用于成像和治疗的纤维蛋白结合化合物的制作方法

用于成像和治疗的纤维蛋白结合化合物
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年10月23日提交的美国临时申请第62/924,997号的优先权，其通过引用全部纳入本文。
3.联邦资助的研究或开发
4.这项发明是在美国国立卫生研究院授予的合同号hhsn268201400044c的政府支持下完成的。政府对本发明拥有一定的权利。
技术领域
5.本公开涉及包含放射性部分的纤维蛋白结合化合物，其用于诊断成像和治疗与纤维蛋白的存在有关的各种疾病和病症。


背景技术：

6.纤维蛋白是一种源自可溶性血浆蛋白纤维蛋白原的纤维状非球状蛋白，是血栓(thrombi)的主要成分。由蛋白酶凝血酶促进的纤维蛋白原聚合形成纤维蛋白，其与血小板一起导致在伤口部位形成血栓，从而阻止进一步的出血。无论血栓年龄或身体位置如何，纤维蛋白存在于所有血栓中，并且可用于诊断和治疗涉及纤维蛋白的存在的疾病和病症。诸如磁共振成像(mri)、x射线和包括正电子发射断层扫描(pet)和单光子发射计算机断层扫描(spect)在内的核放射性药物成像等诊断成像技术通常用于诊断心血管状况。一种方法依赖于通过包括纤维蛋白在内的特定分子靶标实现的血栓可视化。
7.此外，已知纤维蛋白在恶性肿瘤的病理生理学中起重要作用(costantini和zacharski,1992,cancer and metastasis rev.,11,283)。在癌症中，肿瘤侵袭和转移可能导致邻近血管组织的侵蚀并进而导致出血，随后在肿瘤内形成血栓，并以与正常伤口愈合过程类似的方式被胶原蛋白替代(例如参见falanga等人,2013,j thromb haemost,11,223-233；obonai等人,2016,sci.rep.,6,23613)。与正常伤口愈合过程(血栓仅在伤口的开始形成，而最终由于纤溶酶消化或被胶原蛋白替代而消失)不同的是，只要癌细胞在体内存活，癌症中的纤维蛋白凝块就会持续存在。不溶性纤维蛋白在各种肿瘤组织和血栓中的沉积与肿瘤的侵袭性和进展有关。因此，需要能够用于诊断和治疗各种癌症的纤维蛋白靶向剂。
8.此外，已知纤维蛋白沉积物与和全身炎症(神经炎症)相关的神经退行性疾病有关，例如阿尔茨海默病(ad)、多发性硬化症和创伤性脑损伤(tbi)。纤维蛋白沉积物与包括ad和tbi在内的神经炎性疾病中的记忆力降低有关(sulimai和lominadze,2020,mol.neurobiol.,57,4692-4703)。因此，还需要能够用于诊断和治疗神经炎症的纤维蛋白靶向剂。
9.本文提供了一种纤维蛋白特异性结合化合物以及用于纤维蛋白成像的方法。本文还提供了治疗包括心血管疾病、脑血管疾病和癌症在内的与纤维蛋白的存在有关的各种疾病和病症的方法。


技术实现要素：

10.本公开提供了式iv化合物：
[0011][0012]
或其药学上可接受的盐，
[0013]
其中，r4为放射性同位素；
[0014]
c4为选自下组的螯合部分：
[0015]
[0016]
[0017]
[0018][0019]
cp4为纤维蛋白结合肽；
[0020]
aa为纤维蛋白结合肽的n末端氨基酸；
[0021]
l4为接头；
[0022]
y为选自0和1的整数；以及
[0023]
z为选自0和1的整数。
[0024]
在式iv化合物的一些实施方式中，r4是选自治疗放射性同位素和能够使用核成像技术检测的放射性同位素的放射性同位素。在一些实施方式中，能够使用核成像技术检测的放射性同位素是正电子发射同位素或适用于单光子发射计算机断层扫描(spect)成像的放射性同位素。在一些实施方式中，正电子发射同位素选自氟-18、氟化铝(al
11
8f)、钪-43、钪-44、锰-51、锰-52、铜-60、铜-61、铜-62、铜-64、镓-68、钇-86、锆-89、碘-124、铽-149和铽-152。在一些实施方式中，正电子发射同位素选自氟-18、铜-64和镓-68。在一些实施方式中，正电子发射同位素为氟-18。在一些实施方式中，正电子发射同位素为铜-64。在一些实施方式中，正电子发射同位素为镓-68。在一些实施方式中，适用于spect成像的放射性同位素选自镓-67、锝-99m、铟-111、碘-123、铽-155和铅-203。
[0025]
在一些实施方式中，放射性同位素是治疗放射性同位素(例如β发射体或α发射体)。在一些实施方式中，治疗放射性同位素选自钪-47、铜-67、钇-90、碘-125、碘-131、钐-153、铽-161、钬-166、镥-177、铼-188、砹-211、铅-212、铋-213、镭-223、锕-225和钍-227。在一些实施方式中，治疗同位素选自钇-90、镥-177和锕-225。在一些实施方式中，治疗同位素为钇-90。在一些实施方式中，治疗同位素为镥-177。在一些实施方式中，治疗同位素为锕-225。
[0026]
在式iv化合物的一些实施方式中，aa-cp4是包含与seq id no:1的多肽具有至少80％序列同一性的序列的纤维蛋白结合肽：
[0027]
–
y*
–
x1–c–
hyp
–
y(3-cl)
–
x2–
l
–c–
x3–i–
x4–
(seq id no:1)
[0028]
其中，x1、x2、x3和x4各自独立地为任何氨基酸；以及
[0029]
y*是l-酪氨酸或d-酪氨酸。
[0030]
在式iv化合物的一些实施方式中，aa-cp4是包含与选自下组的多肽具有至少80％序列同一性的多肽的纤维蛋白结合肽：
[0031][0032]
在式iv化合物的一些实施方式中，aa-cp4是与选自下组的多肽具有至少80％序列同一性的纤维蛋白结合肽：
[0033][0034]
在式iv化合物的一些实施方式中，aa-cp4是与选自下组的多肽具有至少80％序列同一性的纤维蛋白结合肽：
[0035][0036]
在式iv化合物的一些实施方式中，aa-cp4是与以下多肽具有至少80％序列同一性的纤维蛋白结合肽：
[0037][0038]
在式iv化合物的一些实施方式中，c4独立地选自下组：
[0039][0040]
在一些实施方式中，c4为在一些实施方式中，c4独立地选自下组：
[0041][0042][0043]
在一些实施方式中，c4独立地选自下组：
[0044][0045]
在式iv化合物的一些实施方式中，y为0。在一些实施方式中，y为1。
[0046]
在式iv化合物的一些实施方式中，l4为吡啶基或(吡啶基)-c(o)-。
[0047]
在式iv化合物的一些实施方式中，z为0。在一些实施方式中，z为1。
[0048]
在一些实施方式中，y为1且z为0。在一些实施方式中，y为1且z为1。在一些实施方式中，0且z为0。在一些实施方式中，y为0且z为1。
[0049]
在一些实施方式中，式iv化合物为式iva化合物：
[0050][0051]
或其药学上可接受的盐，其中，r4是能够被螯合部分c4螯合的放射性同位素。
[0052]
在一些实施方式中，r4选自氟化铝(al
18
f)、钪-43、钪-44、钪-47、锰51、锰52、铜-60、铜-61、铜-62、铜-64、铜-67、镓-67、镓-68、钇-86、锆89、锝-99m、钇-90、铟-111、铽-149、铽-152、钐-153、铽-155、铽-161、钬-166、镥-177、铼-188、铅-203、铅-212、铋-213、镭-223、锕-225和钍-227。
[0053]
在一些实施方式中，式iv化合物为式ivb化合物：
[0054][0055]
或其药学上可接受的盐，其中，r4是能够与接头l4、纤维蛋白结合肽aa的n-末端氨基酸或两者共价结合的放射性同位素。
[0056]
在一些实施方式中，r4选自氟-18、碘-123、碘-124、碘-125、碘-131和砹-211。
[0057]
在一些实施方式中，式iv化合物为式ivc化合物：
[0058][0059]
或其药学上可接受的盐，其中，r4是能够与接头l4、纤维蛋白结合肽aa的n-末端氨基酸或两者共价结合的放射性同位素。
[0060]
在一些实施方式中，r4选自氟-18、碘-123、碘-124、碘-125、碘-131和砹-211。
[0061]
在一些实施方式中，式iv化合物为式ivd化合物：
[0062][0063]
或其药学上可接受的盐，其中，r4是能够与接头l4、纤维蛋白结合肽aa的n-末端氨基酸或两者共价结合的放射性同位素。
[0064]
在一些实施方式中，r4选自氟-18、碘-123、碘-124、碘-125、碘-131和砹-211。
[0065]
在一些实施方式中，式iv化合物选自下组：
[0066]
[0067]
[0068]
[0069][0070]
或其药学上可接受的盐。
[0071]
在一些实施方式中，式iv化合物选自下组：
[0072][0073]
或其药学上可接受的盐。
[0074]
在一些实施方式中，式iv化合物为：
[0075][0076]
或其药学上可接受的盐。
[0077]
在一些实施方式中，式iv化合物选自下组：
[0078]
[0079][0080]
本公开还提供了一种药物组合物，其包含式iv化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的赋形剂。
[0081]
在一些实施方式中，药物组合物包含自由基清除剂。在一些实施方式中，自由基清除剂为抗氧化剂。在一些实施方式中，自由基清除剂选自鼠尾草酸、绿茶提取物、芹菜素、地奥思明、迷迭香酸、硫辛酸、β-胡萝卜素、l-抗坏血酸(维生素c)、n-乙酰半胱氨酸(nac)、δ-生育酚、芦丁、氨磷汀、白藜芦醇、龙胆酸和没食子酸。
[0082]
本文还提供了一种对哺乳动物中的纤维蛋白进行成像的方法，该方法包括：a)向哺乳动物施用有效量的药物组合物，其含有式iv化合物或有效量的式iv化合物或其药学上可接受的盐，其中，r4是能够使用核成像技术检测的放射性同位素；b)使用核成像技术获取哺乳动物纤维蛋白的图像；c)使用磁共振成像或计算机断层扫描获取哺乳动物的解剖图像；以及d)叠加步骤b)和c)的图像以在哺乳动物的解剖图像内定位纤维蛋白图像。
[0083]
在一些实施方式中，纤维蛋白的存在与神经炎症有关。在一些实施方式中，神经炎
选自氟-18、氟化铝(al
18
f)、钪-43、钪-44、铜-64、镓-68、钇-86、锆89、铟-111、碘-123、碘-124、铽-149、铽-152、铽-155和铅-203。在一些实施方式中，能够使用核成像技术检测的r4选自氟-18、铜-64和镓-68。在一些实施方式中，能够使用核成像技术检测的r4为氟-18。在一些实施方式中，能够使用核成像技术检测的r4为铜-64。在一些实施方式中，能够使用核成像技术检测的r4为镓-68。
[0093]
在该方法的一些实施方式中，作为治疗放射性同位素的r4选自钪-47、铜-67、钇-90、碘-131、钐-153、铽-161、钬-166、镥-177、铼-188、砹-211、铅-212、铋-213、镭-223、锕-225和钍-227。在一些实施方式中，作为治疗放射性同位素的r4选自钇-90、镥-177和锕-225。在一些实施方式中，作为治疗放射性同位素的r4为钇-90。在一些实施方式中，作为治疗放射性同位素的r4为镥-177。在一些实施方式中，作为治疗放射性同位素的r4为锕-225。
[0094]
在一些实施方式中，该方法还包括施用氨基酸溶液。在一些实施方式中，在施用包含式iv化合物或有效量的式iv化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物之前、同时、之后施用氨基酸溶液或其组合。
[0095]
在一些实施方式中，该方法还包括施用止吐剂。在一些实施方式中，在施用氨基酸溶液之前、同时、之后施用止吐剂或其组合。
[0096]
在该方法的一些实施方式中，与纤维蛋白的存在有关的疾病或病症是癌症。
[0097]
本公开还提供了一种检测和治疗与哺乳动物中存在的纤维蛋白有关的疾病或病症的方法，该方法包括：a)向哺乳动物施用有效量的药物组合物，其含有式iv化合物或有效量的式iv化合物或其药学上可接受的盐，其中，r4是能够使用核成像技术检测的放射性同位素，其选自氟-18、铜-64和镓-68；b)使用核成像技术获取哺乳动物纤维蛋白的图像；c)使用磁共振成像或计算机断层扫描获取哺乳动物的解剖图像；d)叠加步骤b)和c)的图像以在哺乳动物的解剖图像内定位纤维蛋白图像；以及e)施用有效量的药物组合物，其含有式iv化合物或有效量的式iv化合物或其药学上可接受的盐，其中，r4是治疗放射性同位素，其选自钇-90、镥-177和锕-225。在一些实施方式中，纤维蛋白存在于肿瘤中。在一些实施方式中，肿瘤是癌性的。
[0098]
本公开还提供了式v化合物：
[0099][0100]
或其药学上可接受的盐，其中：
[0101]
c4为螯合部分；
[0102]
cp4为纤维蛋白结合肽；
[0103]
aa为纤维蛋白结合肽的n末端氨基酸；
[0104]
l4为接头；
[0105]
y为选自0或1的整数；以及
[0106]
z为选自0或1的整数。
[0107]
在一些实施方式中，式v化合物是选自下组的化合物：
[0108]
化合物序列
16nodaga
–y–e–c–
hyp
–
y(3
–
cl)
–g–
l
–c–y–i–q–
nh217nodaga
–y–e–c–
hyp
–
y(3
–
cl)
–g–
l
–c–y–i–q–
nh218nodaga
–y–e–c–
hyp
–
y(3
–
cl)
–g–
l
–c–h–i–q–
nh219nodaga
–y–e–c–
hyp
–
y(3
–
cl)
–g–
l
–c–h–i–q–
nh220nodaga
–y–e–c–
hyp
–
y(3
–
cl)
–g–
l
–c–h–i–q–
nh221nodaga
–y–e–c–
hyp
–
y(3
–
cl)
–g–
l
–c–h–i–i–
nh222nodaga-y-e-c-hyp-y(3-cl)-g-l-c-h-i-q-nh223dotaga
–y–e–c–
hyp
–
y(3
–
cl)
–g–
l
–c–h–i–q–
nh224nota
–y–e–c–
hyp
–
y(3
–
cl)
–g–
l
–c–h–i–q–
nh2。
[0109]
本文提供了式i化合物：
[0110]
[m1]m–
[c1]n–
[cp1]
–
[l1]o–
[c1]
p
–
[m1]
q(i)[0111]
或其药学上可接受的盐，
[0112]
其中，各个m1独立地为铜-64或镓-68；
[0113]
各个c1为独立地选自下组的螯合部分：
[0114][0115]
cp1为纤维蛋白结合肽；
[0116]
各个l1独立地为接头部分；
[0117]
m为选自0-5的整数；
[0118]
n为选自0-5的整数；
[0119]
o为选自0-5的整数；
[0120]
p为选自0-5的整数；以及
[0121]
q为选自0-5的整数。
[0122]
在一些实施方式中，m1为铜-64。在一些实施方式中，m1为镓-68。
[0123]
在一些实施方式中，各个c1独立地选自下组：
[0124][0125]
在一些实施方式中，各个c1为
[0126]
在一些实施方式中，各个c1独立地选自下组：
[0127][0128]
在一些实施方式中，cp1是包含与seq id no:1的多肽具有至少80％序列同一性的序列的纤维蛋白结合肽：
[0129]
–
y*
–
x1–c–
hyp
–
y(3-cl)
–
x2–
l
–c–
x3–i–
x4–
(seq id no:1)
[0130]
其中，x1、x2、x3和x4各自独立地为任何氨基酸；以及
[0131]
y*是l-酪氨酸或d-酪氨酸。
[0132]
在一些实施方式中，cp1是包含与选自下组的多肽具有至少80％序列同一性的多
肽的纤维蛋白结合肽：
[0133][0134]
在一些实施方式中，cp1是与选自下组的多肽具有至少80％序列同一性的纤维蛋白结合肽：
[0135]
[0136][0137]
在一些实施方式中，各个l1独立地选自下组：
[0138][0139]
在一些实施方式中，m为1。在一些实施方式中，p为1。在一些实施方式中，n为1。在一些实施方式中，o为1。
[0140]
在一些实施方式中，式i化合物选自下组：
[0141]
[0142]
[0143]
[0144]
[0145][0146]
或其药学上可接受的盐。
[0147]
本文还提供了式ii化合物：
[0148]
[m2]r–
[c2]s–
[cp2]
–
[r2]
