青蒿素的新应用以及药物组合物

1.本发明涉及药物新应用技术领域，具体而言，涉及青蒿素的新应用以及药物组合物。


背景技术：

2.胺碘酮(amiodarone,am)是一种高效的用于治疗心律不齐的药物。然而它的使用也会引起一些器官如甲状腺、胃肠道、肝脏、眼、神经、皮肤和肺的不良反应，使得限制了胺碘酮的使用。其中，肺毒性是危害最大也是最致命的副作用。胺碘酮引起的肺毒性的发病机制可能包括直接细胞损伤、炎症介质释放和氧化应激等。研究及寻找能有效预防和治疗胺碘酮肺毒性作用的药物具有潜在且重要的价值。
3.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供青蒿素的新应用以及药物组合物。本发明提供了青蒿素的新的应用，其可以有效改善胺碘酮的副作用，特别是肺毒性，继而能够与胺碘酮合用降低其毒副作用。
5.本发明是这样实现的：
6.第一方面，本发明提供一种青蒿素在制备预防或治疗胺碘酮毒性的药物中的应用。
7.在可选的实施方式中，所述胺碘酮毒性为胺碘酮的各种副作用，优选地，副作用包括肺毒性。
8.在可选的实施方式中，所述胺碘酮毒性包括人支气管上皮细胞的氧化损伤和凋亡导致的副作用。
9.在可选的实施方式中，所述胺碘酮毒性包括以下现象中的至少一种导致的副作用：(1)ldh释放增加；(2)ros水平上升；(3)caspase3活性增加；(4)线粒体膜电位下降。
10.在可选的实施方式中，所述药物为以下药物中的至少一种：(1)减少ldh释放的药物；(2)降低ros水平的药物；(3)降低caspase3活性的药物；(4)提升线粒体膜电位的药物；(5)上调camkk2和nrf2的蛋白水平的药物；(6)提升ampk的磷酸化水平的药物；(7)激活camkk2/ampk/nrf2信号通路的药物。
11.第二方面，本发明提供一种药物组合物，其活性成分包括青蒿素和胺碘酮。
12.第三方面，本发明提供一种青蒿素在制备激活或提升或上调以下至少一种物质的改善剂中的应用；(1)线粒体膜电位；(2)camkk2的蛋白水平；(3)nrf2的蛋白水平；(4)ampk的磷酸化水平；(5)camkk2/ampk/nrf2信号通路。
13.第四方面，本发明提供一种青蒿素在制备抑制以下至少一种物质的抑制剂中的应用；(1)ldh释放；(2)ros水平；(3)caspase3活性。
14.本发明具有以下有益效果：本发明实施例提供了青蒿素的新的应用，其能够有效
改善胺碘酮导致的ldh释放增加、ros水平上升、caspase3活性增加、线粒体膜电位下降等导致的人支气管上皮细胞的氧化损伤和凋亡引起的肺部毒性，继而其能缓解或改善胺碘酮的副作用，可以作为预防或治疗胺碘酮肺毒性的药物，为临床上治疗胺碘酮肺副作用的药物研发奠定了理论基础。
附图说明
15.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
16.图1为本发明实验例1提供的检测结果图；
17.图2为本发明实验例2提供的检测结果图；
18.图3为本发明实验例3提供的检测结果图；
19.图4为本发明实验例4提供的检测结果图；
20.图5本发明实验例5提供的检测结果图；
21.图6为本发明实验例6提供的不同浓度青蒿素对akt，erk和ampk磷酸化水平的影响的结果图；
22.图7为本发明实验例6提供的不同浓度青蒿素对camkk2和lkb1的检测结果图；
23.图8为本发明实验例6提供的不同浓度青蒿素对nrf2的检测结果图；
24.图9为本发明实验例6提供的等浓度青蒿素不同处理时间对camkk2和lkb1的检测结果图；
25.图10为本发明实验例6提供的等浓度青蒿素不同处理时间对sod1和nrf2的检测结果图；
26.图11为本发明实验例6提供的等浓度青蒿素配合不同剂量的camkk2抑制剂sto-609对p-ampk的检测结果图；
