一种髓过氧化物酶检测试剂盒的制作方法

1.本发明属于体外诊断试剂领域，具体涉及一种髓过氧化物酶检测试剂盒。


背景技术：

2.髓过氧化物酶(myeloperoxidase,mpo)，是一种血红素蛋白，富含于中性粒细胞中,由粒细胞进入循环之前在骨髓内合成并存储于噬天青颗粒内。外界刺激可导致中性粒细胞聚集，从而释放髓过氧化物酶。mpo的相对分子量为150kda，是由两个亚单位通过共价结合形成的四聚体，每个亚单位又有一条重链α(相对分子量60kda)和一条轻链β链(相对分子量为15kda)构成。
3.目前，mpo被认为是最有前景的心血管标志物，体内mpo含量升高预示着有动脉硬化以及冠心病的风险，是心肌梗死的早期预警，比其他指标如肌钙蛋白t、ck-mb以及crp更灵敏，更早地诊断和危险评估。在胸痛发生2h内mpo水平即可明显升高，所以，对于胸痛患者而言，mpo对于诊断急性冠脉综合征(acs)将有更重要的临床意义。
4.mpo对于超早期心血管疾病风险预测，可应用于健康体检。
5.目前常用的检测方法有elisa检测方法、化学发光法、胶体金法和胶乳免疫比浊法，elisa检测方法操作繁琐，耗时长，化学发光法需要特殊仪器，成本相对较高，胶体金法灵敏度较差，目前胶乳免疫比浊法虽可以使用自动化仪器，但灵敏度也不高，线性范围只能达到1500ng/ml，但是不同心梗阶段病人的mpo数值差距巨大，可从6.25至6000ng/ml，而不同阶段的数值又代表心梗的严重程度，因而对mpo进行准确定量是具有积极的临床意义的。已有研究使用磁性纳米颗粒来增加胶乳方法的灵敏度和线性范围，fe3o4磁性纳米颗粒是磁性纳米粒子中性能最为优良，用途最为广泛的磁性材料之一。但由于fe3o4容易聚集，加之胶乳本身也具有聚集性，常常导致溶液不均匀，难以达到准确定量的要求。
6.因此如何提高髓过氧化物酶检测灵敏度和线性范围是亟待解决的问题。


技术实现要素：

7.为了解决上述技术问题，提高髓过氧化物酶检测灵敏度和线性范围，本发明提供了一种胶乳增强免疫比浊法的髓过氧化物酶检测试剂盒，通过对胶乳颗粒的特殊处理，实现了高灵敏度，宽线性范围，而且可配合全自动生化分析仪使用。
8.具体的，本发明的技术方案如下：
9.一种髓过氧化物酶检测试剂盒，包括试剂r1、试剂r2、校准品和质控品；
10.所述试剂r1包括缓冲液、表面活性剂、防腐剂；
11.所述试剂r2包括缓冲液、包被抗体的胶乳颗粒、表面活性剂、分散剂、防腐剂；
12.所述校准品包括缓冲液、髓过氧化物酶、牛血清蛋白、海藻糖、防腐剂；
13.所述质控品包括缓冲液、髓过氧化物酶、牛血清蛋白、海藻糖、防腐剂；
14.其中，所述包被抗体的胶乳颗粒的组分包括：鼠抗人mpo单克隆抗体、聚苯乙烯、聚丙烯酸、fe3o4磁性纳米颗粒、氧化石墨烯。
15.优选的，所述试剂r1成分的含量如下：
16.缓冲液
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10～200mmol/l
17.表面活性剂
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10～20ml/l
18.防腐剂
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0.2～1g/l；
19.优选的，所述试剂r2成分的含量如下：
[0020][0021]
优选的，所述校准品成分的含量如下：
[0022][0023]
优选的，所述质控品成分的含量如下：
[0024][0025]
更优选的，所述试剂r1成分的含量如下：
[0026]
缓冲液
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100mmol/l
[0027]
表面活性剂
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15g/l
[0028]
防腐剂
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0.5g/l；
[0029]
更优选的，所述试剂r2成分的含量如下：
[0030][0031]
优选的，所述缓冲液包括但不限于mes缓冲液(25℃下ph为7)、硼酸缓冲液、硼砂缓冲液或硼酸-硼砂缓冲液、tris缓冲液、hepes缓冲液、柠檬酸缓冲液。
[0032]
优选的，所述试剂r1表面活性剂包括但不限于壬基酚聚氧乙烯醚、聚乙烯胺、tween20、chaps、op，本领域技术人员认为可行的表面活性剂种类均在本发明的保护范围之内。
