PD-1抗体在制备治疗肌腱损伤的药物中的应用

pd-1抗体在制备治疗肌腱损伤的药物中的应用
技术领域
1.本发明属药物技术领域，具体涉及pd-1抗体在制备治疗肌腱损伤的药物中的应用。


背景技术：

2.肌腱是连接肌肉与骨骼的一种致密结缔组织，可将肌肉的收缩力传递至骨骼从而支持机体运动。在肌腱的过度使用或年龄退变的情况下，肌腱将产生不同程度的急慢性损伤，因此肌腱损伤在日常生活及运动领域十分常见。肌腱钙化是肌腱损伤后一种常见且严重的并发症，也可作为肌腱损伤后导致的慢性功能结构紊乱的一种表现形式。跟腱断裂手术后钙化的发生率高达14％～62％，可导致疼痛、肌腱无力、局部水肿以及活动受限等症状。
3.目前对于肌腱钙化的发病机制并不明确，导致尚无明确的药物用于预防和治疗肌腱钙化。肌腱钙化一旦形成之后，无法通过药物等保守治疗方式使其消除，只能通过一些保守治疗方式，例如局部注射非甾体抗炎药、糖皮质激素或局部冲击波治疗来缓解症状，症状严重的情况下只能通过手术清除钙化灶，但效果有限。其中，冲击波治疗对肌腱钙化疗效尚不确定，虽然部分研究肯定了其有效性，但也有研究表明无明显有益作用，并且冲击波治疗的机制尚不明确，在目前的状况下，作为一种物理治疗方式缓解症状为无奈之选，临床中期待新的更为安全有效的治疗方式出现。非甾体抗炎药及糖皮质激素虽然在肌腱钙化的治疗起到了一定程度的缓解症状及局部炎症的作用，然而其作为保守治疗方式时可能会对肌腱的自身愈合及自稳产生不利影响。有研究表明糖皮质激素可诱导肌腱细胞化生为纤维软骨样组织，且可诱导脊柱韧带来源细胞发生成骨分化，因此选择糖皮质激素进行保守治疗时应谨慎。在钙化形成之后，使用非甾体类抗炎药也仅可起到止痛效果。非甾体类抗炎药对肌腱的自身愈合及自稳是否存在不利影响尚存在争议。有研究表明非甾体类抗炎药在体外抑制肌腱细胞的增殖及迁移，还有动物实验发现非甾体类抗炎药会损伤肌腱生物力学强度。因此，研发一种预防和/或治疗肌腱损伤后肌腱钙化形成及改善肌腱生物力学强度的药物是当前亟待解决的科学问题。
4.细胞程序性死亡受体(programmed cell death 1，pd-1)抗体起初作为一种免疫检查点分子，在免疫反应期间下调多种免疫细胞活性，以防止自身免疫组织损伤，但也因此削弱了自身免疫系统对肿瘤细胞或病原体的杀伤功能。而pd-1抗体通过与其结合，可改善机体在肿瘤或多种慢性感染中的造成的免疫耐受，提高自身免疫活性。目前pd-1抗体作为免疫检查点抑制剂，被应用于非小细胞肺癌、黑色素瘤、头颈部肿瘤、乳腺癌、肝癌、及消化道肿瘤等疾病，且具有良好的临床效果，同时也开始逐渐进入hiv、病毒性肝炎、败血症等感染性疾病的临床治疗试验中。
5.现有文献报道的pd-1抗体的主要作用有：(1)治疗黑色素瘤、鳞状非小细胞肺癌、霍奇金淋巴瘤、肝细胞癌及尿路上皮癌等癌症疾病；(2)治疗病毒性肝炎；(3)治疗脓毒血症，提高患者生存率。至今为止，未有pd-1抗体具有预防肌腱损伤后肌腱钙化形成及改善肌
腱生物力学强度的相关报道，通过pd-1抗体已知的性质无法推断其是否具有预防肌腱损伤后肌腱钙化形成及改善肌腱生物力学强度的作用。


技术实现要素：

6.本发明第一方面的目的，在于提供pd-1抗体或其抗原结合片段衍生物在制备预防和/或治疗运动损伤的药物中的应用。
7.本发明第二方面的目的，在于提供pd-1抗体或其抗原结合片段衍生物在制备抑制损伤组织钙化形成的药物中的应用。
8.本发明第三方面的目的，在于提供pd-1抗体或其抗原结合片段衍生物在制备改善损伤组织的生物力学性能的药物中的应用。
9.本发明第四方面的目的，在于提供pd-1抗体或其抗原结合片段衍生物在制备抑制组织损伤后的异位骨化形成的药物中的应用。
10.为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