27.图12为本发明实验例6提供的ampk抑制剂compound c对青蒿素的活性逆转的sod1和nrf2的检测结果图；
28.图13为本发明实验例7提供的结果图。
具体实施方式
29.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
30.本发明实施例提供一种青蒿素的新的应用，具体为，青蒿素可以有效改善胺碘酮导致的毒副作用，继而青蒿素可以作为预防或治疗胺碘酮毒性的药物进行应用。特别是针对胺碘酮导致的肺部副作用，而该肺部副作用是人支气管上皮细胞的氧化损伤和凋亡导致的副作用。或者是胺碘酮诱导的ldh释放增加、ros水平上升、caspase3活性增加、线粒体膜电位下降和细胞凋亡导致的副作用或肺部毒性。也说明青蒿素可以用于治疗人支气管上皮
细胞的氧化损伤和凋亡导致的疾病，或者可以用于治疗ldh释放增加、ros水平上升、caspase3活性增加、线粒体膜电位下降和细胞凋亡导致的疾病。
31.那么青蒿素则是通过减少ldh释放的药物；降低ros水平的药物；降低caspase3活性的药物以及提升线粒体膜电位的药物，继而改善胺碘酮导致的毒性，特别是肺部副作用。经过发明人研究发现，青蒿素是上调camkk2和nrf2的蛋白水平的药物；提升ampk的磷酸化水平的药物；以及激活camkk2/ampk/nrf2信号通路的药物继而能够改善胺碘酮导致的毒性，特别是肺部副作用。
32.也就是说青蒿素在制备激活或提升或上调以下至少一种物质的改善剂中的应用；(1)线粒体膜电位；(2)camkk2的蛋白水平；(3)nrf2的蛋白水平；(4)ampk的磷酸化水平；(5)camkk2/ampk/nrf2信号通路。或者用于制备抑制以下至少一种物质的抑制剂；(1)ldh释放；(2)ros水平；(3)caspase3活性。
33.那么，以青蒿素和胺碘酮作为活性成分可以制备药物组合物，该药物组合物的肺部毒性低，但是对心律不齐依然有良好的治疗效果。而该药物组合物可以是药物包或者是现有技术公知的药学上可接受的剂型，甚至患者可以根据所需用量直接同时服用所需用量的青蒿素制剂和胺碘酮制剂。
34.进一步地，青蒿素和所述胺碘酮的摩尔比为：25-100:3。采用上述比例能够进一步保证该药物组合物的效果。
35.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
36.实验例
37.药物及试剂：胺碘酮购自赛诺菲制药有限公司，青蒿素购自美伦生物技术有限公司。beas-2b细胞由广州医科大学友情提供。胎牛血清、dmem培养基和双抗购自美国gibco公司，乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,ldh)细胞毒性、活性氧(reactive oxygen species,ros)、caspase3活性、线粒体膜电位检测试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所，细胞凋亡检测试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
38.仪器：荧光酶标仪、荧光显微镜、细胞培养箱、生物安全柜均购自美国thermo fisher scientific公司，流式细胞仪购自美国bd公司。
39.细胞培养：人支气管上皮细胞(beas-2b细胞)使用含10％胎牛血清、1％双抗的dmem完全培养基并置于37℃、5％co2的恒温培养箱培养。
40.实验分组：空白对照组(记为control)：用普通培养基(即不含血清)培养；
41.青蒿素对照组(记为50μm art)：先用含50μm青蒿素的普通培养基预处理2h然后换成普通培养基培养；