t
(ii)
[0149]
或其药学上可接受的盐，
[0150]
其中，各个m2独立地为锕-225、砹-211、铋-213、铜-64、铜-67、氟化铝(al
18
f)、镓-68、钬-166、铟-111、碘-123，碘-124、碘-131、铅-203、铅-212、镥-177、镭-223、钐-153、钪-43、钪-44、钪-47、铽-149、铽-152、铽-155，铽-161，钍-227；钇-86、钇-90或锆89；
[0151]
各个c2独立地为螯合部分；
[0152]
cp2为纤维蛋白结合肽；
[0153]
各个r2独立地为有机的非螯合部分；
[0154]
r为选自0-5的整数；
[0155]
s为选自0-5的整数；以及
[0156]
t为选自0-5的整数。
[0157]
在一些实施方式中，m2为铜-64。在一些实施方式中，m2为镓-68。
[0158]
在一些实施方式中，cp2是包含与seqidno:16的多肽具有至少80％序列同一性的多肽的纤维蛋白结合肽：
[0159]
–
y*
–
x5–c–
hyp
–
y(3-cl)
–
x6–
l
–c–
x7–i–
x8–
(seqidno:16)
[0160]
其中，x5、x6、x7和x8各自独立地为任何氨基酸；以及
[0161]
y*是l-酪氨酸或d-酪氨酸。
[0162]
在一些实施方式中，cp2是包含与选自下组的多肽具有至少80％序列同一性的多肽的纤维蛋白结合肽：
[0163][0164]
在一些实施方式中，cp2是与选自下组的多肽具有至少80％序列同一性的纤维蛋白结合肽：
[0165][0166]
在一些实施方式中，r为1。在一些实施方式中，s为1。在一些实施方式中，t为1。
[0167]
本文还提供了式iii化合物：
[0168]
[r3]u–
[cp3]
–
[c3]v–
[m3]w(iii)
[0169]
或其药学上可接受的盐，
[0170]
其中，各个m3独立地为铜-64或镓-68；
[0171]
各个c3为螯合部分；
[0172]
cp3为纤维蛋白结合肽；
[0173]
各个r3独立地为有机的非螯合部分；
[0174]
u为选自0-5的整数；
[0175]
v为选自0-5的整数；以及
[0176]
w为选自0-5的整数。
[0177]
在一些实施方式中，m3为铜-64。在一些实施方式中，m3为镓-68。
[0178]
在一些实施方式中，cp3是包含与seqidno:17的多肽具有至少80％序列同一性的多肽的纤维蛋白结合肽：
[0179]
–
y*
–
x9–c–
hyp
–
y(3-cl)
–
x
10
–
l
–c–
x
11
–i–
x
12
–
(seqidno:17)
[0180]
其中，x9、x
10
、x
11
和x
12
各自独立地为任何氨基酸；以及
[0181]
y*是l-酪氨酸或d-酪氨酸。
[0182]
在一些实施方式中，cp3是包含与选自下组的多肽具有至少80％序列同一性的序
列的纤维蛋白结合肽：
[0183][0184]
在一些实施方式中，cp3是与选自下组的多肽具有至少80％序列同一性的纤维蛋白结合肽：
[0185][0186]
在一些实施方式中，u为1。在一些实施方式中，v为1。在一些实施方式中，w为1。
[0187]
本文还提供了包含式i、式ii或式iii的化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
[0188]
本文还提供了一种对哺乳动物中的纤维蛋白进行成像的方法，该方法包括向哺乳动物施用有效量的式i、式ii或式iii的化合物或其药学上可接受的盐、或包含式i、式ii或式iii的化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的赋形剂的药物组合物；使用核成像技术获取哺乳动物的纤维蛋白的图像；使用磁共振成像或计算机断层扫描获取哺乳动物的解剖图像；叠加图像以在哺乳动物的解剖图像内定位纤维蛋白的图像。
[0189]
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请通过引用纳入本文，就好像将各篇单独的出版物、专利或专利申请专门和单独地通过引用纳入本文那样。在以引用方式纳入的出版物和专利或专利申请与说明书中包含的公开相矛盾的情况下，说明书将取代和/或优先于任何此类矛盾的材料。
[0190]
从下文的详述、附图和所附权利要求中能够很容易地了解本发明的其它特征和优点。
附图说明
[0191]
图1描述了化合物4、6、7、10、12、13、14和15的荧光偏振dd(e)结合/置换测定。
[0192]
图2描述了化合物2、3、5、8、9和11的荧光偏振dd(e)结合/置换测定。
[0193]
图3描述了化合物在37℃下在大鼠血浆中最长达4小时的稳定性。
[0194]
图4描述了半制备型hplc纯化后
18
f-py-tfp的放射性hplc迹线。
[0195]
图5描述了半制备型hplc纯化后化合物
18
f-7的放射性hplc迹线。
[0196]
图6描述了以线性比例绘制的平板测定数据，以突出显示在tbs缓冲液(顶部)和人血浆(底部)中各个纤维蛋白单体约2个结合位点的饱和度。
[0197]
图7描述了化合物
18
f-7在tbs缓冲液(顶部，kd＝1.6
±
0.2μm)和人血浆(底部，kd＝1.8
±
0.2μm)中与人纤维蛋白的结合。
[0198]
图8描述了化合物
68
ga-20的放射性hplc迹线。
[0199]
图9描述了颈动脉挤压损伤大鼠模型中的血液清除。在探针注射前和注射后2、5、10、15、30、60、90、120分钟抽取血样。各个样品中的活性以每克组织的注射剂量百分比(％id)计算。
[0200]
图10描述了在大鼠注射之前(t＝0分钟)和之后(t＝10、60)与纤维蛋白结合的
68
ga标记化合物的百分比。
[0201]
图11描述了循环放射性的分数。将在探针注射后10和60分钟收集的血液离心，以分离血浆。之后，将血浆在固定有纤维蛋白的孔中在室温下孵育2小时。孵育后，在γ计数器上测量含纤维蛋白孔和空孔中上清液中的计数并除以血浆重量以分别确定未结合探针[未结合]和总探针[总]的浓度。含有与纤维蛋白结合的物质的
68
ga量[结合]由[结合]＝[总]-[未结合]计算获得。作为阳性对照，将剂量的等分试样加标到血浆中并用于估计测定中可能的总纤维蛋白结合(t＝0时的结合％)。时间t时血液中功能性探针的量通过取时间t时的纤维蛋白结合％与t＝0时的结合％的比例并将该比例乘以血液中测得的总
68
ga％id/g来确定。
[0202]
图12描述了在大鼠中注射化合物
68
ga-16、
68
ga-17、
68
ga-18、
68
ga-19、
68
ga-20和
68
ga-21后血液分析的放射性hplc迹线。迹线代表注射后15和90分钟的血液分析。
[0203]
图13描述了注射
68
ga标记的化合物后大鼠体内的生物分布。各种器官中的活性显示为每克组织的注射剂量百分比(％id)。
[0204]
图14描述了放射自显影的代表性图像，显示了与对象对侧相比，凝块(ipsi)中化合物
68
ga-19(左)和
68
ga-20(右)的活性。
[0205]
图15(上图)描述了右颈动脉血栓的大鼠的正交ct图像。黄色箭头显示右侧颈动脉的位置，其由于ct对比剂灌注而略微高亮。轴向图像(左上)中的橙色箭头显示对侧颈动脉。(下图)描述了施用
68
ga-20后的pet-ct融合图像，pet图像以色标呈现。绿色十字线表示所示三个正交图像切片的位置，在这种情况下，以右颈动脉血栓为中心。在这个动物模型中，通过在喉咙上切开一个切口，分离右颈总动脉，之后对血管产生挤压伤，以诱导血栓。该模型还导致手术损伤部位周围形成微血栓，这由轴向(左下)和矢状(右下)图像中的红色箭头表示。
[0206]
图16描述了化合物
68
ga-20在对照兔和斑块破裂兔中pet摄取随时间的变化。黑色实线表示各个时间点的破裂：对照比。
[0207]
图17描述了来自斑块破裂兔(左图)和对照兔(右图)的化合物
68
ga-20pet(上图)、高分辨率t2 mr(中图)和tof(下图)的代表性图像。箭头表示腹主动脉(绿色)和下腔静脉(蓝色)。插图显示主动脉和腔静脉的缩放pet-mr图像。
[0208]
图18描述了在来自颈动脉内膜切除术患者的样本中纤维蛋白结合探针
68
ga-20的摄取显著高于非结合探针
68
ga-22。来自具有高(图18a-18f)和低(图18g-18l)68ga-20摄取的患者标本的代表性放射自显影(图18a-18b和18g-18h)和carstairs染色切片(图18c-18f和18i-18l)的光学显微镜图像。高摄取样本(图18c-18f)显示出纤维蛋白(黄色箭头)的强烈存在，其有或没有伴随的红细胞(绿色箭头)，甚至形成纤维蛋白网(图18c-18d)，而在低摄取样本中(图18i-18l)，纤维蛋白的存在是最小的。比例尺：图18c、18e、18i、18k为100μm；图18d、18f、18j、18l中为200μm。来自所有12名患者的丢弃的动脉内膜切除术标本的放射自显影(图18m)和功能性探针测定(图18n)揭示了，与非结合探针相比
68
ga-22，纤维蛋白结合探针
68
ga-20的摄取可变且显著增加(p《0.05)。虚线：
68
ga-22平均值、平均值
±
sd和平均值
±
2sd截止线。
[0209]
发明详述
[0210]
血栓栓塞在包括中风、冠状动脉状况、深静脉血栓形成和肺栓塞在内的许多潜在的致命心血管状况中起致病作用。在美国每年发生的近795,000次中风中，超过80％是缺血性或血栓栓塞性中风。治疗选择很大程度上受血栓解剖位置的影响。目前，需要多项测试来评估各个身体区域，例如，ct扫描用于定位肺血栓，超声测试可以用于颈动脉，mri分析提供心腔图像。要确定适当的治疗手段，必需要快速定位罪魁祸首的凝块。
[0211]
人们已经开发了许多方法来可视化整个身体的血栓。纤维蛋白是一个特别有吸引力的靶标，因为它存在于包括动脉、静脉和心脏在内的所有血栓中；它在血浆中没有发现，这使得可视化技术具有高度特异性；在凝块发展的所有活跃阶段都可以使用它；它是一个高浓度靶标，浓度约为20-100μm。例如，纤维蛋白结合肽可以用能够螯合各种金属的放射性同位素的螯合部分进行功能化，其包括但不限于锕-225、铋-213、铜-64、铜-67、铝氟化物(al
18
f)、镓-68、钬-166、铟-111、铅-203、铅-212、镥-177、镭-223、钐-153、钪-43、钪-44、钪-47、铽-149、铽-152、铽-155、铽-161、钍-227、钇-86、钇-90和锆89。纤维蛋白结合肽也可以用放射性同位素(包括但不限于
18
f、
123
i、
124
i、
131
i和
211
at)通过直接共价修饰或通过接头的间接共价修饰进行功能化，而不需要螯合基团。在一些实施方式中，放射性同位素(其包括金属的放射性同位素)可以用作成像剂或诊断剂。在一些实施方式中，放射性同位素(包括金属的放射性同位素)可以用作治疗剂。本文提供了包含一种或多种放射性同位素的纤维蛋白特异性化合物。本文还提供了用于使纤维蛋白成像的方法。本文还提供了使用本公开的纤维蛋白特异性化合物作为成像或诊断剂、治疗剂或两者来治疗疾病或病症的方法。
[0212]
定义
[0213]
未在本公开中明确定义的常用化学缩写可以参见美国化学学会形式指南(the american chemical society style guide)第二版，美国化学学会，华盛顿特区(1997)中找到；“2001作者指南(2001guidelines for authors)”j.org.chem.66(1),24a(2001)；以及“缩略语及其在肽科学中的使用的简短指南(a short guide to abbreviations and their use in peptide science)”，j.peptide sci.5,465-471(1999)。
[0214]
如本文所用，术语“肽”是指长度为约2-约25个氨基酸残基的氨基酸链。本文中所有肽序列都是从n末端到c末端书写的。对于本文所述的任何含有两个或更多个半胱氨酸残基的肽，应理解半胱氨酸残基可以在非还原条件下形成一个或多个二硫键。二硫键的形成可以导致环肽的形成。
[0215]
如本文所用，术语“天然的”或“天然存在的”氨基酸是指自然界中存在的二十种最常见的氨基酸之一。经修饰以提供用于检测目的的标记(例如放射性标记、光学标记或染料)的天然氨基酸被认为是天然氨基酸。天然l氨基酸以其标准的一或三字母缩写表示。d氨基酸使用小写约定表示标准的单字母缩写，使用“d
‑”
前缀约定表示标准的三字母缩写。
[0216]
如本文所用，术语“螯合剂”、“螯合基团”和“螯合部分”是指可以在配体和单个中心原子(通常为金属离子)之间形成两个或更多个单独配位键的多齿(多键)配体。在一些实施方式中，金属离子为金属的放射性同位素。这种金属离子的示例包括但不限于锕-225、铋-213、铜-64、铜-67、镓-68、钬-166、铟-111、铅-203、铅-212、镥-177、镭-223、钐-153、钪-43、钪-44、钪-47、铽-149、铽-152、铽-155、铽-161、钍-227、钇-86、钇-90和锆89。
[0217]
如本文所用，术语“放射同位素”、“放射性同位素”、“放射核素”和“放射性核素”可以互换使用并且是指具有过量核能的不稳定原子；这种过量的能量可以通过以下三种方式之一发射：作为γ辐射从原子核发射；其电子之一作为转换电子转移和释放；或作为新粒子从原子核发射(α或β粒子)。这种过程被称为放射性同位素的放射性衰变。放射性同位素可以用于诊断成像和治疗多种疾病和病症，包括本公开中描述的那些。
[0218]
如本文所用，术语“靶向结合”和“结合”是指靶标内肽或组合物的非共价相互作用。这些非共价相互作用彼此独立，可能尤其为疏水性、亲水性、偶极-偶极、π-堆积、氢键、静电缔合和/或路易斯酸-碱相互作用。对靶标的结合亲和力以定义的一组条件下对靶标的平衡解离常数“k
d”表示。
[0219]
如本文所用，术语“纯化的”是指肽或化合物已与其正常结合的天然存在的有机分子分离，或者对于化学合成的分子而言，是指与化学合成中存在的其他有机分子分离。典型地，当多肽或化合物以干重计至少70％(例如，至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％)不含任何其他蛋白质或有机分子时，该多肽或化合物被认为是“纯化的”。术语“纯化的”和“分离的”在本文中可以互换使用。
[0220]
在两个或更多个核酸或多肽的上下文中，术语“同一性百分比”或“同一性”是指两个或更多个序列相同或具有特定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基。同一性百分比可以使用序列比较软件或算法或通过目测来测量。
[0221]
通常，通过确定比对的核酸或多肽序列中匹配位置的数量，将匹配位置的数量分别除以比对的核苷酸或氨基酸的总数，之后乘以100，来计算序列同一性百分比。匹配位置是指相同的核苷酸或氨基酸出现在比对的序列中的相同位置上的位置。比对的核苷酸或氨基酸的总数是指比对第二序列所必需的核苷酸或氨基酸的最小数量，并且不包括与非纤维蛋白结合序列的比对(例如强制比对)。比对的核苷酸或氨基酸的总数可以对应于整个序列或可以对应于全长序列的片段。
[0222]
序列可以使用altschul等人描述的算法(nucleic acids res,25:3389-3402,1997)进行比对，其并入blast(基本的局部比对搜索工具)程序，其可以在万维网上的ncbi.nlm.nih.gov获得。可以使用altschul等人的算法进行blast搜索或比对，以确定核酸或多肽与任何其他序列或其部分之间的序列同一性百分比。blastn是用来比对和比较核酸序列之间同一性的程序，而blastp是用来比对和比较氨基酸序列之间同一性的程序。当利用blast程序计算纤维蛋白结合序列和另一个序列之间的百分比同一性时，使用各个程序的默认参数。
[0223]
在值被描述为范围的情况下，应理解，不管具体的数值还是具体的子范围是否已经明确说明，这样的公开包括公开在这样的范围内的所有可能的子范围以及落入这样的范围内的具体数值。
[0224]
化合物
[0225]
本文提供了式i化合物：
[0226]
[m1]m–
[c1]n–
[cp1]
–
[l1]o–
[c1]
p
–
[m1]
q(i)[0227]
或其药学上可接受的盐，
