一种膜Ⅰ型基质金属蛋白酶活性检测方法

一种膜ⅰ型基质金属蛋白酶活性检测方法
技术领域
1.本发明涉及纳米材料制备及生物分子检测领域，尤其涉及一种膜ⅰ型基质金属蛋白酶活性检测方法。


背景技术：

2.膜i型基质金属蛋白酶(membrane type-1matrix metalloproteinase，mt1-mmp)是降解细胞外基质成分的最主要的蛋白酶之一。作为一种肽链内切酶，mt1-mmp降解细胞间基质和基底膜，同时重塑细胞间黏附力，促进肿瘤细胞沿基质空隙和基底膜缺损向周围生长。因此，膜i型基质降解酶活性的准确检测具有极其重要的意义。
3.目前，基质降解酶的常规检测方法包括免疫印迹实验、酶联免疫吸附测定和免疫组织化学法等。这些方法通常以蛋白酶为分子靶标，利用荧光或同位素标记的单克隆抗体为分子探针，通过抗体-抗原的特异性结合实现对基质降解酶浓度的定量检测。尽管如此，这些方法在实际使用中也会受到一些抗体性质的限制，比如制备步骤繁琐、成本较高、存在批次差异性等，影响了检测的准确性。另外，基于抗体-抗原的免疫学方法仅能检测出目标蛋白酶的浓度，难以对其水解活性进行有效测定。
4.作为一类新型的蛋白质识别分子探针，多肽有望弥补抗体的上述不足。多肽是多个氨基酸由肽键连接形成的氨基酸序列，并且特定的多肽序列能够被对应的基质降解酶特异性切割。利用这种多肽的结构变化可以构建开关型生物传感探针，从而检测目标蛋白酶的活性。荧光法是一种常用的光学标记方法，被广泛应用于多种生物分子的检测当中。但是，荧光光谱的稳定性较差，容易发生光漂白的现象。同时，待测细胞成分复杂，很多成分自身也有荧光特性，因此检测结果易受干扰。表面增强拉曼散射光谱(surface enhanced raman scattering，sers)技术是一种新兴的生物标记手段，具有极高的灵敏度，在生物检测、传感和成像等领域展现出了独特的优势。同时，sers光谱具有很高的光稳定性，不易被光漂白，使人们可以在复杂的生物环境中跟踪目标物。因此，将拉曼与荧光技术相结合，构建双模式探针，发展膜ⅰ型基质金属蛋白酶活性检测新方法，实现高灵敏和高可靠性检测，是目前迫切需要解决的问题。


