号并放置于-80℃待检。血液采集于超排d1、d2和d5的下午。
28.将腹腔镜取卵术回收的成熟卵母细胞(mⅰ mⅱ)数小于等于6枚定义为超排失败。从经历了三次超排刺激后的20只食蟹猴中，选取3只仅第一次超排成功第二、三次均失败的食蟹猴作为失败组，3只三次超排刺激均成功的食蟹猴为成功组。整理出以上食蟹猴第一至三次超排d1的血浆、第二次超排的d2血浆，共24个血浆样本。分为失败组第一次超排d1(f-1-d1)、失败组第二次超排d1(f-2-d1)、失败组第二次超排d2(f-2-d2)、失败组第三次超排d1(f-3-d1)、成功组第一次超排d1(s-1-d1)、成功组第二次超排d1(s-2-d1)、成功组第二次超排d2(s-2-d2)和成功组第三次超排d1(s-3-d1)八个组。
29.上述样本的蛋白质组检测获取蛋白质组数据后f-1-d1、f-2-d1和f-3-d1三组间两两对比，s-1-d1、s-2-d1和s-3-d1三组间两两对比，成功组与失败组同次超排d1之间对比，第二次超排中成功组和失败组各自d1与d2对比，以及第二次超排中成功组d2和失败组d2间比较，联合或独立分析各组间差异数据。筛选出失败组第一次超排第一天与失败组第二次超排第一天之间的差异蛋白，和成功组第一次超排第一天与成功组第二次超排第一天之间的差异蛋白。得到这两组差异蛋白后，剔除两组共有的上调蛋白和下调蛋白，从而得出两组间独特变化的差异蛋白。
30.实验结果：将样品变性提取、萃取纯化后于碳酸氢铵中复溶，然后用bradford法定量。质谱采用lc-ms/ms串联质谱，下机的dda数据使用maxquant整合的andromeda引擎完成鉴定，接着利用该结果进行谱图库构建。对于大规模的dia数据，使用构建好的谱图库信息去完成数据的去卷积提取，使用mprophet算法完成数据的分析质控，从而获得大量可靠的定量结果。本流程还会完成go、pathway等功能注释分析。并基于定量结果，完成不同比较组间差异蛋白的查找，最后进行相应差异蛋白富集分析和探讨。
31.在蛋白质组学分析中，bpmg水平在失败组中第二次超排较第一次升高，而成功组中没有明显变化。bpgm是一种糖酵解中间体，在缺氧状态下是红细胞供氧的重要调节剂，能够将1,3-bpg转化为2,3-bpg，2,3-bpg的升高有利于氧分子从血红蛋白向外周组织卸载，是组织缺氧的适应性变化。氧气对卵母细胞的成熟至关重要，目前卵泡内的氧气调节并不清楚。目前唯一一篇针对bpgm在卵母细胞中表达的研究通过比较不同氧含量培养体外成熟的coc和卵丘细胞，发现bpgm在体外成熟培养的卵母细胞中表达失调，成熟的卵母细胞内血红蛋白丰富，表明其潜在的氧调节功能，然而在体外成熟中，血红蛋白显著降低。因此bpgm与血红蛋白的稳定相互作用是卵母细胞成熟和发育潜力的重要影响因素，重复超排程序中，若此次超排第一天血浆bpmg水平较上次超排第一天升高(幅度大于两倍)，则可能预示此次超排失败。