[0228]
其中，各个m1独立地为铜-64或镓-68；
[0229]
各个c1为独立地选自下组的螯合部分：
[0230][0231][0232]
cp1为纤维蛋白结合肽；
[0233]
各个l1独立地为接头部分；
[0234]
m为选自0-5的整数；
[0235]
n为选自0-5的整数；
[0236]
o为选自0-5的整数；
[0237]
p为选自0-5的整数；以及
[0238]
q为选自0-5的整数。
[0239]
在式i的一些实施方式中，各个m1为铜-64。在式i的一些实施方式中，各个m1为镓-68。
[0240]
在式i的一些实施方式中，各个c1独立地选自下组：
[0241][0242]
在式i的一些实施方式中，c1为nodaga：
[0243]
在式i的一些实施方式中，各个c1独立地选自下组：
[0244][0245]
在式i的一些实施方式中，cp1是包含与seq id no:1的多肽具有至少80％序列同一性的序列的纤维蛋白结合肽：
[0246]
–
y*
–
x1–c–
hyp
–
y(3-cl)
–
x2–
l
–c–
x3–i–
x4–
(seq id no:1)
[0247]
其中，x1、x2、x3和x4各自独立地为任何氨基酸；以及y*是l-酪氨酸或d-酪氨酸。例如，cp1为纤维蛋白结合肽，其包含与seq id no:1的多肽具有至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方式中，cp1为seq id no:1的多肽(即它具有100％的序列同一性)。
[0248]
在一些实施方式中，y*为l-酪氨酸。在一些实施方式中，y*为d-酪氨酸。
[0249]
在一些实施方式中，x1、x2、x3和x4各自独立地选自天然存在的氨基酸。例如，x1、x2、x3和x4各自独立地选自ala、cys、asp、glu、phe、gly、his、ile、lys、leu、met、asn、pro、gln、arg、ser、thr、val、trp和tyr。在一些实施方式中，x1、x2、x3和x4各自独立地选自天然存在的氨基酸的d-构型。例如，x1、x2、x3、x4各自独立地选自d-ala、d-cys、d-asp、d-glu、d-phe、d-his、d-ile、d-lys、d-leu、d-met、d-asn、d-pro、d-gln、d-arg、d-ser、d-thr、d-val、d-trp和d-tyr。在一些实施方式中，x1为glu。在一些实施方式中，x1为d-his。在一些实施方式中，x2为gly。在一些实施方式中，x2为asp。在一些实施方式中，x2为d-asp。在一些实施方式中，x3为his。在一些实施方式中，x3为tyr。在一些实施方式中，x4为gln。在一些实施方式中，x4为d-gln。在一些实施方式中，x4为leu。在一些实施方式中，x4为d-leu。
[0250]
在一些实施方式中，x1、x2、x3和x4各自独立地选自非天然存在的氨基酸。例如，x1、x2、x3和x4各自独立地选自hyp、d-hyp、tyr-3-cl和d-tyr-3-cl。
[0251]
在式i的一些实施方式中，cp1为包含与选自下组的多肽具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％)序列同一性的多肽的纤维蛋白结合肽：
[0252]
[0253][0254]
在式i的一些实施方式中，cp1为与选自下组的多肽具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％)序列同一性的纤维蛋白结合肽：
[0255]
[0256][0257]
在式i的一些实施方式中，各个l1独立地选自下组：
[0258][0259]
在一些实施方式中，m为1。在一些实施方式中，m为2。在一些实施方式中，p为1。在一些实施方式中，p为2。在一些实施方式中，n为1。在一些实施方式中，n为2。在一些实施方式中，o为1。在一些实施方式中，o为2。在一些实施方式中，q为1。在一些实施方式中，q为2。在一些实施方式中，m、p、n、o和q各自为1。在一些实施方式中，m、p、n、o和q各自为2。
[0260]
在式i的一些实施方式中，化合物选自下组：
[0261]
[0262]
[0263][0264]
或其药学上可接受的盐。
[0265]
在式i的一些实施方式中，化合物选自下组：
[0266]
[0267]
[0268][0269]
或其药学上可接受的盐。
[0270]
本文还提供了式ia化合物：
[0271]
[m
1a
]
–
[c
1a
]
–
[cp
1a
]
–
[m
1a
](ia)
[0272]
或其药学上可接受的盐，
[0273]
其中，各个m
1a
独立地为铜-64或镓-68；
[0274]c1a
为独立地选自下组的螯合部分：
[0275]
[0276][0277]
并且cp
1a
为纤维蛋白结合肽。
[0278]
在式ia的一些实施方式中，各个m
1a
为铜-64。在式ia的一些实施方式中，各个m
1a
为镓-68。
[0279]
在式ia的一些实施方式中，c
1a
为nodaga：
[0280]
在式ia的一些实施方式中，cp
1a
是包含与seq id no:1的多肽具有至少80％序列同一性的序列的纤维蛋白结合肽：
[0281]
–
y*
–
x1–c–
hyp
–
y(3-cl)
–
x2–
l
–c–
x3–i–
x4–
(seq id no:1)
[0282]
其中，x1、x2、x3和x4各自独立地为任何氨基酸；y*为l-酪氨酸或d-酪氨酸。例如，cp
1a
为纤维蛋白结合肽，其包含与seq id no:1的多肽具有至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方式中，cp
1a
为seq id no:1的多肽(即它具有100％的序列同一性)。
[0283]
在一些实施方式中，y*为l-酪氨酸。在一些实施方式中，y*为d-酪氨酸。
[0284]
在一些实施方式中，x1、x2、x3和x4各自独立地选自天然存在的氨基酸。例如，x1、x2、x3和x4各自独立地选自ala、cys、asp、glu、phe、gly、his、ile、lys、leu、met、asn、pro、gln、arg、ser、thr、val、trp和tyr。在一些实施方式中，x1、x2、x3和x4各自独立地选自天然存在的氨基酸的d-构型。例如，x1、x2、x3、x4各自独立地选自d-ala、d-cys、d-asp、d-glu、d-phe、d-his、d-ile、d-lys、d-leu、d-met、d-asn、d-pro、d-gln、d-arg、d-ser、d-thr、d-val、d-trp和d-tyr。在一些实施方式中，x1为glu。在一些实施方式中，x1为d-his。在一些实施方式中，x2为gly。在一些实施方式中，x2为asp。在一些实施方式中，x2为d-asp。在一些实施方式中，x3为his。在一些实施方式中，x3为tyr。在一些实施方式中，x4为gln。在一些实施方式中，x4为d-gln。在一些实施方式中，x4为leu。在一些实施方式中，x4为d-leu。
[0285]
在一些实施方式中，x1、x2、x3和x4各自独立地选自非天然存在的氨基酸。例如，x1、x2、x3和x4各自独立地选自hyp、d-hyp、tyr-3-cl和d-tyr-3-cl。
[0286]
在式ia的一些实施方式中，cp
1a
为包含与选自下组的多肽具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％)序列同一性的多肽的纤维蛋白结合肽：
[0287][0288][0289]
在式ia的一些实施方式中，cp
1a
为与选自下组的多肽具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％)序列同一性的纤维蛋白结合肽：
[0290][0291]
本文还提供了式ib化合物：
[0292]
[m
1b
]
–
[c
1b
]
–
[cp
1b
]
–
[m
1b
](ib)
[0293]
或其药学上可接受的盐，
[0294]
其中，各个m
1b
独立地为铜-64或镓-68；
[0295]c1b
为nodaga：以及
[0296]
cp
1b
为纤维蛋白结合肽。
[0297]
在式ib的一些实施方式中，各个m
1b
为铜-64。在式ib的一些实施方式中，各个m
1b
为镓-68。
[0298]
在式ib的一些实施方式中，cp
1b
是包含与seqidno:1的多肽具有至少80％序列同一性的序列的纤维蛋白结合肽：
[0299]
–
y*
–
x1–c–
hyp
–
y(3-cl)
–
x2–
l
–c–
x3–i–
x4–
(seqidno:1)
[0300]
其中，x1、x2、x3和x4各自独立地为任何氨基酸；y*为l-酪氨酸或d-酪氨酸。例如，
cp
1b
为纤维蛋白结合肽，其包含与seq id no:1的多肽具有至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方式中，cp
1b
为seq id no:1的多肽(即它具有100％的序列同一性)。
[0301]
在一些实施方式中，y*为l-酪氨酸。在一些实施方式中，y*为d-酪氨酸。
[0302]
在一些实施方式中，x1、x2、x3和x4各自独立地选自天然存在的氨基酸。例如，x1、x2、x3和x4各自独立地选自ala、cys、asp、glu、phe、gly、his、ile、lys、leu、met、asn、pro、gln、arg、ser、thr、val、trp和tyr。在一些实施方式中，x1、x2、x3和x4各自独立地选自天然存在的氨基酸的d-构型。例如，x1、x2、x3、x4各自独立地选自d-ala、d-cys、d-asp、d-glu、d-phe、d-his、d-ile、d-lys、d-leu、d-met、d-asn、d-pro、d-gln、d-arg、d-ser、d-thr、d-val、d-trp和d-tyr。在一些实施方式中，x1为glu。在一些实施方式中，x1为d-his。在一些实施方式中，x2为gly。在一些实施方式中，x2为asp。在一些实施方式中，x2为d-asp。在一些实施方式中，x3为his。在一些实施方式中，x3为tyr。在一些实施方式中，x4为gln。在一些实施方式中，x4为d-gln。在一些实施方式中，x4为leu。在一些实施方式中，x4为d-leu。
[0303]
在一些实施方式中，x1、x2、x3和x4各自独立地选自非天然存在的氨基酸。例如，x1、x2、x3和x4各自独立地选自hyp、d-hyp、tyr-3-cl和d-tyr-3-cl。
[0304]
在式ib的一些实施方式中，cp
1b
为包含与选自下组的多肽具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％)序列同一性的多肽的纤维蛋白结合肽：
[0305]
[0306]
在式ib的一些实施方式中，cp
1b
为与选自下组的多肽具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％)序列同一性的纤维蛋白结合肽：
[0307][0308]
本文还提供了式ii化合物：
[0309]
[m2]r–
[c2]s–
[cp2]
–
[r2]
t
(ii)
[0310]
或其药学上可接受的盐，
[0311]
其中，各个m2独立地为铜-64或镓-68；
[0312]
各个c2独立地为螯合部分；
[0313]
cp2为纤维蛋白结合肽；
[0314]
各个r2独立地为有机的非螯合部分；
[0315]
r为选自0-5的整数；
[0316]
s为选自0-5的整数；以及
[0317]
t为选自0-5的整数。
[0318]
在式ii的一些实施方式中，各个m2为铜-64。在式ii的一些实施方式中，各个m2为镓-68。
[0319]
在式ii的一些实施方式中，各个c2独立地选自下组：
no:16的纤维蛋白结合肽(即与seq id no:16具有100％的序列同一性)。
[0327]
在一些实施方式中，y*为l-酪氨酸。在一些实施方式中，y*为d-酪氨酸。
[0328]
在一些实施方式中，x5、x6、x7和x8各自独立地选自天然存在的氨基酸。例如，x5、x6、x7和x8各自独立地选自ala、cys、asp、glu、phe、gly、his、ile、lys、leu、met、asn、pro、gln、arg、ser、thr、val、trp和tyr。在一些实施方式中，x5、x6、x7和x8各自独立地选自天然存在的氨基酸的d-构型。例如，x5、x6、x7、x8各自独立地选自d-ala、d-cys、d-asp、d-glu、d-phe、d-his、d-ile、d-lys、d-leu、d-met、d-asn、d-pro、d-gln、d-arg、d-ser、d-thr、d-val、d-trp和d-tyr。在一些实施方式中，x5为glu。在一些实施方式中，x5为d-his。在一些实施方式中，x6为gly。在一些实施方式中，x6为asp。在一些实施方式中，x6为d-asp。在一些实施方式中，x7为his。在一些实施方式中，x7为tyr。在一些实施方式中，x8为gln。在一些实施方式中，x8为d-gln。在一些实施方式中，x8为leu。在一些实施方式中，x8为d-leu。
[0329]
在一些实施方式中，x5、x6、x7和x8各自独立地选自非天然存在的氨基酸。例如，x5、x6、x7和x8各自独立地选自hyp、d-hyp、tyr-3-cl和d-tyr-3-cl。
[0330]
在式ii的一些实施方式中，cp2为包含与选自下组的多肽具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％)序列同一性的多肽的纤维蛋白结合肽：
[0331][0332]
在式ii的一些实施方式中，cp2为与选自下组的多肽具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％)序列同一性的纤维蛋白
结合肽：
[0333][0334][0335]
在式ii的一些实施方式中，各个r2独立地选自
–
n[(ch2)aora]2、
–
nh(ch2)aora、
–
nh(ch2)aoh、
–
nh(ch2)ch3、
–
n[(ch2)ach3]、
–
nh(cf2)acf3、ora和
[0336]
其中，各个ra独立地为(c
1-c6)烷基；以及
[0337]
a为选自0-5的整数。
[0338]
在一些实施方式中，r为1。在一些实施方式中，r为2。在一些实施方式中，s为1。在一些实施方式中，s为2。在一些实施方式中，t为1。在一些实施方式中，t为2。在一些实施方式中，r、s和t各自为1。在一些实施方式中，r、s和t各自为2。
[0339]
本文还提供了式iii化合物：
[0340]
[r3]u–
[cp3]
–
[c3]v–
[m3]w(iii)
[0341]
或其药学上可接受的盐，
[0342]
其中，各个m3独立地为铜-64或镓-68；
[0343]
各个c3为螯合部分；
[0344]
cp3为纤维蛋白结合肽；
[0345]
各个r3独立地为有机的非螯合部分；
[0346]
u为选自0-5的整数；
[0347]
v为选自0-5的整数；以及
[0348]
w为选自0-5的整数。
[0349]
在式iii的一些实施方式中，各个m3为铜-64。在式iii的一些实施方式中，各个m3为镓-68。
[0350]
在式iii的一些实施方式中，各个c3独立地选自下组：
[0351][0352]
在式iii的一些实施方式中，c3为nodaga：
[0353]
在式iii的一些实施方式中，各个c3独立地选自下组：
[0354]
[0355][0356]
在式iii的一些实施方式中，cp3是包含与seq id no:17的多肽具有至少80％序列同一性的序列的纤维蛋白结合肽：
[0357]
–
y*
–
x9–c–
hyp
–
y(3-cl)
–
x
10
–
l
–c–
x
11
–i–
x
12
–
(seq id no:17)
[0358]
其中，x9、x
10
、x
11
和x
12
各自独立地为任何氨基酸；y*为l-酪氨酸或d-酪氨酸。例如，cp3为纤维蛋白结合肽，其包含与seq id no:17的多肽具有至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方式中，cp3为seq id no:17的纤维蛋白结合肽(即与seq id no:17具有100％的序列同一性)。
