一种与湖羊体尺相关的分子标记及其应用的制作方法

1.本发明属于分子标记制备及应用技术领域，具体涉及map3k5基因片段作为影响湖羊体尺的分子标记及其应用。


背景技术：

2.有丝分裂原活化蛋白3激酶5(map3k5)又名凋亡信号调节激酶1(ask1)，是动物mapk超家族丝氨酸/苏氨酸蛋白成员，该家族的基因一旦被激活，可以通过调节细胞凋亡激酶瀑布流，最终调控细胞凋亡、机体免疫和胃排空等生物及生理过程(palit,s.,kar,s.,sharma,g.,&das,p.k.,2015)。map3k5基因作用广泛，在机体的氧化应激，调节细胞的生长、增殖、分化和死亡，机体的免疫应答等方面起重要作用(prickett，t.d.，zerlanko，b.j.，margulies，e.h.，&samuels，y.2014)。map3k5基因的表达下调可使血红蛋白f含量下降，该基因不仅是生长及采食特征相关的候选基因，同时也与胚胎发育、肌肉发生、脂肪形成以及细胞免疫等密切关联(matsuzawa et al.，2005)。
3.羊全身是宝，在医疗保健方面，羊更能发挥其独特的作用，具有较高的药用价值。湖羊是肉、奶制品和羊毛的重要来源，在全球农业经济中起着至关重要的作用。体型是湖羊产业的关键特征(tao l，xy he，pan l x，et al.genome-wide association study of body weight and conformation traits in neonatal sheep[j].animal genetics，2020.)。湖羊是著名的多产品种，四季发情，生长快，性成熟早，产羔数高，平均产羔数2.06。湖羊主要分布在长江一带。在湖羊的生产实践中，选择具有良好体尺性状，能有利于经济效益的提高。
[0004]
本发明通过对map3k5基因进行测序和分析，探讨其不同基因型与湖羊体尺之间的关联，旨在为提高湖羊体尺的遗传改良方面提供基因素材，提高快速生长型优质肉羊新品种的培育进程。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于提供一种与湖羊体尺相关的分子标记及其应用。本发明的分子标记从湖羊map3k5基因中扩增得到，其具体核苷酸序列如seq id no.1所示。通过扩增湖羊map3k5基因的dna序列并测序，寻找map3k5基因的多态性位点，从而可以建立湖羊体尺相关分子标记的检测方法，并可将该分子标记的多态性应用于快速生长型优质肉羊新品种的培育中。
[0006]
具体地，本发明的技术方案如下所述：
[0007]
本发明提供了一种与湖羊体尺相关的分子标记，该分子标记通过对湖羊map3k5基因进行扩增而获得，具体地，该分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示，其中该序列第181位的r表示a或g，该突变导致了湖羊map3k5基因在该位点的a/g多态性。本发明还提供了一种用于检测上述分子标记的引物对，任何可特异性扩增上述分子标记或包含上述多态性位点的片段的引物均适用于对该分子标记进行检测，优选地，检测分子标记的引物对的核
苷酸序列如seq id no.2和seq id no.3所示。
[0008]
此外，本发明还提供用于检测上述分子标记的kaspar引物对，优选地，其包括用于检测allelec的正向引物a1，用于检测allelet的正向引物a2和通用反向引物c，其中，所述a1的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述a2的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述c的核苷酸序列如seq id no.6所示。
[0009]
本发明还提供了一种用于检测上述分子标记的试剂盒，所述试剂盒中包含了上述用于检测该分子标记的引物对或/和kaspar引物对。
[0010]
发明还提供了一种检测与湖羊体尺相关的分子标记的方法，分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示，其方法包括利用上述的引物对或试剂盒对上述分子标记进行检测，本发明的具体检测方法包括如下步骤：
[0011]
a)使用上述的引物对、kaspar引物对或包含上述引物对的试剂盒，对湖羊的基因组dna进行扩增；
[0012]
b)对步骤a)获得的扩增产物的多态性位点进行鉴定。
[0013]
优选地，在步骤b)中，进行鉴定分型的方法包括但不限于直接测序法、探针法、基因芯片法、高分辨率溶解曲线法。
[0014]
本发明中利用上述引物对检测与湖羊体尺相关分子标记的方法，包括如下步骤：
[0015]
a)以湖羊血液为样品提取基因组dna，利用seq id no.2和seq id no.3所示的引物对提取的基因组dna进行pcr扩增；
[0016]
b)对上述pcr扩增的产物进行测序和序列分析，从而通过多态性位点的碱基类型确定基因型。
[0017]
此外，本发明还提供了利用kaspar引物对检测与湖羊体尺相关分子标记的方法，其包括如下步骤：
[0018]
a)以湖羊血液为样品提取基因组dna，利用如seq id no.4-6所示的引物对进行高通量水浴pcr扩增；
[0019]
b)扩增结束后，利用bmg pherastar仪器检测荧光信号并查看分型结果。
[0020]
本发明还提供了上述分子标记及其多态性位点、如上所述的引物对或试剂盒的检测方法在湖羊体尺检测中的应用，通过在待测湖羊中检测本发明提供的分子标记，并分析多态性位点的类型，从而可以确定湖羊体尺的高低，进而筛选出快速生长型的湖羊。