11.本发明的第一个方面，提供pd-1或其抗原结合片段衍生物在制备预防和/或治疗运动损伤的药物中的应用。
12.优选地，所述运动损伤包含急性损伤、慢性损伤中的至少一种；进一步为急性损伤。
13.优选地，所述运动损伤包含肌腱损伤、韧带损伤中的至少一种；进一步为肌腱损伤。
14.优选地，所述肌腱损伤包含肩袖损伤、肱二头肌长头肌肌腱损伤、肱三头肌肌腱损伤、股内收肌腱损伤、髂胫束损伤、股四头肌肌腱损伤、髌腱断裂、髌腱末端病、跟腱损伤中的至少一种；进一步为跟腱损伤。
15.优选地，所述韧带损伤包含肘关节周围韧带损伤、膝关节周围韧带损伤、交叉韧带损伤中的至少一种。
16.优选地，所述抗体或其抗原结合片段选自fab、fab'、f(ab')2、fd、fv、dab、互补决定区片段、单链抗体、人源化抗体、嵌合抗体或双抗体。
17.优选地，所述药物通过抑制损伤的组织钙化形成、改善损伤的组织的生物力学性能和/或减少损伤的组织的异位骨化形成达到治疗和/或预防运动损伤的目的。
18.优选地，所述药物还包含一种或多种药学上可接受的辅料。
19.优选地，所述药学上可接受的辅料包含缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂中的至少一种。
20.优选地，所述药物的剂型包含固体制剂、液体制剂和半固体制剂中的至少一种。
21.优选地，所述药物包含片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、液体制剂、煎膏剂、悬浮剂、分散剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂、贴剂中至少一种。
22.本发明第二方面，提供pd-1抗体或其抗原结合片段衍生物在制备抑制损伤组织钙化形成的药物中的应用。
23.优选地，所述组织包含肌腱、韧带中的至少一种；进一步为肌腱。
24.优选地，所述肌腱包含跟腱、肩袖、冈上肌中的至少一种；进一步为跟腱。
25.优选地，所述韧带包含肘关节周围韧带、膝关节周围韧带、交叉韧带中的至少一
种。
26.优选地，所述抗体或其抗原结合片段选自fab、fab'、f(ab')2、fd、fv、dab、互补决定区片段、单链抗体、人源化抗体、嵌合抗体或双抗体。
27.优选地，所述药物还包含一种或多种药学上可接受的辅料。
28.优选地，所述药学上可接受的辅料包含缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂中的至少一种。
29.优选地，所述药物的剂型包含固体制剂、液体制剂、半固体制剂中的至少一种。
30.优选地，所述药物包含片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、液体制剂、煎膏剂、悬浮剂、分散剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂、贴剂中的至少一种。
31.本发明第三方面，提供pd-1抗体或其抗原结合片段衍生物在制备改善损伤组织的生物力学性能的药物中的应。
32.优选地，所述改善损伤组织的生物力学性能为提高损伤组织的弹性模量。
33.优选地，所述组织包含肌腱、韧带中的至少一种；进一步为肌腱。
34.优选地，所述肌腱包含跟腱、肩袖、冈上肌中的至少一种；进一步为跟腱。
35.优选地，所述韧带包含肘关节周围韧带、膝关节周围韧带、交叉韧带中的至少一种。
36.优选地，所述抗体或其抗原结合片段选自fab、fab'、f(ab')2、fd、fv、dab、互补决定区片段、单链抗体、人源化抗体、嵌合抗体或双抗体。
37.优选地，所述药物还包含一种或多种药学上可接受的辅料。
38.优选地，所述药学上可接受的辅料包含缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂中的至少一种。
