一种新型黄嘌呤氧化酶活性免疫检测试剂盒及应用的制作方法

1.本发明涉及黄嘌呤氧化酶活性检测技术领域，具体涉及一种新型黄嘌呤氧化酶活性免疫检测试剂盒及应用。


背景技术：

2.黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，xod)是一种含钼、非血红素铁、无机硫化物、fad的黄素酶，广泛存在于哺乳动物和灵长类动物的肝肾细胞内，是细胞内嘌呤代谢作用的重要参与者。
3.然而，目前市面上生产的黄嘌呤氧化酶活性免疫检测试剂盒仍然存在一些不足：(1)在样品前处理方面，待测的生物组织或细胞试样，均需进行低温破碎和提取操作，破坏了生物组织或细胞结构的完整性；(2)在试剂盒配制方面，需采用化学合成类试剂，不属于绿色环保类。
4.基于上述问题，本发明利用从实验室提取分离出的天然小分子化合物，与黄嘌呤氧化酶产生的特殊生物化学反应，发现在某处波长表现出较强的特征吸收峰。该吸收峰响应值与酶活力浓度具有较好的线性关系，能够较好地评价xod的生物活力。该天然小分子化合物不会对生物活细胞的结构完整性产生破坏，且具有较好的热稳定性，且无毒副作用，因此本发明提供了一种新型黄嘌呤氧化酶活性免疫检测试剂盒及应用。