[0033]
优选的，所述分散剂包括但不限于焦磷酸钠、十二烷基磺酸钠、聚乙二醇，本领域技术人员认为可行的分散剂种类均在本发明的保护范围之内。
[0034]
优选的，所述防腐剂包括但不限于甲基异噻唑啉酮、proclin系列防腐剂，本领域技术人员认为可行的防腐剂种类均在本发明的保护范围之内。
[0035]
优选的，所述试剂r1和试剂r2的体积比为3:1。
[0036]
进一步的，包被抗体的胶乳颗粒的制备方法如下：
[0037]
(1)采用羧基修饰聚苯乙烯与聚丙烯酸胶乳颗粒，直径为100～300um，使用活化的mes缓冲液悬浮共聚胶乳微球，制备浓度为0.5～2％w/v的共聚胶乳微球悬浮液；
[0038]
(2)向微球悬浮液加入0.1％(质量)的fe3o4磁性纳米颗粒、0.01％(质量)的氧化石墨烯、edc，20～30℃孵育15～20min，再次加入edc，继续20～30℃孵育15～20min，得到孵育后的乳胶微球；
[0039]
(3)孵育后的乳胶微球静置30min，取上清液，去除未结合的fe3o4磁性纳米颗粒和氧化石墨烯，并使用等体积的mes缓冲液进行清洗，得到微球悬浮液a；
[0040]
(4)用缓冲液溶解鼠抗人mpo单克隆抗体至浓度为0.1～0.5mg/ml，将溶解后的溶液加入(3)中的微球悬浮液a，同时不断搅拌，20～30℃孵育4h；
[0041]
(5)向(4)最终得到的溶液中加入乙醇胺，持续搅拌并20～30℃孵育10～15min；
[0042]
(6)对(5)最终得到的溶液用磁铁进行吸附，离心，去除上清液，移除未结合的鼠抗人mpo单克隆抗体和乙醇胺，之后使用pbs缓冲液进行悬浮，得到包被抗体的胶乳颗粒。
[0043]
进一步的，上述步骤(3)中，fe3o4磁性纳米颗粒的制备方法包括但不限于共沉淀法、微乳液法、溶胶-凝胶法和溶剂热法；包被抗体的胶乳颗粒以edc为活化体系，edc起偶联的主要作用，edc的含量直接影响抗体和微球的偶联效率，过量的edc会使相邻微球上的抗体偶联导致微球聚集或者中和微球表面的羧基，影响试剂稳定性。
[0044]
优选的，本发明fe3o4磁性纳米颗粒的制备方式为溶胶-凝胶法，具体步骤如下：以fe(no3)3·
9h2o作为铁源，使其溶解在乙二醇中，然后在80℃制得溶胶，经过3步烘干处理，在真空条件下对所得粉末进行退火，得到fe3o4纳米颗粒。
[0045]
本发明的试剂盒加入待测抗原时，上述包被了抗体的胶乳微球之间因为抗原抗体的特异性结合而彼此交联，进而造成浊度上升，待测抗原愈多，吸光度变化愈多，进而通过
测定样品吸光度的变化，以及根据标准曲线能计算出样本中待测抗原的含量。
[0046]
本发明的有益效果在于：
[0047]
1.本发明提供一种灵敏度高、线性范围宽的髓过氧化物酶检测试剂盒，在制备胶乳微球时，添加了fe3o4磁性纳米颗粒和氧化石墨烯(go)，氧化石墨烯表面含有大量含氧官能团，由于这些含氧官能团的存在，氧化石墨烯在水或其它有机溶剂中具有良好的分散性能，go从边缘因悬挂键及大量含氧官能团的存在而极其亲水，可以吸附羧基修饰聚苯乙烯与聚丙烯酸胶乳颗粒以及fe3o4磁性纳米颗粒，降低了胶乳颗粒和fe3o4磁性纳米颗粒的自我聚集程度，展现了良好的空间性与分散性，与鼠抗人mpo单克隆抗体相结合，形成稳固的复合体，利用表面活性剂，将包被抗体的胶乳颗粒进行包裹，同时降低表面张力，加之分散剂的作用，增加体系流动性，均匀分散胶乳颗粒，从而在保证试剂准确度前提下，提高了试剂盒的灵敏度和线性范围，可以检测0-6000ng/ml的范围。
[0048]
2.本发明检测方法为免疫胶乳比浊法，通过在胶乳微球上共价偶联识别待测抗原特定氨基酸序列的抗体以及反应缓冲液中含有的识别待测抗原特定氨基酸序列的抗体，当有待测抗原存在的时候，微球之间便通过待测抗原产生交联，导致溶液浊度上升，待测抗原愈多，吸光度变化愈多，进而通过测定样品吸光度的变化，以及根据标准曲线能计算出样本中待测抗原的含量，本发明方法具有特异性强，灵敏度高，检测速度快等优势，可以配套全自动生化分析仪使用。
具体实施方式
[0049]
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
[0050]
实施例1
[0051]
一种髓过氧化物酶检测试剂盒，包括试剂r1，试剂r2，校准品和质控品，其中：
[0052]
试剂r1的成分和含量如下：
[0053]
mes缓冲液
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100mmol/l