[0359]
在一些实施方式中，y*为l-酪氨酸。在一些实施方式中，y*为d-酪氨酸。
[0360]
在一些实施方式中，x9、x
10
、x
11
和x
12
各自独立地选自天然存在的氨基酸。例如，x9、x
10
、x
11
和x
12
各自独立地选自ala、cys、asp、glu、phe、gly、his、ile、lys、leu、met、asn、pro、gln、arg、ser、thr、val、trp和tyr。在一些实施方式中，x9、x
10
、x
11
和x
12
各自独立地选自天然存在的氨基酸的d-构型。例如，x9、x
10
、x
11
和x
12
各自独立地选自d-ala、d-cys、d-asp、d-glu、d-phe、d-his、d-ile、d-lys、d-leu、d-met、d-asn、d-pro、d-gln、d-arg、d-ser、d-thr、d-val、d-trp和d-tyr。在一些实施方式中，x9为glu。在一些实施方式中，x9为d-his。在一些实施方式中，x
10
为gly。在一些实施方式中，x
10
为asp。在一些实施方式中，x
10
为d-asp。在一些实施方式中，x
11
为his。在一些实施方式中，x
11
为tyr。在一些实施方式中，x
12
为gln。在一些实施方式中，x
12
为d-gln。在一些实施方式中，x
12
为leu。在一些实施方式中，x
12
为d-leu。
[0361]
在一些实施方式中，x9、x
10
、x
11
和x
12
各自独立地选自非天然存在的氨基酸。例如，x9、x
10
、x
11
和x
12
各自独立地选自hyp、d-hyp、tyr-3-cl和d-tyr-3-cl。
[0362]
在式iii的一些实施方式中，cp3为包含与选自下组的多肽具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％)序列同一性的多肽的纤维蛋白结合肽：
[0363][0364]
在式iii的一些实施方式中，cp3为与选自下组的多肽具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％)序列同一性的纤维蛋白结合肽：
[0365]
[0366][0367]
在式iii的一些实施方式中，各个r3独立地选自
–
n[(ch2)borb]2、
–
nh(ch2)borb、
–
nh(ch2)boh、
–
nh(ch2)ch3、
–
n[(ch2)bch3]、
–
nh(cf2)bcf3、orb和
[0368]
其中，各个rb独立地为(c
1-c6)烷基；以及
[0369]
b为选自0-5的整数。
[0370]
在一些实施方式中，u为1。在一些实施方式中，u为2。在一些实施方式中，v为1。在一些实施方式中，v为2。在一些实施方式中，w为1。在一些实施方式中，w为2。在一些实施方式中，u、v和w各自为1。在一些实施方式中，u、v和w各自为2。
[0371]
本文还提供了式iv化合物：
[0372][0373]
或其药学上可接受的盐，
[0374]
其中，r4为放射性同位素；
[0375]
c4为选自下组的螯合部分：
[0376]
[0377]
[0378]
[0379][0380]
cp4为纤维蛋白结合肽；
[0381]
aa为纤维蛋白结合肽的n末端氨基酸；
[0382]
l4为接头；
[0383]
y为选自0和1的整数；以及
[0384]
z为选自0和1的整数。
[0385]
在式iv的一些实施方式中，r4是选自治疗放射性同位素和能够使用核成像技术检测的放射性同位素的放射性同位素。在一些实施方式中，r4选自氟-18、氟化铝(al
18
f)、钪-43、钪-44、钪-47、锰51、锰52、铜-60、铜-61、铜-62、铜-64、铜-67、镓-67、镓-68、钇-86、锆89、锝-99m、钇-90、铟-111、碘-123、碘-124、碘-125、碘-131、铽-149、铽-152、钐-153、铽-155、铽-161、钬-166、镥-177、铼-188、铅-203、砹-211、铅-212、铋-213、镭-223、锕-225和钍-227。
[0386]
在式iv的一些实施方式中，r4为放射性同位素，其为治疗放射性同位素。在一些实施方式中，治疗放射性同位素选自钪-47、铜-67、钇-90、碘-131、钐-153、铽-161、钬-166、镥-177、铼-188、砹-211、铅-212、铋-213、镭-223、锕-225和钍-227。在一些实施方式中，治疗同位素选自钇-90、镥-177和锕-225。在一些实施方式中，治疗同位素为钇-90。在一些实施方式中，治疗放射性同位素为镥-177。在一些实施方式中，治疗放射性同位素为锕-225。
[0387]
在式iv的一些实施方式中，r4为能够使用核成像技术检测的放射性同位素。在一些实施方式中，放射性同位素为正电子发射同位素。在一些实施方式中，正电子发射同位素选自氟-18、氟化铝(al
18
f)、钪-43、钪-44、锰-51、锰-52、铜-60、铜-61、铜-62、铜-64、镓-68、
钇-86、锆-89、碘-124、铽-149和铽-152。在一些实施方式中，正电子发射同位素选自氟-18、铜-64和镓-68。在一些实施方式中，正电子发射同位素为氟-18。在一些实施方式中，正电子发射同位素为铜-64。在一些实施方式中，正电子发射同位素为镓-68。在一些实施方式中，正电子发射同位素为铜-64。在一些实施方式中，正电子发射同位素为镓-68。在一些实施方式中，放射性同位素为适用于spect成像的放射性同位素。在一些实施方式中，适用于spect成像的放射性同位素选自镓-67、锝-99m、铟-111、碘-123、碘-125、铽-155和铅-203。
[0388]
在式iv的一些实施方式中，c4选自下组：
[0389][0390][0391]
在式iv的一些实施方式中，c4为nodaga：
[0392]
在式iv的一些实施方式中，c4选自下组：
[0393][0394]
在一些实施方式中，c4选自下组：
[0395][0396][0397]
在式iv的一些实施方式中，aa-cp4是包含与seq id no:1的多肽具有至少80％序列同一性的序列的纤维蛋白结合肽：
[0398]
–
y*
–
x1–c–
hyp
–
y(3-cl)
–
x2–
l
–c–
x3–i–
x4–
(seq id no:1)
[0399]
其中，x1、x2、x3和x4各自独立地为任何氨基酸；y*为l-酪氨酸或d-酪氨酸；aa代表n末端氨基酸。例如，aa-cp4为纤维蛋白结合肽，其包含与seq id no:1的多肽具有至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方式中，aa-cp4为seq id no:1的多肽(即它具有100％的序列同一性)。
[0400]
在一些实施方式中，y*为l-酪氨酸。在一些实施方式中，y*为d-酪氨酸。
[0401]
在一些实施方式中，x1、x2、x3和x4各自独立地选自天然存在的氨基酸。例如，x1、x2、x3和x4各自独立地选自ala、cys、asp、glu、phe、gly、his、ile、lys、leu、met、asn、pro、gln、arg、ser、thr、val、trp和tyr。在一些实施方式中，x1、x2、x3和x4各自独立地选自天然存在的氨基酸的d-构型。例如，x1、x2、x3、x4各自独立地选自d-ala、d-cys、d-asp、d-glu、d-phe、d-his、d-ile、d-lys、d-leu、d-met、d-asn、d-pro、d-gln、d-arg、d-ser、d-thr、d-val、d-trp和d-tyr。在一些实施方式中，x1为glu。在一些实施方式中，x1为d-his。在一些实施方式中，x2为gly。在一些实施方式中，x2为asp。在一些实施方式中，x2为d-asp。在一些实施方式中，x3为his。在一些实施方式中，x3为tyr。在一些实施方式中，x4为gln。在一些实施方式中，x4为d-gln。在一些实施方式中，x4为leu。在一些实施方式中，x4为d-leu。
[0402]
在一些实施方式中，x1、x2、x3和x4各自独立地选自非天然存在的氨基酸。例如，x1、x2、x3和x4各自独立地选自hyp、d-hyp、tyr-3-cl和d-tyr-3-cl。
[0403]
在式iv的一些实施方式中，aa-cp4为包含与选自下组的多肽具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％)序列同一性的多肽的纤维蛋白结合肽，其中，aa代表n末端氨基酸：
[0404]
[0405][0406]
在式iv的一些实施方式中，aa-cp4为与选自下组的多肽具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％)序列同一性的纤维蛋白结合肽，其中，aa代表n末端氨基酸：
[0407][0408]
在式iv的一些实施方式中，aa-cp4为与选自下组的多肽具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％)序列同一性的纤维蛋白结合肽，其中，aa代表n末端氨基酸：
[0409]
[0410][0411]
在式iv的一些实施方式中，aa-cp4为与选自下组的多肽具有至少80％(例如至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％)序列同一性的纤维蛋白结合肽，其中，aa代表n末端氨基酸：
[0412][0413]
在式iv的一些实施方式中，[(l4)
z-(aa)]部分代表任选地用接头修饰的纤维蛋白结合肽cp4的n末端氨基酸，其中，aa为纤维蛋白结合肽的n末端氨基酸，l4为任选的接头。接头l4可以是包含可以与氨基酸的n-末端(例如纤维蛋白结合肽cp4的n-末端)形成共价键的官能团的任何化合物。
[0414]
在一些实施方式中，l4选自c
1-c6烷基、6-10元芳基、5-10元杂芳基、c
1-c6烷基-c(o)-、6-10元芳基-c(o)-和5-10元杂芳基-c(o)-。在一些实施方式中，l4为5-6元杂芳基。在一些实施方式中，l4为吡啶基。在一些实施方式中，l4为5-6元杂芳基-c(o)-。在一些实施方式中，l4为(吡啶基)-c(o)-。在一些实施方式中，l4为(吡啶-3-基)-c(o)-。
[0415]
在式iv化合物的一些实施方式中，[(c4)
y-(r4))]部分通过l4基团与[(l4)
z-(aa)]部分结合，其中，螯合部分c4与l4基团结合。在一些实施方式中，[(c4)
y-(r4))]部分通过l4基团与[(l4)
z-(aa)]部分结合，其中，放射性同位素r4与l4基团结合。在一些实施方式中，[(c4)
y-(r4))]部分通过aa基团与[(l4)
z-(aa)]部分结合，其中，放射性同位素r4与aa基团结合。在一些实施方式中，[(c4)
y-(r4))]部分通过aa基团与[(l4)
z-(aa)]部分结合，其中，螯合部分c4与aa基团结合。
[0416]
在式iv的一些实施方式中，y为0。在一些实施方式中，y为1。
[0417]
在式iv的一些实施方式中，z为0。在一些实施方式中，z为1。
[0418]
在式iv的一些实施方式中，y为0且z为0。在一些实施方式中，y为0且z为1。在一些实施方式中，y为1且z为0。在一些实施方式中，y为1且z为1。
[0419]
在一些实施方式中，式iv化合物为式iva化合物：
[0420][0421]
或其药学上可接受的盐，其中，r4是能够被螯合部分c4螯合的放射性同位素。
[0422]
在一些实施方式中，r4选自氟化铝(al
18
f)、钪-43、钪-44、钪-47、锰51、锰52、铜-60、铜-61、铜-62、铜-64、铜-67、镓-67、镓-68、钇-86、锆89、锝-99m、钇-90、铟-111、铽-149、铽-152、钐-153、铽-155、铽-161、钬-166、镥-177、铼-188、铅-203、铅-212、铋-213、镭-223、
锕-225和钍-227。
[0423]
在式iva化合物的一些实施方式中，z为0且[(c4)-(r4)]部分通过螯合部分c4与[aa]部分结合。在一些实施方式中，螯合部分c4与aa基团形成酰胺键。
[0424]
在式iva化合物的一些实施方式中，z为1且[(c4)-(r4)]部分通过l4基团与[(l4)-(aa)]部分结合，其中，螯合部分c4与l4基团结合。
[0425]
在一些实施方式中，式iv化合物为式ivb化合物：
[0426][0427]
或其药学上可接受的盐，其中，r4是能够与接头l4、纤维蛋白结合肽aa的n-末端氨基酸或两者共价结合的放射性同位素。
[0428]
在一些实施方式中，r4选自氟-18、碘-123、碘-124、碘-125、碘-131和砹-211。
[0429]
在式ivb化合物的一些实施方式中，z为0且[r4]部分直接与[aa]部分结合。
[0430]
在式ivb化合物的一些实施方式中，z为1且[r4]部分通过l4基团与[(l4)-(aa)]部分结合。在一些实施方式中，r4部分与l4基团形成共价键。在一些实施方式中，r4为氟-18。
[0431]
在一些实施方式中，式iv化合物为式ivc化合物：
[0432][0433]
或其药学上可接受的盐，其中，[r4]部分通过与l4基团的共价键与[(l4)-(aa)]部分结合，其中，r4为能够与接头l4、纤维蛋白结合肽aa的n-末端氨基酸或两者共价结合的放射性同位素。
[0434]
在一些实施方式中，r4选自氟-18、碘-123、碘-124、碘-125、碘-131和砹-211。在一些实施方式中，r4为氟-18。
[0435]
在一些实施方式中，式iv化合物为式ivd化合物：
[0436][0437]
或其药学上可接受的盐，其中，[r4]部分与[aa]部分直接结合，其中，r4为能够与接头l4、纤维蛋白结合肽aa的n-末端氨基酸或两者共价结合的放射性同位素。
[0438]
在一些实施方式中，r4选自氟-18、碘-123、碘-124、碘-125、碘-131和砹-211。
[0439]
在式iv的一些实施方式中，化合物选自下组：
[0440]
[0441]
[0442][0443]
或其药学上可接受的盐。
[0444]
在式iv的一些实施方式中，化合物选自下组：
[0445]
[0446]
[0447][0448]
或其药学上可接受的盐。
[0449]
在式iv的一些实施方式中，化合物为：
[0450][0451]
或其药学上可接受的盐。
[0452]
在式iv的一些实施方式中，化合物为：
[0453][0454]
或其药学上可接受的盐。
[0455]
在式iv的一些实施方式中，化合物选自下组：
[0456][0457]
以及
[0458][0459]
或其药学上可接受的盐。
[0460]
在式iv的一些实施方式中，化合物选自下组：
[0461]
[0462][0463]
本公开还提供了式v化合物：
[0464][0465]
或其药学上可接受的盐，其中，c4、l4、aa、cp4、y和z参照本公开对式iv化合物的描述。
[0466]
在一些实施方式中，式v化合物是选自下组的化合物：
[0467]
[0468][0469]
药学上可接受的衍生物和组合物
[0470]
在一些实施方式中，本公开的化合物可以配制成药物组合物。在一些实施方式中，药物组合物包含式i化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的赋形剂。在一些实施方式中，药物组合物包含式ii化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的赋形剂。在一些实施方式中，药物组合物包含式iii化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的赋形剂。在一些实施方式中，药物组合物包含式iv化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的赋形剂。
[0471]
如本文所用，化合物可以包括其药学上可接受的衍生物。“药学上可接受的”是指化合物或组合物可以施用于动物而没有不可接受的副作用。“药学上可接受的衍生物”是指本公开的化合物的任何药学上可接受的盐、酯或酯的盐，其在对接受者施用时能够(直接或间接地)提供化合物或活性代谢物或其残留物。