技术实现要素：

5.为解决以上技术问题，本发明提供了一种新型黄嘌呤氧化酶活性免疫检测试剂盒，所述试剂盒由试剂1、试剂2和试剂3组成，其中：
6.试剂1为100ml缓冲液，其中包含乙二胺四乙酸钠和焦磷酸钠，ph＝7.2-7.5；
7.试剂2为黄嘌呤氧化酶标准品，粉末状；
8.试剂3为桑色素，浅黄色粉剂。
9.优选地，所述试剂2存储于棕色试剂瓶中，所述试剂3存储于工作液配制小瓶的ep管中，所述试剂1、试剂2和试剂3的保存条件均为4℃。
10.为解决以上技术问题，本发明还提供了一种新型黄嘌呤氧化酶活性免疫检测试剂盒的应用，所述试剂盒用于检测黄嘌呤氧化酶活性。
11.与现有技术(国内盖德化工黄嘌呤氧化酶试剂盒和武汉艾美捷与广州伟伯科技两公司进口售卖的黄嘌呤氧化酶试剂盒)相比，本发明的有益效果为：
12.1.从环保方面，本发明的新型黄嘌呤氧化酶试剂盒所含试剂均无毒无害，可直接用于生物活细胞中xod活力评价，样品的形式及纯度要求也没有特别苛刻。且该试剂盒使用时，无需对待测样品进行细胞破碎和酶提，能较好地保持细胞结构的完整性，与此同时，天然小分子与xod形成的结合物对xod的活力没有影响，在细胞生物学领域具有潜在市场价值和科学应用价值。
13.2.从技术方面，新型xod免疫检测试剂盒的检出限范围较广([xod]：5-50mu/ml
(5.2
×
10-4-5.2
×
10-3
mg/ml))、工作曲线的线性关系较好，能达到r2》0.98。检测时间大大缩短，只需常温(25℃左右)反应15min即可检测。检测试剂盒原料来源广泛，结构简单。
附图说明
[0014]
图1为本发明的新型xod免疫检测试剂盒基本设计思路；
[0015]
图2为本发明桑色素与xod特异性结合后的紫外吸收特征峰；
[0016]
图3为本发明桑色素参与黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤生成尿酸的紫外光谱图；
[0017]
图4为本发明反应时间对桑色素参与黄嘌呤氧化酶活性作用的影响；
[0018]
图5为本发明的黄嘌呤氧化酶浓度为3mu/ml-5mu/ml(3.12
×
10-4
mg/ml-5.2
×
10-4
mg/ml)关于吸收峰峰值的曲线图；
[0019]
图6为本发明的黄嘌呤氧化酶浓度为5mu/ml-10mu/ml(5.2
×
10-4
mg/ml-1.04
×
10-3
mg/ml)关于吸收峰峰值的曲线图；
[0020]
图7为本发明的黄嘌呤氧化酶浓度为10mu/ml-30mu/ml(1.04
×
10-3
mg/ml-3.12
×
10-3
mg/ml)关于吸光度的五点曲线图；
[0021]
图8为本发明的黄嘌呤氧化酶浓度为30mu/ml-50mu/ml(3.12
×
10-3
mg/ml-5.2
×
10-3
mg/ml)关于吸光度的五点曲线图；
[0022]
图9为本发明的黄嘌呤氧化酶浓度为6mu/ml-10mu/ml(6.24
×
10-4
mg/ml-1.04
×
10-3
mg/ml)关于吸收峰峰值的曲线图；
[0023]
图10为本发明的黄嘌呤氧化酶浓度为10mu/ml-20mu/ml(1.04
×
10-3
mg/ml-2.08
×
10-3
mg/ml)关于吸收峰峰值的曲线图；
[0024]
图11为本发明的黄嘌呤氧化酶浓度为20mu/ml-30mu/ml(2.08
×
10-3
mg/ml-3.12
×
10-3
mg/ml)关于吸收峰峰值的曲线图；
[0025]
图12为本发明的黄嘌呤氧化酶浓度为30mu/ml-40mu/ml(3.12
×
10-3
mg/ml-4.16
×
10-3
mg/ml)关于吸收峰峰值的曲线图；
[0026]
图13为本发明的黄嘌呤氧化酶浓度为5mu/ml-50mu/ml(5.2
×
10-4
mg/ml-5.2
×
10-3
mg/ml)关于吸收峰峰值的曲线图；
[0027]
图14为本发明的黄嘌呤氧化酶浓度为5mu/ml-50mu/ml(5.2
×
10-4
mg/ml-5.2
×
10-3
mg/ml)对应的吸收峰图谱；
具体实施方式
[0028]
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施条例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
[0029]
实施例1：新型黄嘌呤氧化酶试剂盒设计思路
[0030]
如图1所示，其具体步骤如下：
[0031]
(1)从实验室中提取天然小分子化合物，本发明的天然小分子化合物是从武陵山区特有的植物中提取分离的，步骤如下：
[0032]
首先，将显齿蛇葡萄植物叶进行杀青，且烘干。
[0033]
其次，干燥后的植物叶进行乙醇浸泡24小时，过滤，滤液经真空脱溶，获得浸膏；
[0034]
最后，该浸膏通过硅胶柱层析洗脱，乙酸乙酯/石油醚为洗脱剂，再经高速逆流色谱精细分离纯化，获得浅黄色粉末。
[0035]
(2)提取的天然小分子化合物经检测为桑色素且能与黄嘌呤氧化酶产生的特殊生物化学反应，因此可将其作为检测黄嘌呤氧化酶活性的试剂之一。
[0036]
(3)结合物吸光度测量，在395
±
3nm处出现较强的紫外吸收特征峰。
[0037]
由图2可知，当桑色素与xod特异性结合后，在395
±
3nm处出现较强紫外吸收特征峰。
[0038]