[0021]
最后，本发明提供了上述分子标记及其多态性位点、引物对或试剂盒的检测方法在湖羊育种中的应用，通过利用本发明的引物对或试剂盒对map3k5基因进行扩增和检测，确定待测样品的基因型，从而可以从中选育出快速生长型湖羊品种。
[0022]
本发明通过设计kaspar引物对分子标记进行检测，其中kasp是竞争性等位基因特异性pcr(kompetitive allele specific pcr)的缩写，其不需要针对每个snp位点都去合成特异的荧光探针，是基于独特的arm pcr原理，让所有的位点检测最终都使用通用荧光引物扩增，大大降低了试剂的成本，同时具有taqman探针标准的准确性，为本发明的分子标记的检测提供了一种简便、准确、低成本的操作方法。
[0023]
本发明的有益效果在于：
[0024]
本发明提供的与湖羊体尺相关的分子标记及导致其多态性的位点，实通过对湖羊map3k5基因进行扩增而获得，通过测定该多态性的基因型来有效鉴别是否为快速生长型湖
羊，为利于快速生长型湖羊的选育提供有效的检测手段。本发明通过对分子标记及导致多态性位点的检测，可用于选留aa纯合的湖羊作为种羊，以提高湖羊的体重和体长，有助于提供湖羊生产的经济效益。
附图说明
[0025]
图1为本发明中用于作为分子标记的湖羊map3k5基因片段的凝胶电泳图；其中，m泳道：dl 2000marker，1-10泳道：map3k5基因扩增结果。
[0026]
图2为本发明中湖羊map3k5基因突变位点的测序结果。
[0027]
图3为本发明中湖羊map3k5基因g.181a》g突变位点kaspar snp分型结果；其中，靠近左侧的红色点表示gg基因型，靠近中间的绿色点表示ga基因型，靠近右侧的蓝点表示aa基因型。
具体实施方式
[0028]
寻找基因的变异位点，通过与性状间的关联分析发现基因与性状间的关系是研究基因功能的一个重要手段，也是进行标记辅助选择的基础。本发明人进行了大量的实验研究和测序，发现在湖羊map3k5基因的扩增片段上存在一个a/g多态性位点，并通过检测1355只湖羊的多态性和建立的最小二乘模型，确定了一种与湖羊体尺相关的分子标记，该分子标记可以用于快速生长型湖羊的选育，为湖羊体尺的遗传改良提供了有效的基因工程手段，具有重大的实际应用价值。
[0029]
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
[0030]
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，除另有规定，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格。
[0031]
实施例1map3k5基因的扩增
[0032]
(1)引物设计
[0033]
以湖羊map3k5基因dna(genbank收录号：nc_040259)为模板，利用oligo7.0软件设计一对引物正向引物m-f和反向引物m-r，引物序列如下：
[0034]
m-f(seq id no.2)：5＇-gacagacagccatctacact-3＇，
[0035]
m-r(seq id no.3)：5＇-acacaatgaaaatcgtgcag-3＇
[0036]
(2)map3k5基因的扩增和测序
[0037]
pcr反应总体积35μl，其中dna模板1.5μl，2
×
pcr master mix 17.5μl，m-f引物1μl，m-r引物1μl，ddh2o 14μl。pcr扩增程序是：94℃预变性3min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次，最后72℃延伸10min。pcr反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。结果显示得到373bp特异扩增片段。将扩增得到的pcr片段进行测序，测序的结果显示该扩增片段的具体核苷酸序列如seq id no.1所示，其中该序列中第181位的r表示a或g，由于上述序列在第181位碱基处有一个a/g突变，从而导致了湖羊map3k5基因在该位点的a/g多态性。即扩增的map3k5基因片段在第181bp位点存在a/g多态性(图2)。
[0038]
seq id no.1：gacagacagccatctacactgggggattttgatgaagatgatcaagggcaggaatgagccactggaactctagcttctggtgtgagattacagctaggtcgccttctccccagcttcctctaagatctctagt
cagactcctgttgggaaaaatagcgtcttttcttaaagacccaggtcraccagaaattagtggagttaaaccaaattttgaataaacctctcttagccttatgataaaagtcatttataaaaaggtaatggcttacccatacaatggaatattatcaacctgaaaaaggaacgaagttctgatacattacactaagtgaaatgagccagacacaaaaagactgcacgattttcattgtgt
[0039]
dna序列同源性检索鉴定：
[0040]
