法尼醇在防治稻曲病中的用途

1.本发明涉及生物防治技术领域，具体涉及法尼醇在防治水稻稻曲病中的应用。


背景技术：

2.稻曲病菌(ustilaginoidea virens)侵染水稻穗部可引起水稻稻曲病。该病害的发生对水稻产量和品质都有严重的影响。稻曲病菌侵染水稻谷粒，可造成稻穗空秕率增加，千粒重下降，影响水稻产量；其侵染形成的稻曲球中含有多种稻曲毒素，能强烈抑制微管蛋白组装，干扰细胞骨架形成，引起人畜病变。目前稻曲病在世界各水稻产区均有发现，已经成为世界性水稻病害。在我国，近年来随着优质高产水稻的选育和推广、施肥量增加、气候变暖等因素的影响，稻曲病的发生呈现发生范围扩大的趋势，逐渐由水稻次生病害发展为主要病害。稻曲病的发生严重影响到粮食安全。
3.然而，稻曲病菌侵染水稻，其穗部形成稻曲球是唯一可见症状，在水稻的其他部位不能观察到任何症状，这给稻曲病菌的防治带来了很大的挑战。目前，防治水稻稻曲病采用的措施包括选育和推广抗病品种以及化学防治。现阶段由于水稻抗稻曲病品种的缺乏，使用麦角固醇生物合成抑制剂(ergosterol biosynthesisinhibitor，ebi)类杀菌剂进行化学防治成为防治稻曲病菌的重要措施。但随着多年化学药剂的广泛应用，田间已经分离到对该类杀菌剂产生抗药性的稻曲病菌株，这对稻曲病防治提出了新的挑战。
4.法尼醇(farnesol)分子式为c
15h26
o(3，7，11-三甲基-2，6，10-十二烷烯-1-醇)是一种倍半萜化合物，其同分异构体分为反-反式、反-顺式、顺-反式或顺-顺式。法尼醇存在于合欢金、巴西檀木、玫瑰香、茉莉等植物的香精中，也是真菌产生的一种小分子物质，天然存在于环境中也可以被土壤生物降解。法尼醇对多个真菌有明显的抑制作用。菌丝形成是白色念珠菌(candida albicans)的主要致病特征，法尼醇通过抑制 ras-camp蛋白激酶信号通路，cat1(过氧化氢酶基因)基因表达等途径，抑制白色念珠菌的菌丝形成，促进出芽酵母的产生，从而影响病原菌的致病力。此外，法尼醇还能抑制该病原菌的生物膜形成，并对细胞壁维持、铁转运和热休克蛋白以及抗药性等相关基因的表达有着明显的影响。对于病原菌球孢子菌 (coccidioides posadasii)，低浓度的法尼醇(0.00171-0.01369mg/l)可以通过抑制其细胞膜重要成分麦角固醇的合成，影响细胞膜渗透性，进而影响病原菌的生长。外源增加法尼醇可以促进构巢曲霉(aspergillusnidulans)线粒体产生ros，引发构巢曲霉发生形态学上的细胞凋亡，抑制病原菌生长，同时病原菌的麦角固醇和海藻糖代谢也会发生改变。法尼醇还能引发禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)的细胞凋亡，影响病原菌发育；还会抑制孢子萌发和活性。目前，在酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、杜氏假丝酵母(candida dubliniensis)、近平滑假丝酵母(candida parapsilosis)、曲霉菌(aspergillus species)以及巴西副球孢子菌(paracoccidioides brasiliensis)等真菌上也有相关的报道。但国内外尚未见法尼醇抑制稻曲病菌的报道，制约了法尼醇在稻曲病防治中的研究和应用。
5.法尼醇具有疏水性、挥发性，较弱的稳定性使该化合物难以用于制药，在一定程度
上限制其广泛应用。纳米载体系统已广泛应用于药物缓释领域，有助于改善药物的生物分布和疏水性化合物的溶解度，提高生物利用度和降低毒性。目前已有研究将法尼醇与高分子材料制成纳米微凝胶，其可在体外抑制白色念珠菌的生物膜形成和致病基因表达。因此法尼醇可作为潜在的新型稻曲病菌。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于发明法尼醇在防治稻曲病菌中的一个新途径。