42.胺碘酮组(记为3μmam)：用含3μm胺碘酮的普通培养基培养；
43.青蒿素预处理 胺碘酮组：分别先用含(25μm、50μm、100μm)青蒿素的普通培养基预处理2h，然后分别换成含3μm胺碘酮的普通培养基培养。对应的组别依次记为25μm art 3μm am；50μm art 3μm am；100μm art 3μm am；
44.抑制剂 青蒿素预处理 胺碘酮组(记为compound c art am)：先用含1μm ampk抑制剂compound c的普通培养基处理10min，然后换成含50μm青蒿素的普通培养基处理2h，再换成含3μm胺碘酮的普通培养基培养；
45.抑制剂对照组(记为compound c)：先用含1μmcompound c的普通培养基预处理
10min然后换成普通培养基培养。
46.实验例1细胞增殖活性和毒性检测
47.方法：(1)将beas-2b细胞以每孔5000个接种于96孔板中，按照上述实验分组处理细胞，每组6个重复，处理完培养24h后，每孔加入10μl 5mg/ml的mtt，培养3h后，弃去上清，每孔加入100μl dmso，用酶标仪在570nm处测定吸光度值。(2)按照相同的方式处理细胞后，取各孔上清液120μl于新的96孔板中，加入60μl ldh检测工作液，室温避光孵育30min，用酶标仪在490nm处测定吸光度值。
48.检测结果参见图1，其中，图1中a为细胞增殖活性的检测结果，图1中b为细胞毒性的检测结果。
49.根据图1中a可知，与空白对照组相比，胺碘酮组的细胞增殖活性显著下降，差异有统计学意义(###p《0.001)。与胺碘酮组比，青蒿素预处理 胺碘酮组的细胞增殖活性显著上升，差异均有统计学意义(*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001)，说明青蒿素能够提升胺碘酮导致的细胞增殖活性降低。
50.根据图1中b可知，与空白对照组相比，胺碘酮组的ldh释放显著上升，细胞毒性增加，差异有统计学意义。与胺碘酮组比，青蒿素预处理 胺碘酮组的ldh释放显著下降，细胞毒性减少，差异均有统计学意义，说明青蒿素可以降低胺碘酮导致的ldh释放增加，继而降低细胞毒性。
51.实验例2ros水平检测
52.方法：将beas-2b细胞以每孔10000个接种于96孔板中，按照上述实验分组处理细胞，每组6个重复，处理完培养24h后，吸去上清，加入50μl稀释好的dcfh-da(终浓度为10μm)，37℃细胞培养箱内孵育30min，然后用无血清培养基洗2次，再加入50μl无血清培养基，利用荧光酶标仪在488nm激发波长和525nm发射波长处检测荧光强度，并用荧光显微镜观察荧光及拍照。
53.检测结果参见图2，其中，图2中a为荧光显微镜拍照结果图；图2中b为荧光酶标仪检测结果图。
54.根据图2中a可知，胺碘酮组的绿色荧光明显增强，而青蒿素预处理 胺碘酮组比胺碘酮组的绿色荧光显著减弱。根据图2中b可知，胺碘酮组的荧光强度较空白对照组显著增加，差异具有统计学意义(###p《0.001)，而青蒿素预处理 胺碘酮组的荧光强度明显比胺碘酮组的荧光强度减弱，差异具有统计学意义(*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001)，说明青蒿素能够降低胺碘酮导致的ros水平上升。
55.实验例3线粒体膜电位检测
56.方法：将beas-2b细胞以每孔10000个接种于96孔板中，按照上述实验分组处理细胞，每组3个重复，处理完培养24h后，吸去上清，加入50μl jc-1染色工作液，37℃细胞培养箱内孵育30min，然后用jc-1染色缓冲液洗2次，加入50μl细胞培养液，利用荧光显微镜观察荧光并拍照；将beas-2b细胞以每孔约4.5
×