39.优选地，所述药物的剂型包含固体制剂、液体制剂、半固体制剂中的至少一种。
40.优选地，所述药物包含片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、液体制剂、煎膏剂、悬浮剂、分散剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂、贴剂中的至少一种。
41.本发明第四方面，提供pd-1抗体或其抗原结合片段衍生物在制备抑制组织损伤后的异位骨化形成的药物中的应用。
42.优选地，所述组织包含肌腱、韧带中的至少一种；进一步为肌腱。
43.优选地，所述肌腱包含跟腱、肩袖、冈上肌中的至少一种；进一步为跟腱。
44.优选地，所述韧带包含肘关节周围韧带、膝关节周围韧带、交叉韧带中的至少一种。
45.优选地，所述抗体或其抗原结合片段选自fab、fab'、f(ab')2、fd、fv、dab、互补决定区片段、单链抗体、人源化抗体、嵌合抗体或双抗体。
46.优选地，所述药物还包含一种或多种药学上可接受的辅料。
47.优选地，所述药学上可接受的辅料包含缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂中的至少一种。
48.优选地，所述药物的剂型包含固体制剂、液体制剂、半固体制剂中的至少一种。
49.优选地，所述药物包含片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、液体制剂、煎膏剂、悬浮剂、分散剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂、贴剂中的至少一种。
50.本发明的有益效果是：
51.本发明首次公开了pd-1抗体或其抗原结合片段衍生物在预防和/或治疗运动损伤中的应用，pd-1抗体或其抗原结合片段衍生物可以显著提高损伤的组织的弹性模量、降低损伤的组织的钙化体积、减少损伤的组织的异位骨化形成，通过抑制损伤的组织钙化形成、改善损伤的组织的生物力学性能和/或减少损伤的组织的异位骨化形成，以达到治疗运动损伤的目的，可用于制备预防和/或治疗运动损伤的药物，便于应用于临床以及日常肌腱损伤后的保健。
附图说明
52.图1为pd-1抗体对小鼠跟腱断裂损伤后的生物力学参数的影响图；其中，a为是pd-1抗体对小鼠跟腱断裂损伤后的弹性模量的影响图，b是pd-1抗体对小鼠跟腱断裂损伤后的对横截面积的影响图，c是pd-1抗体对小鼠跟腱断裂损伤后的最大拉力的影响图；d是pd-1抗体对小鼠跟腱断裂损伤后的最大应力的影响图，图中，*表示p《0.05，ns表示无统计学差异。
53.图2为pd-1抗体对小鼠跟腱断裂损伤后肌腱钙化形成的影响图；其中，a是pd-1抗体对小鼠跟腱断裂损伤后肌腱钙化形成影响的ct扫描3d重建图，b是pd-1抗体对小鼠跟腱断裂损伤后肌腱钙化形成影响的统计结果图，图中*表示p＜0.05。
54.图3为小鼠跟腱断裂损伤后的组织切片he染色结果图，比例尺为1mm。
具体实施方式
55.以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
56.应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
57.本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。
58.实施例1 pd-1抗体对小鼠跟腱断裂损伤修复后的生物力学性能的影响