[0054]
壬基酚聚氧乙烯醚
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15ml/l
[0055]
mit
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0.5g/l；
[0056]
试剂r2的成分和含量如下：
[0057][0058]
校准品的成分和含量如下：
[0059][0060]
质控品的成分和含量如下：
[0061][0062]
包被抗体的胶乳颗粒的制备方法如下：
[0063]
步骤一：选取羧基修饰聚苯乙烯与聚丙烯酸胶乳颗粒，直径为100～300um；
[0064]
步骤二：使用活化的mes buffer悬浮共聚胶乳微球，制备浓度为0.5～2％w/v的微球悬浮液；
[0065]
步骤三：向微球悬浮液加入0.1％(质量)的fe3o4磁性纳米颗粒、0.01％(质量)的氧化石墨烯颗粒、edc，超声分散，室温孵育15min后，再次加入edc，继续室温孵育15min，得到孵育后的乳胶微球；
[0066]
步骤四：对步骤三得到的乳胶微球进行静置30min，取上清液，去除未结合的fe3o4磁性纳米颗粒和氧化石墨烯，并使用等体积的mes缓冲液进行清洗，得到悬浮在缓冲液中的微球悬浮液a；
[0067]
步骤五：使用缓冲液对鼠抗人mpo单克隆抗体进行溶解至浓度为0.1mg/ml，将溶解后的鼠抗人mpo单克隆抗体加入搅拌中的步骤四中得到的微球悬浮液a，持续搅拌，室温孵育4h；
[0068]
步骤六：向步骤五得到的溶液中加入乙醇胺，持续搅拌并室温孵育10min；
[0069]
步骤七：对步骤六得到的溶液使用磁铁进行吸附，去除上清，进行离心去上清，彻底移除未结合的鼠抗人mpo单克隆抗体和乙醇胺，之后使用pbs缓冲液进行悬浮，得到鼠抗人mpo单克隆抗体包被的胶乳颗粒，即包被抗体的胶乳颗粒。
[0070]
检测方法：校准品按比例稀释后在全自动生化分析仪(hitachi-7180)上对试剂进行校准，检测质控品样本、线性物质样本，记录检测结果。
[0071]
实施例2
[0072]
一种髓过氧化物酶检测试剂盒，包括试剂r1，试剂r2，校准品和质控品，其中：
[0073]
试剂r1的成分和含量如下：
[0074]
mes缓冲液
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10mmol/l
[0075]
壬基酚聚氧乙烯醚
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10ml/l
[0076]
mit
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0.2g/l；
[0077]
试剂r2的成分和含量如下：
[0078][0079][0080]
校准品的成分和含量如下：
[0081][0082]
质控品的成分和含量如下：
[0083][0084]
包被抗体的胶乳颗粒的制备方法同实施例1。
[0085]
检测方法同实施例1的检测方法。
[0086]
实施例3：
[0087]
一种髓过氧化物酶检测试剂盒，包括试剂r1，试剂r2，校准品和质控品，其中：
[0088]
试剂r1的成分和含量如下：
[0089]
mes缓冲液
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
200mmol/l
[0090]
壬基酚聚氧乙烯醚
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20ml/l
[0091]
mit
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1g/l；
[0092]
试剂r2的成分和含量如下：
[0093][0094]
所述校准品的成分和含量如下：
[0095][0096]
所述质控品的成分和含量如下：
[0097][0098]
包被抗体的胶乳颗粒的制备方法同实施例1。
[0099]
检测方法同实施例1的检测方法。
[0100]
实施例4
[0101]
一种髓过氧化物酶检测试剂盒，其组分及含量同实施例1，区别在于，在制备包被抗体的胶乳颗粒步骤中，未添加fe3o4磁性纳米颗粒和氧化石墨烯。
[0102]
检测方法同实施例1的检测方法。
[0103]
对比例
[0104]