[0472]
其他衍生物是当将这些化合物施用于哺乳动物时增加化合物的生物利用度的那些(例如通过使口服施用的化合物更容易吸收到血液中)或增强母体化合物向生物隔室的递送(例如大脑或淋巴系统)而相对于母体物质增加暴露的那些。
[0473]
本公开的化合物的药学上可接受的盐包括衍生自本领域已知的药学上可接受的无机和有机酸和碱的抗衡离子。例如，碱金属和碱土金属阳离子；钠；诸如乙醇胺、二乙醇胺、吗啉、葡糖胺、n，n-二甲基葡糖胺、n-甲基葡糖胺等伯胺、仲胺和叔胺；以及诸如赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸等氨基酸。
[0474]
诸如粘合剂、填充剂、可接受的润湿剂、压片润滑剂和崩解剂等常规赋形剂可以用于口服施用的片剂和胶囊剂中。用于口服施用的液体制剂可以是溶液、乳液、水性或油性混悬剂和糖浆剂的形式。或者，口服制剂可以是干粉形式，在使用前可以用水或另一种合适的液体载体重构。诸如悬浮剂或乳化剂、非水载体(包括食用油)、防腐剂、调味剂和着色剂等额外的添加剂可以添加到液体制剂中。肠胃外剂型可以通过在合适的液体载体中溶解式i、ii、iii或iv的化合物或其药学上可接受的盐并在填充和密封合适的小瓶或安瓿之前对溶液进行过滤灭菌来制备。这些只是本领域众所周知的用于制备剂型的许多适当方法的几个示例。
[0475]
可以使用本领域技术人员熟知的技术将式i、ii、iii或iv的化合物或其药学上可
接受的盐配制成药物组合物。除了本文提及的那些之外，合适的药学上可接受的载体是本领域已知的；例如，参见《雷明顿药物科学与实践》(remington,the science and practice of pharmacy)，第20版，2000，lippincott williams&wilkins,(作者：gennaro,a.r等人)。
[0476]
本文所述的药物组合物可以通过任何途径施用，包括口服和肠胃外施用。肠胃外施用包括但不限于皮下、静脉内、动脉内、间质、鞘内和腔内施用。当静脉内施用时，药物组合物可以推注、作为两个或更多个在时间上分开的闭合物、或作为恒定或非线性流动输注给予。因此，本公开的组合物可以配制用于任何施用途径。
[0477]
在一些实施方式中，用于静脉内施用的药物组合物为无菌等渗水性缓冲液中的溶液。在一些实施方式中，组合物还可以包括一种或多种增溶剂、稳定剂和用于减轻注射部位的疼痛的局部麻醉剂(例如利多卡因)。在一些实施方式中，用于静脉内施用的组合物包括蔗糖(例如80毫摩尔)。在一些实施方式中，这些成分将单独提供(例如在试剂盒中)或者在单位剂型中混合在一起(例如作为干燥的冻干粉末或无水浓缩物)。组合物可以储存在诸如例如安瓿或小袋等密封容器中，以活性单位表示活性剂的量。当组合物通过输注施用时，它可以用含有无菌药用级“注射用水”、生理盐水或其他合适的静脉输液的输液瓶进行分配。在通过注射施用组合物的情况下，可以提供一安瓿的无菌注射用水或盐水作为试剂盒的组分，从而可以在施用前混合成分。
[0478]
含有式i、ii、iii或iv的化合物或其药学上可接受的盐的本公开的药物组合物可以进一步含有一种或多种其他成分。此类成分的示例包括但不限于ph调节剂、稳定剂、去污剂和等渗剂。在一些实施方式中，药物组合物含有乙酸、乙酸钠、氢氧化钠、龙胆酸、抗坏血酸、二亚乙基三胺五乙酸(dpta)和氯化钠中的一种或多种。在一些实施方式中，药物组合物含有注射用水。
[0479]
在一些实施方式中，包含式i、ii、iii或iv的化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的赋形剂的药物组合物包含自由基清除剂。自由基清除剂可以用于防止辐射分解。辐射分解是由放射性核素诱导的氧或水分子的电离而形成诸如超氧化物、过氧化氢、氢自由基、臭氧和羟基自由基等其他活性物质的过程。这些活性物质会进一步对dna和其他细胞结构造成损害。在一些实施方式中，自由基清除剂为选自鼠尾草酸、绿茶提取物、芹菜素、地奥思明、迷迭香酸、硫辛酸、β-胡萝卜素、l-抗坏血酸(维生素c)、n-乙酰半胱氨酸(nac)、δ-生育酚、芦丁、氨磷汀、白藜芦醇、龙胆酸和没食子酸的抗氧化剂。在一些实施方式中，自由基清除剂为选自没食子酸、l-抗坏血酸和n-乙酰半胱氨酸(nac)的抗氧化剂。
[0480]
在一些实施方式中，本公开的组合物以可注射组合物的形式施用于患者。在一些实施方式中，施用化合物的方法为肠胃外，也就是静脉内、动脉内、鞘内、间质或腔内。本发明的药物组合物可以以类似于其他诊断或治疗剂的方式施用于包括人在内的动物。施用剂量和施用方式将取决于多种因素，包括年龄、体重、性别、患者状况和遗传因素，最终由医务人员在实验确定不同剂量后决定如本文所述的成像。
[0481]
纤维蛋白的成像方法
[0482]
本公开的化合物和组合物可以用于纤维蛋白成像。在一些实施方式中，纤维蛋白存在于肿瘤中。在一些实施方式中，肿瘤是癌性的。在一些实施方式中，纤维蛋白存在于血栓中。在一些实施方式中，纤维蛋白与神经炎症有关。在一些实施方式中，神经炎症与阿尔茨海默病、多发性硬化症或外伤性脑损伤有关。
[0483]
在一些实施方式中，对哺乳动物中的纤维蛋白进行成像的方法包括向哺乳动物施用有效量的式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐；使用核成像技术获取哺乳动物纤维蛋白的图像并使用磁共振成像(mri)获取哺乳动物的解剖图像；以及叠加所述图像以在哺乳动物的解剖图像内定位纤维蛋白。
[0484]
在一些实施方式中，对哺乳动物中的纤维蛋白进行成像的方法包括向哺乳动物施用有效量的式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的赋形剂的药物组合物；使用核成像技术获取哺乳动物纤维蛋白的图像并使用磁共振成像获取哺乳动物的解剖图像；以及叠加所述图像以在哺乳动物的解剖图像内定位纤维蛋白。
[0485]
在纤维蛋白的成像方法的一些实施方式中，同时采集使用核成像技术的哺乳动物的纤维蛋白图像和使用磁共振成像的哺乳动物的图像。在纤维蛋白的成像方法的一些实施方式中，首先采集使用核成像技术的哺乳动物的纤维蛋白图像，之后采集使用磁共振成像的哺乳动物的图像。在纤维蛋白的成像方法的一些实施方式中，首先采集使用磁共振成像的哺乳动物的图像，之后采集使用核成像技术的哺乳动物的纤维蛋白图像。
[0486]
在纤维蛋白的成像方法的一些实施方式中，核成像技术为单光子发射计算机断层扫描(spect)。
[0487]
在纤维蛋白的成像方法的一些实施方式中，核成像技术为正电子发射断层扫描(pet)。在纤维蛋白的成像方法的一些实施方式中，核成像技术为正电子发射断层扫描与计算机断层扫描的组合(pet-ct)。
[0488]
在纤维蛋白的成像方法的一些实施方式中，哺乳动物为人。在纤维蛋白的成像方法的一些实施方式中，哺乳动物为大鼠。在纤维蛋白的成像方法的一些实施方式中，哺乳动物为狗。
[0489]
在纤维蛋白的成像方法的一些实施方式中，该方法还包括向哺乳动物施用有效量的第二化合物或组合物。在一些实施方式中，第二化合物或组合物不针对纤维蛋白。
[0490]
在一些实施方式中，第二化合物或含有第二化合物的组合物为第二显像剂。在一些实施方式中，第二显像剂包含mri显像剂。在一些实施方式中，第二显像剂为mri显像剂，例如，钆特醇、钆喷酸、钆苯酸、钆塞酸、钆二胺、钆维塞胺和钆磷维塞；或ct显像剂，其选自碘帕醇、碘海醇、碘昔兰、碘普罗胺、碘克沙醇、碘克沙酸盐(ioxaglate)、甲泛影酸盐(metrizoate)和泛影酸盐。
[0491]
在一些实施方式中，第二化合物或含有第二化合物的组合物含有治疗放射性同位素。在一些实施方式中，治疗放射性同位素选自钪-47、铜-67、钇-90、碘-131、钐-153、铽-161、钬-166、镥-177、铼-188、砹-211、铅-212、铋-213、镭-223、锕-225和钍-227。在一些实施方式中，治疗同位素选自钇-90、镥-177和锕-225。在一些实施方式中，治疗同位素为钇-90。在一些实施方式中，治疗同位素为镥-177。在一些实施方式中，治疗同位素为锕-225。
[0492]
图像叠加
[0493]
可以通过本领域已知的各种方式来完成图像的叠加。例如，参见美国专利第7,412,279；7,110616；6,898,331；6,549,798；以及5,672,877号；rudd,j.hf.等人,j.nucl.med.2008 49(6):871-878；slomka,p.j.等人,j.nucl.med.2009 50:1621-1630；以及jupp,b.和o’brien,t.j.,epilepsia 2007 49:82-89。在一些实施方式中，可以重叠第一和第二图像数据集以确定哺乳动物体内纤维蛋白的存在。例如，可以组合第一和第二图像
数据集以产生第三数据集，其包括纤维蛋白靶标的图像和纤维蛋白所在的解剖区域的图像。第三组数据能够指示哺乳动物体内纤维蛋白(若存在)的位置。若需要，可以在显示设备上显示第三数据集，以指示固定靶标在脉管系统内的位置。第三数据集还可以指示哺乳动物体内固定靶标的大小。
[0494]
治疗方法
[0495]
本公开还提供了用于治疗与纤维蛋白的存在有关的疾病或病症的方法。在一些实施方式中，与纤维蛋白的存在有关的疾病或病症为心血管疾病。在一些实施方式中，与纤维蛋白的存在有关的疾病或病症为癌症。
[0496]
在一些实施方式中，用于治疗与哺乳动物中纤维蛋白的存在有关的疾病或病症的方法包括向哺乳动物施用有效量的式i、式ii、式iii或式iv化合物或药学上可接受的其盐、或含有有效量的式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物，其中，化合物或药物组合物含有治疗放射性同位素。在一些实施方式中，用于治疗与哺乳动物中纤维蛋白的存在有关的疾病或病症的方法包括向哺乳动物施用包含式i化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物，其中，化合物含有治疗放射性同位素。在一些实施方式中，用于治疗与哺乳动物中纤维蛋白的存在有关的疾病或病症的方法包括向哺乳动物施用包含式ii化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物，其中，化合物含有治疗放射性同位素。在一些实施方式中，用于治疗与哺乳动物中纤维蛋白的存在有关的疾病或病症的方法包括向哺乳动物施用包含式iii化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物，其中，化合物含有治疗放射性同位素。在一些实施方式中，用于治疗与哺乳动物中纤维蛋白的存在有关的疾病或病症的方法包括向哺乳动物施用包含式iv化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物，其中，化合物含有治疗放射性同位素。在一些实施方式中，与纤维蛋白的存在有关的疾病或病症为心血管疾病或病症。在一些实施方式中，与纤维蛋白的存在有关的疾病或病症为癌症。在一些实施方式中，与纤维蛋白的存在有关的疾病或病症为脑血管疾病(例如脑动脉瘤、颈动脉狭窄、椎管狭窄和中风)。在一些实施方式中，哺乳动物为大鼠、小鼠、狗或猪。在一些实施方式中，哺乳动物为人。
[0497]
本发明还提供了一种治疗哺乳动物中的癌症的方法。在一些实施方式中，该方法包括向哺乳动物施用有效量的式i、式ii、式iii或式iv化合物或药学上可接受的其盐、或含有有效量的式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物，其中，化合物或药物组合物含有治疗放射性同位素。在一些实施方式中，用于治疗哺乳动物中的癌症的方法包括向哺乳动物施用包含式i化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物，其中，化合物含有治疗放射性同位素。在一些实施方式中，用于治疗哺乳动物中的癌症的方法包括向哺乳动物施用包含式ii化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物，其中，化合物含有治疗放射性同位素。在一些实施方式中，用于治疗哺乳动物中的癌症的方法包括向哺乳动物施用包含式iii化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物，其中，化合物含有治疗放射性同位素。在一些实施方式中，用于治疗哺乳动物中的癌症的方法包括向哺乳动物施用包含式iv化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物，其中，化合物含有治疗放射性同位素。
[0498]
可以使用本公开的化合物治疗的癌症的示例包括但不限于肉瘤、骨癌、乳腺癌、肺癌(例如非小细胞肺癌和小细胞肺癌)、泌尿生殖道癌、胰腺癌、肝癌、皮肤癌、黑色素瘤(例
如转移性恶性黑色素瘤、braf和hsp90抑制性黑色素瘤)、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、癌症肛门癌、胃癌、肾癌(例如透明细胞癌)、前列腺癌(例如激素难治性前列腺腺癌)、睾丸癌、结肠癌、妇科癌、子宫癌、输卵管癌、尿路上皮癌(例如，膀胱)、子宫内膜的癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、子宫癌食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病，包括急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或尿道癌、肾盂癌、神经系统癌、中枢神经系统(cns)肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、t细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括由石棉诱发的癌症)以及所述癌症的组合。本公开的化合物也可以用于治疗转移性癌症。
[0499]
在一些实施方式中，可以使用本公开的化合物治疗的癌症包括但不限于实体瘤(例如前列腺癌、结肠癌、食道癌、子宫内膜癌、卵巢癌、子宫癌、肾癌、肝癌癌症、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、头颈癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、肉瘤、膀胱癌)、血液系统癌症(例如淋巴瘤、白血病如急性淋巴细胞白血病(all)、急性髓性白血病(aml)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、慢性髓性白血病(cml)、dlbcl、套细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(包括滤泡性淋巴瘤，包括复发性或难治性nhl和复发性滤泡性淋巴瘤)、霍奇金淋巴瘤或多发性骨髓瘤)以及所述癌症的组合。
[0500]
在一些实施方式中，可以使用本公开的化合物治疗的癌症包括但不限于胆管癌、胆管癌、三阴性乳腺癌、横纹肌肉瘤、小细胞肺癌、平滑肌肉瘤、肝细胞癌、尤文氏肉瘤、脑癌症、脑肿瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤、神经纤维瘤、基底细胞癌、软骨肉瘤、上皮样肉瘤、眼癌、输卵管癌、胃肠道癌、胃肠道间质瘤、毛细胞白血病、肠癌、胰岛细胞癌、口腔癌、口腔癌、喉癌、喉癌、唇癌、间皮瘤、颈癌、鼻腔癌、眼癌、眼黑色素瘤、盆腔癌、直肠癌、肾细胞癌、唾液腺癌、鼻窦癌、脊柱癌、舌癌、肾小管癌、尿道癌和输尿管癌。
[0501]
示例性的血液癌症包括淋巴瘤和白血病，例如急性淋巴细胞白血病(all)、急性髓细胞白血病(aml)、急性早幼粒细胞白血病(apl)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、慢性髓细胞白血病(cml)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、套细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(包括复发性或难治性nhl和复发性滤泡性淋巴瘤)、霍奇金淋巴瘤、骨髓增殖性疾病(例如原发性骨髓纤维化(pmf)、真性红细胞增多症(pv)和原发性血小板增多症(et))、骨髓增生异常综合征(mds)、t细胞急性淋巴细胞淋巴瘤(t-all)和多发性骨髓瘤(mm)。