技术实现要素：

5.发明目的：针对现有技术的不足与缺陷，本发明提供一种膜ⅰ型基质金属蛋白酶活性检测方法，采用拉曼-荧光开关型检测方法能够有效降低背景信号的干扰，具有灵敏度高、特异性好和可靠性强等优点。
6.技术方案：本发明的一种膜ⅰ型基质金属蛋白酶活性检测方法，其特征在于：包括下述步骤：
7.1)制备金属纳米颗粒作为表面增强拉曼散射衬底；
8.2)在颗粒表面修饰功能性多肽序列，得到拉曼-荧光双模式探针；
9.3)将探针加入到待测细胞中，与膜ⅰ型基质金属蛋白酶发生反应；
10.4)利用共焦拉曼显微镜分析待测细胞上的拉曼与荧光信号，进行光谱与图像的采集，根据拉曼与荧光信号强度的变化，实现对膜ⅰ型基质金属蛋白酶活性的半定量检测。
11.其中，所述的步骤1)中金属纳米颗粒为金纳米球或者银纳米球。
12.其中，所述的步骤2)中功能性多肽序列为cgplglgk，该多肽序列通过n端半胱氨酸的巯基共价地连接到金属纳米颗粒表面。
13.其中，所述的步骤2)中功能性多肽序列c端修饰荧光拉曼分子，荧光拉曼分子为罗丹明6g、罗丹明b、羧基荧光素、甲基荧光素或花氰素5中的一种。
14.其中，所述的步骤3)中探针的多肽序列会被膜ⅰ型基质金属蛋白酶特异性切割，释放荧光拉曼分子。
15.其中，所述的步骤4)中利用表面增强拉曼信号强度的减小δis和荧光信号强度的增加δif表征分析待测细胞中膜ⅰ型基质金属蛋白酶的活性，δis和δif越大表示待测细胞中膜ⅰ型基质金属蛋白酶的活性越高。
16.本发明方法首先利用多肽序列构建出拉曼-荧光双模式的探针粒子，然后将探针加入到细胞样品中，通过膜ⅰ型基质金属蛋白酶对多肽序列的特异性切割作用产生拉曼信号和荧光信号之间的切换，实现细胞内膜ⅰ型基质金属蛋白酶活性的可视化，最后采集细胞内的拉曼光谱和荧光光谱，建立起信号强度与膜ⅰ型基质金属蛋白酶活性之间的对应关系，达到半定量分析的目的。
17.利用膜ⅰ型基质金属蛋白酶和对应多肽序列的特异性切割作用，不同活性的膜ⅰ型基质金属蛋白酶会对荧光拉曼分子在金属纳米颗粒表面的脱附产生不同程度的影响，从而产生不同强度的表面增强拉曼散射信号和荧光信号，结合信号强度的变化，建立起δis(δif)和膜ⅰ型基质金属蛋白酶活性之间的对应关系，从而实现对细胞内膜ⅰ型基质金属蛋白酶活性的半定量检测和分析。
18.有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：
19.1、本发明使用酶切型多肽底物作为膜ⅰ型基质金属蛋白酶的识别分子，有利于检测膜ⅰ型基质金属蛋白酶的水解活性。
20.2、本发明使用拉曼-荧光双模式探针，可特异性地在待测细胞中进行信号的切换，具有双模式成像性能，降低背景信号的干扰，并提高信号的稳定性。
21.3、本发明利用信号强度的变化实现对待测细胞内膜ⅰ型基质金属蛋白酶活性的半定量分析，具有灵敏度高、可靠性好和特异性高的优点。
附图说明
22.图1为本发明的检测方法示意图；
23.图2为本发明的拉曼-荧光双模式探针的结构示意图；
24.图3为本发明的检测方法原理图。
具体实施方式
25.下面结合附图及具体实施方式对本发明的技术方案做进一步的描述。
26.实施例1：本实施例以银纳米球为sers增强基底，以罗丹明6g为荧光拉曼分子，以乳腺癌细胞(mda-mb-231)为待测细胞，利用本发明的方法进行膜ⅰ型基质金属蛋白酶活性
检测。
27.1、制备银纳米球胶体：在450ml去离子水中加入50ml硝酸银溶液(物质的量浓度10mm)，剧烈搅拌并加热至沸腾。随后加入10ml柠檬酸钠溶液(质量分数1％)，继续加热搅拌60分钟。停止加热，搅拌冷却至室温，得到银纳米球胶体溶液。
28.2、制备探针：在5ml银纳米球胶体溶液中加入5μl溶解在dmso中的多肽序列(10mm，cgplglgk-r6g)，该混合溶液室温下搅拌12小时后，用6000rpm，12min离心清洗2次，沉淀分散至5ml去离子水中，得到拉曼-荧光双模式探针，如图2所示。
29.3、细胞样品准备：将mda-mb-231细胞接种于35mm玻底培养皿，培养24小时。用pbs缓冲液轻轻冲洗两次。
30.4、探针识别膜ⅰ型基质金属蛋白酶：取200μl双模式探针和1.8ml的pbs缓冲液混合均匀，加入到玻底培养皿中，使其均匀覆盖玻底。将培养皿置于37℃孵育2小时，用pbs缓冲液轻轻冲洗两次，去除多余的探针粒子。
31.5、膜ⅰ型基质金属蛋白酶活性检测：使用共焦拉曼显微镜采集细胞内探针的sers图像和荧光图像，可视化乳腺癌细胞中的膜ⅰ型基质金属蛋白酶活性。采取细胞内的sers光谱和荧光光谱，分析sers信号和荧光信号的强度，利用sers信号强度的减小δis和荧光信号强度的增加δif，实现膜ⅰ型基质金属蛋白酶活性的半定量检测。
32.效果分析：本发明提出的检测方法能够通过拉曼和荧光双模式信号进行膜ⅰ型基质金属蛋白酶活性的定性和半定量检测；同时能够可视化待测细胞内的膜ⅰ型基质金属蛋白酶活性，从而达到辅助检测的目的。相比现有技术，具有抗干扰能力强，可靠性高和可重复性高等独特优点。
33.实施例2：本实施例以金纳米球为sers增强基底，以羧基荧光素fam为荧光拉曼分子，以人纤维肉瘤细胞(ht-1080)为待测细胞，利用本发明的方法进行膜ⅰ型基质金属蛋白酶活性检测。
34.1、制备金纳米球胶体：在100ml去离子水中加入100μl氯金酸溶液(质量分数10％)，剧烈搅拌并加热至沸腾。随后加入4ml柠檬酸钠溶液(质量分数1％)，继续加热搅拌20分钟。停止加热，搅拌冷却至室温，得到金纳米球胶体溶液。
35.2、制备探针：在5ml金纳米球胶体溶液中加入5μl溶解在dmso中的多肽序列(10mm，cgplglgk-fam)，该混合溶液室温下搅拌12小时后，用6000rpm，12min离心清洗2次，沉淀分散至5ml去离子水中，得到拉曼-荧光双模式探针。
36.3、细胞样品准备：将ht-1080细胞接种于35mm玻底培养皿，培养24小时。用pbs缓冲液轻轻冲洗两次。
37.4、探针识别膜ⅰ型基质金属蛋白酶：取200μl双模式探针和1.8ml的pbs缓冲液混合均匀，加入到玻底培养皿中，使其均匀覆盖玻底。将培养皿置于37℃孵育2小时，用pbs缓冲液轻轻冲洗两次，去除多余的探针粒子。
38.5、膜ⅰ型基质金属蛋白酶活性检测：使用共焦拉曼显微镜采集细胞内探针的sers图像和荧光图像，可视化乳腺癌细胞中的膜ⅰ型基质金属蛋白酶活性。采取细胞内的sers光谱和荧光光谱，分析sers信号和荧光信号的强度，利用sers信号强度的减小δis和荧光信号强度的增加δif，实现膜ⅰ型基质金属蛋白酶活性的半定量检测。
39.效果分析：本发明提出的检测方法能够通过拉曼和荧光双模式信号进行膜ⅰ型基
质金属蛋白酶活性的定性和半定量检测；同时能够可视化待测细胞内的膜ⅰ型基质金属蛋白酶活性，从而达到辅助检测的目的。相比现有技术，具有抗干扰能力强，可靠性高和可重复性高等独特优点。