7.本发明提供的技术方案是：法尼醇在对水稻稻曲病菌的分生孢子和厚垣孢子萌发、菌丝生长的抑制作用中的应用。
8.所述的法尼醇有着广泛的生产来源，可以从罗汉果等植物中提取、微生物中提取或者人工化学合成。将所述的法尼醇溶于甲醇后制成分散剂，然后分别处理在稻曲病菌上，观察其抑菌效果。
9.本发明中，法尼醇抑制稻曲病菌生长的最低有效浓度为55.78μm；法尼醇抑制稻曲病菌分生孢子萌发的最低有效浓度为100μm；法尼醇有效抑制稻曲病菌厚垣孢子萌发的最低浓度为100μm。
10.基于以后生产应用成本的控制，本发明提供所述法尼醇应用浓度为100μm，应用于防治稻曲病。
11.与现有技术相比，本发明具有如下有益的效果：
12.1.本试验首次将真菌产生的信号小分子法尼醇作为杀菌剂，探索其本身的最佳使用浓度，为开发防治稻曲病药剂提供理论依据，从而实现水稻后期病害的绿色可持续发展，为国民经济的发展贡献力量。
13.2.法尼醇作为真菌产生的一种信号小分子，它可以影响菌丝的形成、生物膜形成以及一些氧化应激反应，调控细胞形态，在真菌致病有着重要作用。本试验首次将法尼醇作为一种杀菌剂来防治稻曲病进行研究，与传统的杀菌剂相比，法尼醇作为杀菌剂具有绿色，安全，天然存在于环境中，也可以被土壤微生物降解等优点。其应用还处于起步阶段，研究具有新颖性。
14.总体来说，本发明将法尼醇开发成一种新型高效的杀菌剂在防治植物病害中具有光明前景。
附图说明
15.图1是法尼醇对稻曲病菌菌丝生长的抑制效果图。含不同法尼醇浓度(0μm、60μm、100μm、150μm、 200μm、300μm)的培养基对不同稻曲病菌(nj17、jt236)都有抑制效果。
16.图2是法尼醇对稻曲病菌分生孢子萌发的抑制效果图。分生孢子涂布于含不同法尼醇浓度(40μm、 100μm)的培养基上，分别于涂布后18h和40h观察，100μm法尼醇可以完全抑制分生孢子的萌发，40 μm法尼醇可以部分抑制分生孢子萌发，且孢子萌发时间延迟。
17.图3是法尼醇对稻曲病菌分生孢子萌发的抑制效果图。分生孢子涂布于含不同浓度的法尼醇(0μm、 20μm、40μm、60μm、80μm、100μm)的培养基上，避光培养7天后，法尼醇对分生孢子萌发和菌丝生长的抑制效果。
18.图4是法尼醇对稻曲病菌液体培养条件下菌丝量的抑制作用。终浓度为50μm的法
尼醇处理yts液体培养的菌丝，40h后测量发现，处理后的稻曲病菌的菌丝干重相比于对照显著下降。
具体实施方式
19.下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。
20.1.1供试材料
21.法尼醇从tci公司购买所得(cas number：4602-84-0)，并将所述法尼醇用甲醇稀释成浓度为39.8mm 的母液备用。
22.供试的2个稻曲病菌单孢菌株nj17、jt236，为分离自2018年在江苏省南京和金坛稻区采集的标样，经pcr检测和测序鉴定为稻曲病菌后，菌株保存在-80℃备用。菌株的生长和摇培温度为28℃，用于稻曲病菌液体培养的摇床转数为160rpm。供试的稻曲病菌厚垣孢子采自江苏南京稻区采集的稻曲球。
23.1.2供试培养基
24.yts液体培养基：酵母浸出物1g，胰蛋白胨1g，蔗糖10g，加去离子水定容至1l后常规灭菌。ytsa 培养基：每升加15g琼脂粉的yts液体培养基。psa培养基：马铃薯200g，切片后水煮30min，过滤取上清滤液，加20g蔗糖和15g琼脂粉，定容至1l后常规灭菌。
25.实施例一
26.本实施例提供法尼醇在固体培养条件下，抑制稻曲病菌菌丝生长的应用。
27.在预试验的基础上，先将法尼醇按比例加入ytsa培养基，配置成具有一定法尼醇浓度梯度(0μm、 50μm、100μm、150μm、200μm、300μm)的培养基备用。以不加法尼醇加入甲醇的ytsa培养基为对照，各浓度处理设置三个重复。从2个菌株新活化后生长14天的菌落边缘打取直径为7.5mm的菌丝块，分别接种到各个含法尼醇浓度梯度的ytsa培养基上(直径为6cm的培养皿)，28℃避光培养14天后测量菌落直径，计算抑制率，并观察菌落形态。