[0502]
示例性的肉瘤包括软骨肉瘤、尤文肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、血管肉瘤、纤维肉瘤、脂肪肉瘤、粘液瘤、横纹肌瘤、横纹肉瘤、纤维瘤、脂肪瘤、肉瘤和畸胎瘤。
[0503]
示例性的肺癌包括非小细胞肺癌(nsclc)、小细胞肺癌(sclc)、支气管癌、鳞状细胞癌、未分化小细胞癌、未分化大细胞癌、腺癌、肺泡(细支气管)癌、支气管腺瘤、软骨错构瘤和间皮瘤。
[0504]
示例性的胃肠癌包括食道癌(鳞状细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃癌(癌、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胰腺癌(导管腺癌、胰岛素瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、类癌瘤、血管瘤)、小肠癌(腺癌)、淋巴瘤、类癌、卡波西肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤、纤维瘤)、大肠癌(腺癌、管状腺瘤、绒毛状腺瘤、错构瘤、平滑肌瘤)和结直肠癌。
[0505]
示例性的泌尿生殖道癌症包括肾癌(腺癌、威尔姆氏瘤[肾母细胞瘤])、膀胱癌和尿道癌(鳞状细胞癌、移行细胞癌、腺癌)、前列腺癌(腺癌、肉瘤)和睾丸癌(精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎癌)、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、间质细胞癌、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样肿瘤、脂肪瘤)。
[0506]
示例性的肝癌包括肝癌(肝细胞癌)、胆管癌、肝母细胞瘤、血管肉瘤、肝细胞腺瘤和血管瘤。
[0507]
示例性的骨癌例如包括成骨肉瘤(骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞瘤脊索瘤、骨软骨瘤(骨软骨外生骨瘤)、良性软骨瘤、软骨母细胞瘤、软骨粘液纤维瘤、骨样骨瘤和巨细胞瘤。
[0508]
示例性的神经系统癌症包括颅骨癌(骨瘤、血管瘤、肉芽肿、黄色瘤、变形性骨炎)、脑膜癌(脑膜瘤、脑膜肉瘤、胶质瘤病)、脑癌(星形细胞瘤、髓母细胞瘤、胶质瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤(松果体瘤)、胶质母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、少突胶质细胞瘤、神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤、先天性肿瘤)和脊髓(神经纤维瘤、脑膜瘤、胶质瘤、肉瘤)、以及神经母细胞瘤和lhermitte-duclos病。
[0509]
示例性的妇科癌症包括子宫癌(子宫内膜癌)、宫颈癌(宫颈癌、瘤前宫颈发育不良)、卵巢癌(卵巢癌(浆液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、未分类癌)、颗粒-鞘细胞瘤、sertoli-leydig细胞肿瘤、无性细胞瘤、恶性畸胎瘤)、外阴(鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑色素瘤)、阴道(透明细胞癌、鳞状细胞癌、葡萄状肉瘤(胚胎性横纹肌肉瘤)和输卵管(癌)。
[0510]
示例性皮肤癌包括黑素瘤、基底细胞癌、默克尔细胞癌、鳞状细胞癌、卡波西肉瘤、痣发育不良痣、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤和瘢痕疙瘩。在一些实施方式中，可以使用本公开的化合物治疗的疾病和适应症包括但不限于镰状细胞病(例如镰状细胞性贫血)、三阴性乳腺癌(tnbc)、骨髓增生异常综合征、睾丸癌、胆管癌、食道癌和尿路上皮癌。
[0511]
在一些实施方式中，本公开的方法用于检测、治疗或检测和治疗表现出高纤维蛋白水平的癌症。
[0512]
在本公开的治疗方法的一些实施方式中，式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐、或含有有效量的式i、式ii、式iii或式iv化合物的药物组合物或其药学上可接受的盐，其中，化合物或药物组合物含有治疗放射性同位素，该方法进一步包括向患者施用氨基酸溶液。在一些实施方式中，氨基酸溶液用于预防与放射性核素疗法有关的肾毒性。在一些实施方式中，氨基酸溶液包含l-赖氨酸、l-精氨酸及其药学上可接受的盐和组合。在一些实施方式中，氨基酸溶液包含l-赖氨酸及其药学上可接受的盐。在一些实施方式中，氨基酸溶液包含l-精氨酸及其药学上可接受的盐。在一些实施方式中，氨基酸溶液包含约10g/l-约40g/l的l-赖氨酸hcl和l-精氨酸hcl的混合物，例如约12g/l-约35g/l、约16g/l-约32g/l、约20g/l-约30g/l、或约22g/l-约28g/l。在一些实施方式中，氨基酸溶液包含约16g/l-约32g/l的l-赖氨酸hcl和l-精氨酸hcl的混合物。在一些实施方式中，氨基酸溶液包含约8g/l-约16g/l的l-赖氨酸hcl和约8g/l-约16g/l的l-精氨酸hcl。在一些实施方式中，氨基酸溶液包含约8g/l、约9g/l、约10g/l、约11g/l、约12g/l、约13g/l、约14g/l、约15g/l或约16g/l的l-赖氨酸hcl。在一些实施方式中，氨基酸溶液包含约8g/l、约9g/l、约10g/l、约
11g/l、约12g/l、约13g/l、约14g/l、约15g/l或约16g/l的l-精氨酸hcl。
[0513]
在一些实施方式中，氨基酸溶液为静脉内施用。在一些实施方式中，在施用式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐或含有有效量的式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物之前、同时、之后施用氨基酸溶液或其组合，其中，化合物或药物组合物含有治疗放射性同位素。
[0514]
在一些实施方式中，在施用式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐或含有有效量的式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物之前施用氨基酸溶液。在一些实施方式中，在施用式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐或含有有效量的式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物的约5分钟-约60分钟之前施用氨基酸溶液，例如在约10分钟、约15分钟、约20分钟，约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟或约60分钟之前。在一些实施方式中，在施用式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐或含有有效量的式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物的约30分钟之前施用氨基酸溶液。
[0515]
在一些实施方式中，在施用式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐或含有有效量的式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物的同时施用氨基酸溶液。在一些实施方式中，将氨基酸溶液与式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐或含有有效量的式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物共同输注。
[0516]
在一些实施方式中，在施用式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐或含有有效量的式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物之后施用氨基酸溶液。在一些实施方式中，在施用式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐或含有有效量的式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物之后立即或约5分钟-约60分钟之后施用氨基酸溶液，例如在约10分钟、约15分钟、约20分钟，约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟或约60分钟之后。在一些实施方式中，在施用式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐或含有有效量的式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物的约30分钟之后施用氨基酸溶液。
[0517]
在一些实施方式中，在施用式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐或含有有效量的式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物之前、同时、之后施用氨基酸溶液，其中，化合物或药物组合物含有治疗放射性同位素。
[0518]
在一些实施方式中，在施用式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐或含有有效量的式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物之前和同时施用氨基酸溶液，其中，化合物或药物组合物含有治疗放射性同位素。
[0519]
在一些实施方式中，在施用式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐或含有有效量的式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物之前和之后施用氨基酸溶液，其中，化合物或药物组合物含有治疗放射性同位素。
[0520]
在一些实施方式中，在施用式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐或含有有效量的式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物的同
时和之后施用氨基酸溶液，其中，化合物或药物组合物含有治疗放射性同位素。
[0521]
在本公开的治疗方法的一些实施方式中，式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐、或含有有效量的式i、式ii、式iii或式iv化合物的药物组合物或其药学上可接受的盐，其中，化合物或药物组合物含有治疗放射性同位素，该方法进一步包括向患者施用止吐剂。止吐剂可用于减少与放疗有关的恶心和呕吐。在一些实施方式中，止吐剂选自5-ht3受体拮抗剂、皮质类固醇、神经激肽-1(nk-1)受体抑制剂、丙氯拉嗪、甲氧氯普胺和大麻素。在一些实施方式中，止吐剂为5-ht3受体拮抗剂。在一些实施方式中，止吐剂为nk-1受体抑制剂。
[0522]
在一些实施方式中，在施用式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐或含有有效量的式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物之前、同时、之后施用止吐剂或其组合，其中，化合物或药物组合物含有治疗放射性同位素。在一些实施方式中，在施用式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐或含有有效量的式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物之前施用止吐剂。在一些实施方式中，在施用式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐或含有有效量的式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物的同时施用止吐剂。在一些实施方式中，在施用式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐或含有有效量的式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物之后施用止吐剂。
[0523]
在一些实施方式中，在施用诸如本公开中描述的氨基酸溶液等氨基酸溶液之前、同时、之后施用止吐剂或其组合。在一些实施方式中，在施用氨基酸溶液之前施用止吐剂。在一些实施方式中，在氨基酸溶液的同时施用止吐剂。在一些实施方式中，在施用氨基酸溶液之后施用止吐剂。本公开还提供了检测和治疗与哺乳动物中纤维蛋白的存在有关的疾病或病症的方法。在一些实施方式中，该方法包括使用本公开中描述的使用式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐、或含有有效量的式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物的方法检测与哺乳动物中纤维蛋白的存在有关的疾病或病症，其中，化合物或药物组合物含有能够使用核成像技术检测的放射性同位素。在一些实施方式中，该方法还包括使用本公开中描述的使用式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐、或含有有效量的式i、式ii、式iii或式iv化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物的方法治疗与哺乳动物中纤维蛋白的存在有关的疾病或病症，其中，化合物或药物组合物含有治疗放射性同位素。在一些实施方式中，与纤维蛋白的存在有关的疾病或病症为癌症。
实施例
[0524]
以下通过实施例进一步说明本发明，这些实施例对于权利要求书描述的本发明范围不构成约束。
[0525]
实施例1：化合物的合成和表征
[0526]
步骤a
–
未修饰肽的合成
[0527]
在自动肽合成仪“libertyblue”(cem公司)上使用1到12个装有0.1mmol市售rink酰胺树脂(～0.38mmol/g)的间歇反应器合成肽。标准fmoc化学用于延长树脂上的肽。用
20％哌啶和0.1mhobt的dmf溶液除去fmoc。将各种氨基酸溶解在dmf中得到0.2m溶液，并使用0.5m二异丙基碳二亚胺的dmf溶液和1.0m oxyma(或hobt)使其与肽偶联。
[0528]
在树脂上完成肽的合成后，将肽过滤并随后从树脂上裂解(tfa/tis/msa/2,2-(乙二氧基)乙烷二硫醇/h2o 95:2.5:2.5:2.5:2.5)。用乙醚(40ml)沉淀完全去保护的肽溶液。离心后分离肽固体，之后在dmso/40mm nh4oac、ph5的1:1混合物中环化。通过lc-ms(24小时)监测环化。通过反相制备型hplc在c-5柱上使用5％流动相a(0.1％tfa水溶液)至60％流动相b(0.1％tfa乙腈溶液)的梯度在23分钟内纯化环肽。合并纯肽级分并冻干，得到最终的肽部分。
[0529]
步骤b
–
n-末端修饰肽的合成
[0530]
之后，将各个肽的n-末端修改为：制备的化合物(例如n-末端修饰的肽)参见表1和1a，其中，f为氟(表1)或氟-18(表1a)。除非另有说明，否则所有化合物都具有c-末端酰胺。
[0531]
表1.