通过美国国家生物技术信息中心(ncbi，national center for biotechnology information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的blast(basic local alignment search tool)软件，将测序后获得的dna序列与genbank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该dna序列的功能信息。检索结果表明所测序列与湖羊map3k5基因dna(genbank收录号：nc_040259)的部分序列同源性达99％。
[0041]
实施例2基因分型检测方法的建立
[0042]
(一)引物序列设计
[0043]
针对实施例1中扩增片段(seq id no.4)的a/g多态性位点设计kaspar引物对，从而用于所述多态性位点的特异性检测，设计的kaspar引物对的核苷酸序列如下：
[0044]
用于检测allelec的正向引物a1即seq id no.4：gaaggtgaccaagttcatgctcgtcttttcttaaagacccaggtca；
[0045]
用于检测allelet的正向引物a2即seq id no.5：gaaggtcggagtcaacggattgtcttttcttaaagacccaggtcg；
[0046]
通用反向引物c即seq id no.6：gaggtttattcaaaatttggtttaactccac。
[0047]
以上引物委托北京生工生物工程有限公司进行合成。
[0048]
(二)dna质控
[0049]
通过1％琼脂糖电泳和nanodrop2100分别对提取得到的湖羊基因组dna(血液样品中提取)的质量进行检测，合格的dna要求：琼脂糖电泳显示dna条带单一，没有明显弥散；nanodrop2100检测a260/280介于1.8-2.0之间；a260/230介于1.8-2.0之间；270nm没有明显的光吸收。
[0050]
根据英国lgc公司的kasp检测技术和基因组大小换算出dna用量为10～20ng/每样品，所以将从湖羊血液样品中提取的基因组dna稀释dna浓度成为10～20ng/μl备用。
[0051]
(三)基因分型
[0052]
首先利用k-pette分液工作站将稀释好的待测dna模板(10～20ng/μl)1.5ul和空白对照(no template control，ntc，采用灭菌水作为空白对照)分别加入384孔反应板中，60℃烘干30min(干燥箱，lgc公司)，dna变成干粉备用。然后在kraken操作系统下利用meridian加样工作站分别向每个反应孔中加入1
×
master mix(1536微孔板货号part no.kbs-1016-011)与引物混合液，其中，引物混合液的配置为将上述kaspar引物对中各引物均稀释成10μmol/l，并按照引物a1：引物a2：引物c的体积比为12:12:30的比例混匀即获得引物混合液。
[0053]
mix分装后，立即将微孔板依次放在kube热封仪和fusion激光封膜仪上封膜，利用hydrocyler进行高通量水浴pcr扩增。pcr反应在高通量水浴系统hydrocycler中进行，具体程序为：
[0054]
94℃预变性，15分钟；
[0055]
94℃，20秒(变性)—61℃-55℃，1分钟(复性&延伸)，以touch down序扩增10个循环，每循环降低0.6℃；
[0056]
94℃，20秒(变性)—55℃，60秒继续扩增26个循环。
[0057]
扩增结束后，利用bmg pherastar仪器检测荧光信号并查看分型情况，具体结果如图3所示，图中每个圆点代表一份待测材料，其中靠近左侧的红色圆点表示该位点是纯合基因型“gg”；靠近右侧的蓝色圆点表示该位点是纯合基因型“aa”；靠近中间的绿色圆点表示该位点是杂合基因型“ga”或“ag”；粉色圆点表示ntc，即为空白对照。
[0058]
(四)本发明的分子标记在湖羊体尺标记关联分析中的应用
[0059]
试验共检测了1355只湖羊的多态性，确定其基因型，并建立如下所述的最小二乘模型，进行基因型与体尺进行关联分析。
[0060]yijk
＝μ genotypei pj sk ε
ijk
[0061]
其中，y
ijk
为体尺的观察值，μ为总体均数，genotypei为基因型效应，pj为批次效应，sk为季节效应，ε
ijk
为随机误差，假定ε
ijk
相互独立，服从n(0，σ2)分布。
[0062]
基因型检测结果表明在1355个个体中aa基因型有557个，ga基因型有629个个体，gg基因型有169个个体。基因型与性状关联分析的结果如表1所示，其中，各性状指标所指代意义及测量方法，体高(body hight)：髻甲最高点到地面的垂直距离(cm)；体长(body length)：肩端到臀部的直线距离(cm)；胸围(chest circumference)：沿肩甲软骨的后缘量取胸部的垂直周径(cm)；管围(cannon circumference)：左前肢管部最细处的周径(cm)。表中数据以spss 24.0软件利用上述线性模型关联分析获得，数据表示平均值
±
标准差。
[0063]
表1湖羊map3k5基因多态性与体尺关联分析
[0064][0065][0066]
注：同行数据间角标不同字母表示差异显著(p《0.05)，标相同字母或无字母表示差异不显著(p》0.05)。
[0067]
结果显示，随着测定周期的延长，map3k5 g.181a》g突变位点与湖羊体尺显著相关。携带aa基因型羊的体尺要优于携带gg基因型的羊(p《0.05)。由此可知a等位基因为优势等位基因。表明map3k5 g.181a》g突变位点可作为影响湖羊体尺的潜在分子标记(p《0.05)。可用于在育种中鉴别是否为快速生长型湖羊，提供了检测的技术手段。