105个接种于6孔板中，第二天观察待细胞密度达到80％时，进行药物处理，处理完培养24h后，吸出上清，用0.25％胰酶将细胞消化下来，离心弃上清，用jc-1染色工作液重悬细胞，37℃细胞培养箱内孵育30min，然后离心用jc-1染色缓冲液洗2次，最后用200μl jc-1染色缓冲液重悬细胞，用流式细胞仪分析线粒体膜电位变化。
57.检测结果参见图3，其中，图3中a为荧光显微镜拍照结果图；图3中b为流式细胞仪分析结果图。
58.根据图3中a可知，胺碘酮组较空白对照组绿色荧光增加，红色荧光减少(指示线粒体膜电位下降)，而青蒿素预处理 胺碘酮组(50μm art 3μm am)能改善胺碘酮引起的绿色荧光增加，红色荧光减少，而青蒿素对照组即单纯青蒿素预处理对细胞线粒体膜电位无明显影响。
59.根据图3中b可知，胺碘酮组跟空白对照组比线粒体膜电位明显下降，而青蒿素预处理 胺碘酮组(50μm art 3μm am)能改善胺碘酮引起的线粒体膜电位下降，差异均有统计学意义(***p《0.001)。
60.综上说明，单纯的青蒿素对线粒体膜电位无影响，但是青蒿素能够提升胺碘酮导致的线粒体膜电位下降。
61.实验例4caspase3活性检测
62.方法：将beas-2b细胞以每孔约4.5
×
105个接种于6孔板中，第二天观察待细胞密度达到约80％时，按照上述实验分组处理细胞，处理完培养24h后，吸出上清，用0.25％胰酶将细胞消化下来，离心弃上清，用pbs洗涤一次，加入200μl裂解液重悬沉淀，冰浴裂解15min后4℃，12000r离心15min，将上清转移到预冷的离心管中，取适量加入反应液于37℃孵育，2h后在405nm处测定吸光度值。
63.检测结果参见图4，胺碘酮组较空白对照组的caspase3活性明显升高，青蒿素预处理 胺碘酮组(50μm art 3μm am)能抑制胺碘酮引起的caspase 3活性增加，差异均有统计学意义(**p《0.01)，而青蒿素对照组即单纯青蒿素预处理对细胞caspase3活性无明显影响。
64.综上说明，单纯的青蒿素对caspase3活性无明显影响，但是青蒿素能够抑制胺碘酮导致的caspase3活性增加。
65.实验例5细胞凋亡检测
66.方法：将beas-2b细胞以每孔约4
×
105个接种于6孔板中，第二天观察待细胞密度达到约70％时，按照上述实验分组处理细胞，处理完培养24h后，吸出上清，用0.25％胰酶将细胞消化下来，离心弃上清，用pbs洗3次，用195μl 1
×
binding buffer重悬细胞加入5μl annexin v-fitc混匀室温避光孵育10min，然后加入10μl propidium iodide，混匀后进行流式检测。
67.检测结果参见图5，其中，图5中a为各组正常细胞(左下)，早期凋亡和晚期凋亡细胞(右下和右上)及死亡细胞(左上)检测的流式结果图，图5中b为各组中凋亡细胞(早期和晚期)比例的差异统计图。胺碘酮组较空白对照组的凋亡细胞增多，而青蒿素预处理 胺碘酮组(50μm art 3μm am)较胺碘酮组凋亡细胞明显较少，差异均有统计学意义(**p《0.01,***p《0.001)，青蒿素对照组即单纯青蒿素预处理对细胞凋亡没有明显影响。综上说明，单纯的青蒿素对细胞凋亡无影响，而青蒿素可以减少或降低胺碘酮导致的细胞凋亡增多，即青蒿素可以抑制胺碘酮导致的细胞凋亡。
68.实验例6western blot检测蛋白表达
69.方法：(1)beas-2b以每孔1.7～2
×
105个接种于12孔板中，第二天观察待细胞密度达到80％～90％时，用不同浓度青蒿素(0、6.25、12.5、25、50和100μm)处理2h后，弃去培养