59.将30只9周龄c57小鼠(由南方医科大学实验动物中心提供，饲养于南方医科大学南方医院spf级动物房内，鼠笼和所用器皿均严格消毒，自由采食和饮用纯净水；实验前观察小鼠有无其它临床症状)随机为两组，采用跟腱切断模型模拟肌腱断裂损伤，跟腱切断模型的构建方法具体如下：将小鼠术前注射三溴乙醇麻醉成功后，将其仰卧在手术台上，对右后脚跟处皮肤进行脱毛及常规消毒；无菌条件下在右后跟处皮肤做一约1厘米的纵向切口，暴露肌膜及跟腱；在跟腱中段横断跖肌腱及跟腱，缝合皮肤。
60.在造模后第二天开始给药(对照组：每只小鼠注射50μl pbs；实验组：每只小鼠注射50μg pd-1抗体，注射前将抗体原液稀释为1mg/ml；pd-1抗体的注射量是通过相关文献以及前期实验得出，不会对小鼠产生不良反应；pd-1抗体购买自bio x cell公司，货号：bp0146)，每3天进行1次腹腔注射给药，给药共持续4周。之后取小鼠跟腱进行生物力学拉伸试验，具体方法如下：以安乐死的方式处死小鼠，取小鼠右下肢，用pbs润洗，之后利用3d激光扫描仪(handyscan 3d
tm
)检测跟腱的横截面积(cross area)，并利用万能材料试验机(instron)对跟腱进行拉伸试验，计算出弹性模量(modulus)、最大应力(max stress)、最大拉力(max force)。
61.生物力学性能是评估肌腱损伤修复效果的最重要指标，本实施例通过对跟腱断裂
损伤的小鼠腹腔注射pd-1抗体，检测小鼠跟腱的相关生物学性能，结果如图1所示，与对照组相比，实验组小鼠跟腱的弹性模量得到显著提高(p＜0.05)，表明pd-1抗体可以提高小鼠跟腱的弹性模量。同时，实验组小鼠跟腱的横截面积、最大应力、最大拉力与对照组小鼠跟腱的横截面积、最大应力、最大拉力无统计学差异，表明pd-1抗体对小鼠跟腱的横截面积、最大应力、最大拉力没有影响。综上，pd-1抗体可有效改善小鼠跟腱断裂损伤后的生物力学性能，即pd-1抗体对小鼠肌腱损伤具有较好的修复作用。
62.实施例2 pd-1抗体对小鼠跟腱断裂损伤后肌腱钙化的影响
63.将20只9周龄c57小鼠随机为两组，采用跟腱切断模型模拟肌腱断裂损伤，跟腱切断模型的构建方法具体如下：将小鼠术前注射三溴乙醇麻醉成功后，将其仰卧在手术台上，对右后脚跟处皮肤进行脱毛及常规消毒；无菌条件下在右后跟处皮肤做一约1厘米的纵向切口，暴露肌膜及跟腱；在跟腱中段横断跖肌腱及跟腱，缝合皮肤。
64.在造模后第二天开始给药(对照组：每只小鼠注射50μl pbs；实验组：每只小鼠注射50μg pd-1抗体，注射前将抗体原液稀释为1mg/ml；pd-1抗体的注射量是通过相关文献以及前期实验得出，不会对小鼠产生不良反应；pd-1抗体购买自bio x cell公司，货号：bp0146)，每3天进行1次腹腔注射给药，给药共持续4周。之后取小鼠跟腱进行micro-ct检测及分析，同时对小鼠跟腱组织进行常规的he染色。小鼠跟腱micro-ct检测具体检测步骤如下：以安乐死处死小鼠，取小鼠右下肢，用pbs润洗，并用多聚甲醛固定24小时，之后保存于pbs试管中。将右下肢平行放置固定于小动物活体x光micro-ct(skyscan 1276)的检测舱中，扫描结束后，使用ctan软件分析钙化大小。
65.钙化形成是运动损伤后常见且严重的并发症，本实施例通过对小鼠跟腱进行micro-ct检测，结果如图2所示，与对照组相比，实验组小鼠跟腱中钙化体积得到显著降低(p＜0.05)，即pd-1抗体可以显著降低肌腱损伤后的钙化体积，表明pd-1抗体可以抑制跟腱断裂损伤后肌腱钙化形成。通过对小鼠跟腱组织进行he染色，结果表明，以对照组相比，通过对肌腱断裂损伤的小鼠注射pd-1抗体，其小鼠跟腱组织中无明显的异位骨化形成区域(图3，其中虚线圈内部分为异位骨化形成区域)，表明pd-1抗体可以显著减少肌腱损伤后的异位骨化形成。
66.上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。