28.实验结果(参见表1，图1)显示法尼醇对平板上生长的稻曲病菌菌丝具有毒力作用，不同菌都表现出菌丝被抑制的效果，且抑制作用会随着浓度的升高而增加，但不同菌株对法尼醇的敏感性存在差异。当法尼醇浓度为50μm时，nj17、jt236均表现出抑制效果。当法尼醇浓度为200μm时，jt236菌株的菌丝生长被完全抑制；而nj17菌株在法尼醇浓度为300μm时，抑制率达为80.92
±
5.45％。
29.表1法尼醇对稻曲病菌菌丝生长的毒力水平
[0030][0031]
实施例二
[0032]
本实施例提供法尼醇在固体培养条件下，抑制稻曲病菌分生孢子萌发的应用。
[0033]
在预试验的基础上，先将法尼醇按比例加入ytsa培养基，配置成具有一定法尼醇浓度梯度(0μm、 20μm、40μm、60μm、80μm、100μm)的培养基备用。从nj17新活化菌株后生长14
天的菌落边缘挑取4个直径为7.5mm的菌碟接种到含100ml yts培养液的三角瓶中摇培6天后，过滤离心收集分生孢子，并用yts培养液重悬至浓度为5
×
105个孢子/ml。取40ul分生孢子液，均匀涂布到各处理的培养基上。以不加法尼醇加入甲醇的ytsa培养基为阴性对照，各浓度处理设置三个重复。将接种后的孢子液置于28℃避光培养。分别于12h、24h和48h，在显微镜下统计各处理的孢子萌发率。
[0034]
实验结果(参见表2，图2和图3)显示法尼醇对稻曲病菌的分生孢子具有毒力作用，在低浓度时可以延缓孢子萌发，而在高浓度则抑制其萌发，且抑制作用会随着浓度的升高而增加。在法尼醇浓度为20μm 时，分生孢子的萌发率显著延迟；达到40μm时分生孢子的萌发数量减少约50％；在100μm时分生孢子的萌发完全被抑制，杀菌效果很明显。
[0035]
表2法尼醇对稻曲病菌分生孢子固体培养基上的萌发率
[0036][0037]
实施例三
[0038]
本实施例提供法尼醇在液体摇培条件下，抑制稻曲病菌菌丝生长的应用。
[0039]
在预试验的基础上，先将法尼醇按比例加入yts培养基，配置成具有法尼醇浓度为40mm的母液备用。从nj17菌株新活化后生长14天的菌落边缘挑取4个直径为7.5mm的菌丝块接种到含100ml yts培养液的三角瓶中摇培4天后，将培养液中的稻曲病菌菌丝用研磨机打碎，取3ml菌液匀浆接入含法尼醇(终浓度为50μm)的yts培养液中。以不加法尼醇加入甲醇的yts培养液为阴性对照，各浓度处理设置三个重复。将处理后的菌液置于28℃，160rpm摇床中培养。40h后收集菌丝体，测量菌的生物量(菌丝干重)。
[0040]
实验结果(参见图4)显示在液体培养条件下，法尼醇对稻曲病菌的菌丝生长具有毒力作用。在含有法尼醇的培养液中，菌丝生长干重(0.43
±
0.04g/l)与对照(1.22
±
0.16g/l)存在显著差异。
[0041]
实施例四
[0042]
本实施例提供法尼醇抑制稻曲病菌厚垣孢子萌发的应用。
[0043]
在预备试验的基础上，先将法尼醇按比例加入无菌水中，配置成具有一定法尼醇浓度梯度(0μm、100 μm、200μm、300μm)的溶液备用。收集新鲜稻曲球5个，用无菌的手术刀刮去表面墨绿色的厚垣孢子层，再用新的无菌手术刀刮取稻曲球的黄色厚垣孢子。将从5个稻曲球上获得的厚垣孢子混匀，随机等量分装至无菌离心管中。每个离心管加入一定浓度的法尼醇溶液1ml。以不加法尼醇加入甲醇的水为对照，各浓度处理设三个重复。将厚垣孢子液置于28℃避光培养。两天后在显微镜下统计各处理的孢子萌发率。
[0044]
实验结果显示法尼醇对稻曲病菌的厚垣孢子具有毒力作用，可以抑制其萌发，且抑制作用会随着浓度的升高而增加。不加法尼醇处理的厚垣孢子萌发率为50.21
±
8.62
‰
，而100、200和300μm法尼醇分别处理，使得厚垣孢子萌发率下降到18.53
±
5.33
‰
、10.62
±
2.60
‰
和0.73
±
0.11
‰
，显著低于对照组。