采用市场上常见的国家食品药品监督管理局认可的某公司的髓过氧化物酶测定试剂盒(胶乳免疫比浊法)，根据本发明对各项试剂的分类：
[0105]
对比例试剂r1的成分和含量如下：
[0106]
tris缓冲液 100mmol/l
[0107]
对比例试剂r2的成分和含量如下：
[0108]
包被抗体的胶乳颗粒 0.1％
[0109]
对比例校准品的成分和含量如下：
[0110]
人血清基质 70％
[0111]
髓过氧化物酶 水平1：50～100ng/ml或
[0112]
水平2：130～150ng/ml或
[0113]
水平3：250～340ng/ml或
[0114]
水平4：500～680ng/ml或
[0115]
水平5：1100～1300ng/ml。
[0116]
准确度试验
[0117]
采用实施例1、实施例2、实施例3、实施例4和对比例的试剂分别进行定标，分别检测质控品水平1(靶值为500ng/ml，范围为450-550ng/ml)，质控品水平2(靶值为5000ng/ml，范围为4500-5500ng/ml)，并计算其相对偏差，检测结果如表1、表2所示：
[0118]
表1试剂盒质控品水平1检测结果
[0119]
次数实施例1实施例2实施例3实施例4对比例150549152247549225024955184794903503493520481485平均值503493520478489相对偏差0.60％-1.40％4.00％-4.40％-2.20％
[0120]
表2试剂盒质控品水平2检测结果
[0121]
次数实施例1实施例2实施例3实施例4对比例149864836511215262233249904896518015502014349854852511215892156平均值498748615204782134相对偏差0.26％-2.78％2.68％-68.90％-57.32％
[0122]
相对偏差(％)＝(测定均值－质控品靶值)/质控品靶值
×
100％。
[0123]
由表1可以看出，在低水平质控检测上，上述实施例1、2、3、4所得试剂与质控品的相对偏差均小于5％，实施例1试剂整体最佳，与对比例试剂具有同等效果。表明了本发明的髓过氧化物酶检测试剂盒具有较高的准确度。
[0124]
由表2可以看出，在高水平质控检测上，上述实施例1、2、3所得试剂与质控品的相对偏差均小于5％，实施例1试剂整体最佳，而实施例4与对比例试剂相对偏差均超过了50％。表明了本发明的髓过氧化物酶检测试剂盒对于高值样本也具有较高的准确度。
[0125]
线性范围检测
[0126]
将线性高值样本(浓度6000ng/ml)用线性低值样本(浓度0ng/ml)进行线性稀释，混合成6个稀释浓度(xi)，如下表3。用试剂盒分别测试以上样本，每个稀释浓度测试3次，分别求出每个稀释浓度检测结果的均值(yi)。
[0127]
表3线性稀释
[0128]
低值样品00.20.40.60.81高值样品10.80.60.40.20理论浓度x0.8x 0.2y0.6x 0.4y0.4x 0.6y0.2x 0.8yy
[0129]
注：x―表示高值样品的浓度，y―表示低值样品的浓度
[0130][0131]
以稀释浓度(xi)为自变量，以检测结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。计算线性回归的相关系数(r)
[0132]
实施例1、实施例2、实施例3、实施例4与对比例的试剂分别使用hitachi-7180生化分析仪检测各个稀释浓度，检测结果如表4-表8所示：
[0133]
表4实施例1线性范围试验结果
[0134][0135]
表5实施例2线性范围试验结果
[0136][0137]
表6实施例3线性范围试验结果
[0138][0139]
表7实施例4线性范围试验结果
[0140][0141]
表8对比例线性范围试验结果
[0142]
[0143]
由表4至表8可以看出，上述实施例1、2和3所得试剂其线性相关系数分别为0.9999、0.9997、0.9993，均大于0.99，且可达线性高值，而实施例4所得试剂其线性相关系数为0.9439，对比例所得试剂其线性相关系数为0.9317，两组试剂的线性高值明显达不到，说明了本发明实施例1、2和3的灵敏度更高，线性范围可以达到0-6000ng/ml的范围。
[0144]
综上所述，本发明的髓过氧化物酶检测试剂盒具有较高的灵敏度、更宽的线性范围。
[0145]
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。