[0532]
[0533][0534]
表1a.
[0535]
[0536][0537][0538]
实施例2：pfp肽的合成
[0539]
根据实施例1步骤a中的程序制备未修饰的肽。在40℃下过夜，在dmf(0.50ml)中将6-氟烟酸-pfp(0.10mmol)偶联至肽(0.02mmol)的n-末端。用lcms对反应进行监测。获得的粗化合物通过反相制备型hplcc-5柱(22.5
×
250mm)使用5％流动相a(0.1％tfa的水溶液)到60％流动相b(0.1％tfa的乙腈溶液)的梯度纯化超过23分钟，并将合并的级分冻干以获得纯化合物。
[0540]
实施例3：使用荧光偏振(fp)测定法测定与固定化纤维蛋白和可溶性纤维蛋白片段dd(e)的结合
[0541]
dd(e)使用公开的方法制备，其涉及纯化的纤维蛋白凝胶的部分纤溶酶消化，之后为尺寸排阻色谱纯化，并通过sds-page评估纯度。在n-末端用四甲基罗丹明(tritc)染料修饰的肽与dd(e)结合。通过荧光偏振(fp)测定法测量与dd(e)直接结合的荧光肽。在化合物浓度固定的tris缓冲盐水(50mm tris、100mm nacl和2mm cacl2)中测量与dd(e)(0-20μm)结合的荧光标记肽的各向异性(r
obs
)，数据拟合成单点模型(方程1)，以获得dd(e)
·
(荧光肽)复合物的解离常数(kd)。
[0542][0543]
测量非荧光化合物对荧光肽的置换，以确定抑制常数(ki)。在抑制剂存在的情况下，荧光化合物的表观解离常数(k
d app)使用方程2确定。抑制常数ki与k
d app为方程2的关系，其中，kd为在没有抑制剂的情况下测量的荧光化合物的真实解离常数。
[0544][0545]
未标记的肽与dd(e)的结合通过化合物置换测定来测量，其中，在浓度固定的dd(e)和fl
·
pep下形成的dd(e)/fl
·
pep复合物随着未标记化合物浓度的增加而滴定。通过将dd(e)(4.0μm,10μl)和tritc(0.1μm,10μl)与浓度增加的竞争肽(0.4-100μm,20μl)在tbs
·
ca中与2％dmso混合来测定该化合物。使用配备有荧光偏振滤光片、535nm激发滤光片的tecaninfinite200pro荧光酶标仪和590nm荧光发射滤光片在384孔微孔板(康宁黑色平板)中测量浓度递增的样品(10μl，一式三份孔)的荧光偏振。使用方程3将目标化合物的各个稀释度的平均极化(mp单位)读数转换为各向异性(r)。
[0546][0547]
数据定义了一条位移曲线(r
obs
相对于[肽])，而抑制结合常数ki由数据的最小二乘拟合确定(ki±
10％的估计不确定性)。实施例1化合物的ki值参见表2。
[0548]
表2.
95％)进行，流速为1ml/min，使用phenomenex-c18色谱柱(3μm粒径，4.6mm
×
100mm)。
[0555]
结果
[0556]
在2小时时间点，三种化合物的完好无损性超过80％，其中，化合物7和6在4小时后表现出最大的稳定性(图3)。
[0557]
实施例5：优化化合物的f-18放射性标记条件和分析方法的开发
[0558]
6-氯烟酸-2,3,5,6-四氟苯酯(int-1)的合成
[0559]
6-氯烟酸(1.0g，7.1mmol)、四氟苯酚(tfp，1.18g，7.1mmol)在n,n'-二环己基碳二亚胺(dcc)(1.40g，6.81mmol)的存在下在二噁烷(35ml)中在室温下放置12h反应获得6-cl-py-pfp(int-1)酯。滤出二环己基脲(dcu)并除去溶剂以获得粗产物，其在热己烷(1.61g，85％)中结晶。通过1h nmr分析确认化合物的构成。
[0560]
n,n,n-三甲基-5-((2,3,5,6-四氟苯氧基)羰基)吡啶-2-三氟甲磺酸胺(int-2)的合成
[0561]
在室温下使三甲胺气体稳定流通过int-1(1.0g，3.3mmol)在无水thf(15ml)中的混合物3小时。过滤获得的n,n,n-三甲基-5-((2,3,5,6-四氟-苯氧基)羰基)吡啶-2-氯化铵，之后用乙醚(100ml)和冷二氯甲烷(50ml)进行洗涤。在氩气氛下将固体(0.53g，1.5mmol)悬浮在dcm(50ml)中。过滤溶液，减压除去挥发性成分。残留物用乙醚(3
×
50ml)洗涤并在真空下干燥，以提供int-2(0.65g，41.6％)。通过1h nmr分析确认化合物的构成。
[0562]
18
f-py-tfp和化合物
18
f-7的放射化学合成
[0563]
通过使含有[
18
f]氟化物的[
18
o]水通过柱体，使得[
18
f]氟化物被捕获在用1ml 1m碳酸钾溶液和20ml水预处理的chromafix ps-hco
3-柱体中。使用0.4ml碳酸钾和222(kry222)的乙腈:水1:1溶液从柱体中洗脱[
18
f]氟化物。[
18
f]氟化物通过在蒸发过程中加入乙腈(0.5ml
×
3次)在氮气流中在105℃下共沸蒸发来干燥。完全干燥后，将含有int-2的dmso溶液(0.3ml)(0.6mg,12.54μmol)加入残留物中并在90℃下加热5分钟。用乙腈:0.1％tfa溶液＝1:1共溶剂将反应溶液稀释，并将其注射入alltima c
18
半制备柱(250mm
×
10mm，5μm)，用0.1％tfa的乙腈溶液:0.1％tfa的水溶液＝64:36进行洗脱，流速为4ml/分钟。
18
f-pfp酯在13.0-13.5分钟之间被洗脱出来，并被收集在c
18 sep-pak plus cartridge中。使用0.9ml乙腈从sep-pak中释放
18
f-pfp酯。将含有tea和肽(0.5mg，0.36μmol)的dmso(0.9ml)添加到反应容器中。将混合物在60℃下加热30分钟。通过用0.9ml水稀释来终止反应。将整个等分试样注射入gemini-nx c
18
半制备色谱柱(250mm
×
10mm，5μm)，用
0.1％tfa的乙腈溶液:0.1％tfa的水溶液＝33:67以4ml/分钟的流速洗脱。化合物
18
f-7在12.0-12.5分钟之间被洗脱出来，并被收集在c
18 sep-pak plus cartridge中。使用1ml乙醇获得产物。
[0564]
结果：
[0565]
f-18放射性标记条件与优化化合物的分析方法一起开发。图4和图5描述了2步放射化学合成、即制备
18
f-py-tfp(图4)和化合物
18
f-7(图5)的放射性hplc迹线(红色)。蓝色迹线代表非放射性纯化合物的uv检测迹线。放射性检测器位于uv检测器之后，因此uv迹线和放射性迹线之间的保留时间存在偏移。
[0566]
实施例6：通过与纤维蛋白原和血浆蛋白的竞争性结合评估特异性
[0567]
开发了一种基于板的测定法来直接测量化合物对纤维蛋白的亲和力。纤维蛋白被固定并测量来自可溶性蛋白质的竞争。在存在或不存在人血浆的情况下测定化合物的纤维蛋白结合。
[0568]
纤维蛋白板制备
[0569]
将人纤维蛋白原(1g)溶解在30ml的tbs缓冲液(50mm tris、150mm nacl、5mm柠檬酸钠，ph7.4)中，并在室温下在slyde-a-lyzer(20000mwco，cassette g2)中透析。两次更换缓冲液后，将纤维蛋白原离心(10分钟，2000
×
g)以除去未溶解的物质。通过测量280nm处的吸光度来确定纤维蛋白原浓度。储备纤维蛋白原溶液浓度为32.1mg/ml。通过在96孔聚苯乙烯微量滴定板的孔中在补充有7mm cacl2的tbs
·
柠檬酸盐中将纤维蛋白原(100μl；2.5mg/ml)与凝血酶(1u/ml)聚合，制备具有交替行凝结纤维蛋白和空孔的纤维蛋白板。未覆盖的板在37℃下干燥过夜，得到薄膜，将其吸附在板上，用胶带密封，并在-20℃下储存直至使用。通过测量凝血酶处理前后溶液可溶部分的280nm吸光度来测定单个纤维蛋白原批次中的可凝结蛋白，其一般≥96％(纤维蛋白浓度，7.56μm)。
[0570]
基于f-18放射性的纤维蛋白亲和力和特异性测定方案
[0571]
将来自化合物
18
f-7的已知活性(52μci，10ml tbs缓冲液溶液)的等分试样(100μl)添加到一系列12个已知浓度(0.01-50μm)的冷化合物7的tbs缓冲液溶液(550μl)中并充分混合以制备12种储备溶液。将各个稀释液(100μl)一式两份添加到凝结的纤维蛋白孔和空孔中。使用人血浆来代替tbs缓冲液并遵循相同的方案。之后，将制备好的板覆盖并在恒定搅拌下在室温下孵育2小时。从各个孔的上清液中小心地将等分试样(90μl)移入称过皮重的试管中。对来自上清液的所有等分试样以及来自各种储备溶液的等分试样(90μl)进行称重，并使用cobra 5002γ计数器测量各个试样的活性。所有数据都经过衰减校正。
[0572]
数据分析
[0573]
使用从空孔、相应的纤维蛋白凝结孔和储备溶液获得的数据，确定[化合物7]
总
和[化合物7]
游离
。[化合物7]
结合
对各个样品的计算如下：
[0574]
[化合物7]
结合
＝[化合物7]
总-[化合物7]
游离
[0575]
使用[化合物7]
结合
和已知[纤维蛋白]
总
，计算[化合物7]
结合
/[纤维蛋白]
总
。活性结合位点(n)和解离常数(kd)通过将[化合物7]
结合
/[纤维蛋白]
总
对[化合物7]
游离
作图来确定。由理论方程，
[0576][0577]
n和kd变量由求解器调整以最小化观察值和理论值之间的绝对误差(图6)。
[0578]
化合物
18
f-7在tbs缓冲液中和在人血浆存在下与人纤维蛋白结合
[0579]
在存在和不存在血浆蛋白的情况下获得的结果的相似性表明化合物
18
f-7对纤维蛋白的结合特异性高于纤维蛋白原(图7)。
[0580]
实施例7：具有
68
ga、
64
cu或al
18
f螯合剂的化合物
[0581]
nodaga螯合剂
[0582]
(
t
bu)3nodaga-nhs酯的合成：将4-(4,7-双(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1-基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸((
t
bu)3nodaga-cooh，100mg，0.19mmol，1.0当量)、n,n,n',n'-四甲基-o-(1h-苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲、o-(苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐(hbtu，122mg，0.3mmol，1.2当量)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs，37.4mg，0.3mmol，1.2当量)溶解在乙腈(10ml)中并在室温下搅拌24小时。减压除去溶剂后，将所得残余物重新溶解在二氯甲烷(10ml)中，之后迅速用水(3
×
4ml)洗涤。有机层经硫酸镁干燥，过滤并蒸发，得到标题产物，其为白色泡沫状物(141mg，0.22mmol，85％)。
[0583]
(
t
bu)3nodaga肽的合成：将(
t
bu)3nodaga-nhs(1.5当量)添加到各个肽(1当量)的二甲基甲酰胺(1ml)溶液中。使用二异丙基乙胺(dipea)将各种溶液的ph调节至6.5，并将混合物在室温下搅拌24小时。用lcms对反应进行监测。反应完成后，(
t
bu)3nodaga肽通过反相制备型hplc在c-5柱(luna，10μ，250
×
21.2mm)上使用5％流动相a(0.1％tfa水溶液)至60％流动相b(0.1％tfa乙腈溶液)的梯度在45分钟内纯化环肽。将纯化的化合物冻干干燥，得到标题产物。
[0584]
化合物16、化合物17、化合物18、化合物19、化合物20和化合物21的合成：在反应容器中，将约10mg的(
t
bu)3nodaga肽在1ml tfa、甲磺酸、1-十二烷硫醇和h2o(92:3:3:2)的溶液中脱保护。将各种反应混合物搅拌2小时并通过lcms进行分析。反应完成后，加入冷乙醚(15ml)以沉淀出固体。将混合物离心，除去上清液。固体用乙醚洗涤并干燥，得到产物，为白色固体。
[0585]
化合物16：c
77h107
cln
16o25
s2,ms(esi)计算：878.3[(m 2h)/2]
2
；实测：878.4.
[0586]
化合物17：c
77h107
cln
16o25
s2,ms(esi)计算：878.3[(m 2h)/2]
2
；实测：878.5.
[0587]
化合物18：c
74h105
cln
18o24
s2,ms(esi)计算：866.2[(m 2h)/2]
2
；实测：866.1.
[0588]
化合物19：c
74h105
cln
18o24
s2,ms(esi)计算：866.1[(m 2h)/2]
2
；实测：866.3.
[0589]
化合物20：c
74h105
cln
18o24
s2,ms(esi)计算：866.1[(m 2h)/2]
2
；实测：866.1.
[0590]
化合物21：c
75h108
cln
17o23
s2,ms(esi)计算：857.9[(m 2h)/2]
2
；实测：858.7
[0591]
化合物22：c
74h105
cln
18o24
s2,ms(esi)计算：866.3[(m 2h)/2]
2
；实测：866.1.