液，加入细胞裂解液收集细胞并置于冰上裂解约15min然后于100℃金属浴中加热10min，涡旋混匀并简短离心后存于-80℃备用。取等体积蛋白样品进行sds-page凝胶电泳(80v 20min,120v 90min)，然后用蛋白湿转法(90v 120min)电转至甲醇活化过的pvdf膜上，用3％bsa室温封闭1h，pbst洗3次后一抗(anti-p-akt，anti-p-erk，anti-p-ampk，anti-camkk2，anti-lkb1和anti-nrf2)4℃孵育过夜，pbst洗3次后用辣根过氧化物酶标记的二抗在室温孵育1h，pbst洗3次后用ecl显色液进行显色。
70.(2)采用方法(1)的方法进行检测，区别在于：50μm青蒿素处理不同时间(0、7、15、30、60和120min)进行检测，一抗为anti-camkk2，anti-lkb1，anti-sod1和anti-nrf2。
71.(3)采用方法(1)的方法进行检测，区别在于：用不同剂量的camkk2抑制剂sto-609(0、0.3、1、3和10μm)预处理12孔板中beas-2b细胞10min，然后用50μm青蒿素处理2h；而后进行测试；且一抗为anti-p-ampk。
72.(4)采用方法(1)的方法进行检测，区别在于：按照青蒿素对照组、胺碘酮组、抑制剂 青蒿素预处理 胺碘酮组以及抑制剂对照组进行细胞处理，一抗为anti-sod1和anti-nrf2。
73.检测结果参见图6-图8，其中，图6为不同浓度青蒿素对akt，erk和ampk磷酸化水平的影响的结果图，图7为不同浓度青蒿素对camkk2和lkb1的检测结果图；图8为不同浓度青蒿素对nrf2的检测结果图；图9为等浓度青蒿素不同处理时间对camkk2和lkb1的检测结果图；图10为等浓度青蒿素不同处理时间对sod1和nrf2的检测结果图；图11为等浓度青蒿素配合不同剂量的sto-609对p-ampk的检测结果图；图12为compound c对青蒿素的活性逆转的sod1和nrf2的检测结果图。
74.根据图6可知，随着青蒿素浓度的增加，ampk的磷酸化水平逐渐增加，而akt和erk的磷酸化水平未见明显增加。
75.根据图7和图9可知，随着青蒿素处理浓度和时间的增加，camkk2的蛋白水平逐渐增加，而lkb1蛋白水平未见明显变化。
76.根据图8和图10可知，随着青蒿素处理浓度和时间的增加，nrf2的蛋白水平逐渐增加，随着青蒿素处理时间的增加，sod1蛋白水平也逐渐增加。
77.根据图11可知，不同浓度的camkk2抑制剂sto-609(0、0.3、1、3和10μm)预处理10min，能阻断青蒿素对ampk的激活，说明青蒿素介导的ampk激活依赖于camkk2激酶而不是lkb1激酶。
78.根据图12可知，青蒿素预处理2h能抑制胺碘酮处理24h引起的nrf2蛋白表达下降，而compound c预处理10min能阻断青蒿素对nrf2蛋白表达的促进作用，同时compound c也能阻断青蒿素对sod1蛋白表达的促进作用。
79.综上说明，青蒿素能剂量及时间依赖地上调camkk2、nrf2的蛋白水平和激活ampk，说明青蒿素能激活camkk2/ampk/nrf2信号通路保护beas-2b细胞免受胺碘酮引起的氧化应激和凋亡。
80.实验例7阻断青蒿素对胺碘酮引起的副作用的研究
81.方法:参见实验例1和实验例2。
82.检测结果参见图13，其中，图13中a为compound c预处理阻断了青蒿素对胺碘酮引起的细胞活力下降的保护作用，图13中b为ampk的敲低阻断了青蒿素对胺碘酮引起的细胞
活力下降的保护作用，图13中c为compound c预处理阻断了青蒿素对胺碘酮引起的ros产生的抑制作用的荧光图，图13中d为compound c预处理阻断了青蒿素对胺碘酮引起的ros产生的抑制作用的荧光强度量化图。
83.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。