[0592]
表3.nodaga修饰肽
[0593][0594]
化合物
68
ga-16、
68
ga-17、
68
ga-18、
68
ga-19、
68
ga-20和
68
ga-21和
68
ga-22的放射化学合成：
68
gacl3(1mci的0.5ml hcl(0.6m)溶液)用ph5的3m乙酸钠(200μl)稀释以达到ph4.1。将
68
gacl3溶液(200μl)与各种nodaga肽(0.1mm10μl)的乙酸钠(10mm，ph4.1)溶液混合，将反应混合物在60℃下加热10分钟并通过sep-pak轻型c
18
柱体(waters)以除去任何放射性金属杂质(锗-68突破)。通过放射性hplc分析确定，化合物
68
ga-16、化合物
68
ga-17、化合物
68
ga-18、化合物
68
ga-19、化合物
68
ga-20(图8)、化合物
68
ga-21和化合物
68
ga-22的最终溶液的放射化学纯度≥95％。
[0595]
化合物
64
cu-20的放射化学合成：
64
cucl2(1mci)的0.5ml hcl(0.6m)溶液用3m乙酸钠(200μl)稀释以达到ph4.5。添加nodaga肽22(0.1mm 10μl)的乙酸钠(10mm，ph4.5)溶液，在60℃下加热10分钟。通过放射hplc分析确定，化合物
64
cu-20的放射化学纯度≥95％。
[0596]
dotaga螯合剂
[0597]
(
t
bu)4dotaga-pfp的合成：将(
t
bu)4dotaga(200mg，0.29mmol)和五氟苯酚(88mg，0.48mmol)溶解在二氯甲烷(1ml)中，并将ps-dcc(286mg，0.48mmol，1.67mmol/g)添加到混合物中。将反应在室温下搅拌并通过hplc监测。反应完成后，过滤除去树脂。蒸发滤液，将残留物减压干燥。得到的粗品(
t
bu)4dotaga-pfp不经进一步纯化而用于下一步。([m h]

的理论mw＝868.0，观测到的为867.7)。
[0598]
(
t
bu)4dotaga肽的合成：(
t
bu)4dotaga-pfp(50mg，0.06mmol)和肽(79.2mg，0.06mmol)溶解在dmf(1ml)中，通过添加dipea使ph保持在6.5左右。用hplc对反应进行监测。反应完成后，用盐水沉淀固体，用蒸馏水洗涤并减压干燥。粗产物在下一步中使用而无需进一步纯化。([m h]

的理论mw＝2056.9，观测到的为2056.7)。
[0599]
化合物23的合成：通过在tfa、三异丙基硅烷、十二烷硫醇、msa和水(92:2:2:2:2，1ml)的混合物中搅拌(
t
bu)4dotaga肽并在室温下过夜来裂解叔丁酯。用hplc对反应进行监测。将反应混合物在冷乙醚中沉淀。过滤固体，用冷乙醚洗涤并减压干燥。将粗产物溶解在
水(6ml)中并通过反相制备型hplc在c-18柱(luna，10μ，250
×
21.2mm)上使用5％流动相a(0.1％tfa水溶液)至95％流动相b(0.1％tfa乙腈溶液)的梯度在30分钟内纯化环肽。将纯化合物23的级分合并，并冻干以获得白色粉末。
[0600]
化合物23:c
78h112
cln
19o26
s2,ms(esi)计算：1832.43[m h]

,916.7[(m 2h)/2]
2
；实测：1831.7[m h]

,916.2[(m 2h)/2]
2
.
[0601]
表5.dotaga修饰肽
[0602][0603]
化合物
68
ga-23的放射化学合成：scx柱体(100mg，粒径40μm(agilent，目录号12102013))先用5.5mhcl(1ml)洗涤，之后用水(10ml)洗涤，以进行预处理。ga-68(3.0mci)用4ml 0.05mhcl洗脱，并负载到预处理的scx柱体上。用空气吹扫柱体，用0.3ml的3m nacl溶液(含有0.1mhcl)洗脱
68
gacl3。将0.15ml 68
gacl3添加到与0.15ml 0.15m naoac缓冲液混合的化合物23(25μl，1.0mm)的溶液中。将反应混合物加热至90℃并保持10分钟，通过放射性hplc进行分析。通过放射-hplc分析确定，放射化学纯度≥99％。
[0604]
化合物
90
y-23的放射化学合成：将含有0.5mci的
90
ycl3的100μl溶液添加到化合物23(25μl，1.0mm)的溶液中，并与0.15ml ph5的乙酸钠缓冲液混合。将反应混合物加热至40℃并保持60分钟，通过放射性hplc进行分析。对hplc级分进行γ计数。
[0605]
化合物
177
lu-23的放射化学合成：将含有0.5mci的
177
lucl3的100μl溶液添加到化合物23(25μl，1.0mm)的溶液中，并与0.15ml ph5的乙酸钠缓冲液混合。将反应混合物加热至40℃并保持60分钟，通过放射性hplc进行分析。
[0606]
化合物
225
ac-23的放射化学合成：将含有0.1mci的
225
ac(no3)3和20％l-抗坏血酸的100μl溶液添加到化合物23(25μl，1.0mm)的溶液中，并与0.15ml ph6的tris缓冲液混合。将反应混合物加热至60℃并保持60分钟，通过放射性hplc进行分析，对hplc级分进行γ计数。
[0607]
nota螯合剂
[0608]
(
t
bu)2nota肽的合成：将nota(
t
bu)2(50mg，0.12mmol)和hatu(68.6mg，0.18mmol)溶解在dmf(1ml)中，并将混合物在室温下搅拌30分钟。将肽(181mg，0.13mmol)溶解在dmf(1ml)中，并加入diea将ph维持在6.5。用lc-ms对反应进行监测。反应完成后，将混合物用水(4ml)稀释并通过反相制备型hplc在c-18柱(luna，10μ，250
×
21.2mm)上使用5％流动相a(0.1％tfa水溶液)至95％流动相b(0.1％tfa乙腈溶液)的梯度在30分钟内纯化环肽。合并纯化合物的级分，并冻干以获得最终产物。([m h]

的理论mw＝1771.5，观测到的为1771.7)。
[0609]
化合物24的合成：在反应容器中，将约35mg的(
t
bu)2nota肽在1ml tfa、甲磺酸、1-十二烷硫醇、三异丙基硅烷和h2o(92:2:2:2:2)的溶液中脱保护。将反应混合物在室温下搅拌2小时并通过lcms进行分析。反应完成后，加入冷乙醚(15ml)以沉淀出固体。将混合物离心，除去上清液。固体用乙醚洗涤并干燥，得到产物，为白色固体。将粗产物溶解在水(5ml)中并通过反相制备型hplc在c-18柱(luna，10μ，250
×
21.2mm)上使用5％流动相a(0.1％tfa水溶液)至95％流动相b(0.1％tfa乙腈溶液)的梯度在30分钟内纯化环肽。将纯化合物24的
级分合并，并冻干以获得白色粉末。
[0610]
化合物24：c
71h101
cln
18o22
s2,ms(esi)计算：1659.3[m h]

,830.1[(m 2h)/2]
2
；实测：1659.7[m h]

,829.7[(m 2h)/2]
2
。
[0611]
表4.nota修饰肽
[0612][0613]
化合物
68
ga-24的放射化学合成：scx柱体(100mg，粒径40μm(agilent，目录号12102013))先用5.5mhcl(1ml)洗涤，之后用水(10ml)洗涤，以进行预处理。ga-68(3.2mci)用4ml 0.05mhcl洗脱，并负载到预处理的scx柱体上。用空气吹扫柱体，用0.3ml的3m nacl溶液(含有0.1mhcl)洗脱
68
gacl3。将
68
gacl3(0.15ml)添加到化合物24(25ml，0.6mm)的naoac缓冲液溶液(1.5m，0.15ml，ph4.5)中。将反应混合物加热至90℃并保持10分钟，通过放射性hplc进行分析。最终产品的放射化学纯度≥98％。
[0614]
化合物a1
18
f-24的放射化学合成：将se p-pak light accell plus qma柱体(waters)通过先通过10ml 0.4m khco3之后再通过10ml di水以进行预处理。将
18
f(2.0mci，200μl)加载到柱体上，并用di水(5ml)洗涤，之后用khco3(400μl)从柱中洗脱，并用乙酸酸化至ph4.0。制备alcl3储备溶液(2mm，ph4，0.1m乙酸钠缓冲液溶液)，并取300μl与
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f溶液混合。添加化合物24(2mm，300μl)的0.1m naoac溶液并在115℃下加热15分钟，通过放射性hplc(ultra aq，c
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，5μm，250
×
4.6mm)，使用5％流动相a(50mm乙酸铵水溶液)至95％流动相b(10％50mm乙酸铵水溶液和90％乙腈)的梯度。产品的放射化学纯度为80％。经hplc纯化后，放射化学纯度》95％。
[0615]
实施例8：大鼠颈动脉内皮损伤模型中纤维蛋白特异性化合物的评价
[0616]
进行了大鼠颈动脉内皮损伤模型体内研究，其中，颈总动脉被分离并用止血剂短暂压碎，导致在压碎部位形成附壁血栓。之后，用我们的pet化合物对血管壁纤维蛋白进行成像。在这种模型中评估了所有六种化合物。
[0617]
用异氟醚(医用空气中1-2％)麻醉成年雄性wistar大鼠。使用温度调节的加热垫将体温保持在37℃。分别在右股静脉和动脉插管进行复合注射和采血。通过用止血钳夹住血管5分钟，对右侧颈总动脉(颈动脉分叉处近端1-2cm)造成挤压损伤，从而诱发内皮损伤。手术后立即将大鼠置于微型pet/ct扫描仪中。注射化合物(200-600μl)，采集pet-ct图像，并在注射化合物前和注射后2、5、10、15、30、60、90、120分钟从股动脉抽取血样。最后收集组织用于体外分析。
[0618]
实施例9：确定化合物在大鼠中的血液清除率的血液分析
[0619]
在探针注射前和注射后2、5、10、15、30、60、90、120分钟抽取血样。使用γ计数器对各个血样进行称重和计数。各个样品中的活性以每克组织的注射剂量百分比(％id)计算。与研究中的其他化合物相比，化合物
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ga-19和
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ga-20表现出更快的血液清除率和更好的代谢稳定性(图9)。
[0620]
实施例10：用于评估在各个时间点循环的完好无损的化合物级分的功能化合物测试分析
[0621]
分离血浆(在t＝10和60分钟)，并将血浆样品与固定在孔板中的纤维蛋白在室温下孵育2小时。孵育后，在γ计数器上测量含纤维蛋白孔和空孔中上清液中的计数并除以血浆重量以分别确定未结合探针[未结合]和总探针[总]的浓度。含有与纤维蛋白结合的物质的
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ga量[结合]由[结合]＝[总]-[未结合]计算获得。作为阳性对照，将剂量的等分试样加标到血浆中并用于估计测定中可能的总纤维蛋白结合(t＝0时的结合％)。时间t时血液中功能性探针的量通过取时间t时的纤维蛋白结合％与t＝0时的结合％的比例并将该比例乘以血液中测得的总
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ga％id/g来确定。通过测量含有纤维蛋白的孔板中的活性并将其与不含纤维蛋白的孔板中的活性进行比较，估计与纤维蛋白结合的活性百分比。将该结合％与将纯化合物加标到新鲜血浆中时测量的结合％进行比较(图10和图11)。
[0622]
实施例11：用于鉴定代谢物的血液放射性hplc分析
[0623]
将15和90分钟血浆样品的等分试样注射到hplc中，每30秒收集一次级分。将计数的级分与注射入同一色谱柱的纯化合物进行比较，以确定代谢物的数量和在各个时间点循环的完好无损的化合物的级分。出乎意料的是，化合物
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ga-16在注射后迅速形成代谢物，而类似结构的其他化合物保持完好无损(图12)。
[0624]
实施例12：生物分布
[0625]
取出受伤的颈动脉、对侧颈动脉和所有器官，称重，并使用γ计数器计数。各种器官中的活性显示为每克组织的注射剂量百分比(％id)(图13)。
[0626]
实施例13：放射自显影
[0627]
将受伤的同侧和对侧颈动脉置于多功能胶片上，并使用perkin-elmer cyclone plus storage phosphor系统成像。使用pet成像对两种化合物
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ga-19(n＝6只大鼠)和
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ga-20(n＝9只大鼠)进行额外的体内研究(图14)。其中，化合物
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ga-20表现出更快的血液清除率、更好的代谢稳定性和更好的ipsi:相对侧比例。
[0628]
化合物
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ga-20也在兔高危斑块模型(斑块破裂模型)中成功验证。在体内pet后，对所有兔子的平均suv值、tbrvc和tbrm进行比较。图16显示了不同时间点的平均组pet摄取(suv)以及比例。正如预期的那样，随着注射后成像时间点的延长，斑块破裂与对照suv的比例更高。图17显示了来自斑块破裂和对照动物的代表性pet-mr图像。纤维蛋白凝块被视为斑块破裂组沿主动脉的摄取点，而对照主动脉显示出非常均匀的轮廓。
[0629]
实施例14：人颈动脉内膜切除术标本的体外研究
[0630]
从在马萨诸塞州总医院接受选择性颈动脉内膜切除术的无症状患者获得了12个丢弃的手术标本，并将其用于本文所述的体外研究。以如上所述的方式(实施例6和13)处理样品，用于组织学、放射自显影和探针结合测定。
[0631]
丢弃的手术标本被嵌入最佳切割温度的化合物中，快速冷冻，并在进一步分析之前储存在-80℃下。交替连续冷冻切片，以进行组织学和放射自显影；这些实验使用了三个间隔为50μm的组织样本。处理剩余的组织样品用于功能性探针测定。
[0632]
对于组织学：使用含有30％蔗糖的4％多聚甲醛固定标本。将各个节段的喙部嵌入最佳切割温度化合物中，用于组织学冷冻切片(carstairs染色)。剩余的主动脉节段被切开，以进行大体病理学检查。carstairs染色用于区分纤维蛋白(亮红色)、胶原蛋白(亮蓝色)、红细胞(黄色至橙色)、血小板(灰蓝色至海军蓝)和肌肉(红色)。使用显微镜(nikon eclipse 50i，kodak scientific imaging system)检查切片，并使用连接到计算机的相机
(spot 7.4slider rtke，diagnostic instruments)获取数字图像。
[0633]
对于放射自显影，将三个30μm厚的切片与
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ga-20或非纤维蛋白结合对照探针
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ga-22在实验室摇床上在室温下孵育45分钟。在pbs洗涤3次后进行放射自显影。曝光时间为2分钟。
[0634]
对于功能性探针测定，将样品在室温下解冻，称重(各个样品8-15mg)，切割成一式两份，放入1ml pbs中含有111-148kbq(3-4μci)
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ga-20或非纤维蛋白结合对照探针
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ga-22的试管中。将混合物在室温下振摇45分钟。离心后，除去上清液(sup-1)，保留作进一步分析，组织样品用pbs(1ml)洗涤；该程序对各个样品重复两次。保留洗涤溶液(wash-1和wash-2)以供进一步分析。在γ计数器上测量组织样品和溶液sol-1、wash-1和wash-2中的活性。摄取百分比计算如下：
[0635]
摄取％＝[(组织中的活性)/总活性(组织 sup-1 wash-1 wash-2)]
×
100
[0636]
结果：
[0637]
放射自显影(图18a-18b、18g-18h和18m)和功能性探针测定(图18n)均显示出与非结合探针
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ga-22相比显著更高的
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ga-20摄取(两者p《0.05)。但是，在两个实验中
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ga-20摄取存在显著的患者间变异性(图18m-18n)。carstairs的染色结果与放射自显影和探针测试一致。在一些患者标本中，检测到高
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ga-20摄取和大量的纤维蛋白的存在(图18a-18f)，而低摄取样本具有相对较少的纤维蛋白(图18g-18l)。另一方面，从大多数标本中获得的结果并非如此明确，组织中纤维蛋白的总量与放射自显影(p＝0.45)或结合测试(p＝0.28)无关。
[0638]
其他实施方式
[0639]
应理解，虽然本发明已经结合具体实施方式进行了描述，但前述描述旨在说明而不是限制由所附权利要求书的范围所限定的本发明的范围。其它方面、优点和改进均在权利要求书的范围内。