由图3中可知，294nm是黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤生成尿酸的特征吸收峰，即使在不同浓度的桑色素作用下，黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤的活力是没有明显降低，则视为桑色素对黄嘌呤氧化酶的活性没有明显地抑制作用。在395
±
3nm处，可发现桑色素参与黄嘌呤氧化酶催化反应产生的特异性结合吸收峰，表现出与桑色素浓度增大而增大，具有较好地线性关系。
[0039]
实施例2：探究桑色素对黄嘌呤氧化酶活性的影响
[0040]
实验所需仪器如表1所示
[0041]
表1实验仪器设备
[0042][0043]
实验前期准备：首先，进行0.1mol/l的焦磷酸钠缓冲液配置：称取2.659g的焦磷酸钠和0.0175g的乙二胺四乙酸钠放置在100ml的烧杯中，倒入定量的纯净水，利用超声波使其充分溶解，定容至100ml的容量瓶中，用磷酸调节ph值＝7.5左右。
[0044]
以及进行9.1u/mg黄嘌呤氧化酶母液的配置:称0.001g黄嘌呤氧化酶标准品溶于1ml的焦磷酸钠缓冲液(避光保存)
[0045]
以及桑色素的配置：桑色素的浓度为500umol/l，其相对分子质量为302.24，因此称取的桑色素质量0.0045g，加入纯净水32.43ml利用超声波使其充分溶解。
[0046]
(1)探究黄嘌呤氧化酶与桑色素的最佳反应时间
[0047]
其次以10um/ml-30um/ml划分三个浓度的黄嘌呤氧化酶溶液为实验组，分别为10mu/ml(1.04
×
10-3
mg/ml)、20mu/ml(2.08
×
10-3
mg/ml)及30mu/ml(3.12
×
10-3
mg/ml)。在水浴25℃的条件下，分别加入桑色素溶液(500umol/l，0.4ml)与每个xod浓度梯度混匀，且
分别反应5min，10min，15min，20min，25min，记录在395
±
3nm处不同反应时间的峰值(最大吸光度)，比较xod随着反应时间的不同，峰值的变化，建立曲线图得到相关的抛物线，取最高点，这个最高点就是xod与黄嘌呤氧化酶的最佳反应时间，如图4所示，可知最佳反应时间是15min。
[0048]
(2)探究黄嘌呤氧化酶与桑色素反应的检出限
[0049]
其实验过程分为四个阶段，如下所示：
[0050]
第一阶段：首先对黄嘌呤氧化酶浓度上限进行初步实验，选择黄嘌呤氧化酶浓度3mu/ml-5mu/ml(3.12
×
10-4
mg/ml-5.2
×
10-4
mg/ml)之间等梯度选取五个点，如表1所示，建模测量吸收峰峰值，利用曲线图得出公式可知晓其线性关系与r2值，黄嘌呤氧化酶浓度与吸光度的对应关系如表1所示，如图5所示，r2＝0.8782，其峰值线性关系不好，并且r2较低，因此在此区间的黄嘌呤氧化酶浓度不可取。
[0051]
表1黄嘌呤氧化酶浓度/(mg/ml)与吸光度的对应关系1
[0052][0053]
第二阶段：以黄嘌呤氧化酶浓度5mu/ml(5.2
×
10-4
mg/ml)作为下限点，选择黄嘌呤氧化酶浓度5mu/ml-10mu/ml(5.2
×
10-4
mg/ml-1.04
×
10-3
mg/ml)之间、10mu/ml-30mu/ml(1.04
×
10-3
mg/ml-3.12
×
10-3
mg/ml)之间、30mu/ml-50mu/ml(3.12
×
10-3
mg/ml-5.2
×
10-3
mg/ml)之间三个分段，每个分段等梯度选取5个点，三个分段的黄嘌呤氧化酶浓度与吸光度的对应关系分别如表2、3和4所示，且如图6、图7和图8所示，r2均大于0.95。
[0054]
表2黄嘌呤氧化酶浓度/(mg/ml)与吸光度的对应关系2
[0055][0056]
表3黄嘌呤氧化酶浓度/(mg/ml)与吸光度的对应关系3
[0057][0058]
表4黄嘌呤氧化酶浓度/(mg/ml)与吸光度的对应关系4
[0059][0060]
第三阶段：对黄嘌呤氧化酶浓度再次进行细分，验证实验的准确性，将黄嘌呤氧化酶浓度划分为6mu/ml-10mu/ml(6.24
×
10-4
mg/ml-1.04
×
10-3
mg/ml)、10mu/ml-20mu/ml(1.04
×
10-3
mg/ml-2.08
×
10-3
mg/ml)、20mu/ml-30mu/ml(2.08
×
10-3
mg/ml-3.12
×
10-3
mg/ml)、30mu/ml-40mu/ml
[0061]
(3.12
×
10-3
mg/ml-4.16
×
10-3
mg/ml)四个分段，每个分段等梯度选取5个点，四个分段的黄嘌呤氧化酶浓度与吸光度的关系分别如表5、6、7和8所示，且如图9、图10、图11和
图12所示，r2均大于0.95。
[0062]
表5黄嘌呤氧化酶浓度/(mg/ml)与吸光度的对应关系5
[0063][0064]
表6黄嘌呤氧化酶浓度/(mg/ml)与吸光度的对应关系6
[0065][0066]
表7黄嘌呤氧化酶浓度/(mg/ml)与吸光度的对应关系7
[0067][0068]
表8黄嘌呤氧化酶浓度/(mg/ml)与吸光度的对应关系8
[0069][0070]
第四阶段：最后综合以上所述实验，选择黄嘌呤氧化酶浓度5mu/ml-50mu/ml(5.2
×
10-4
mg/ml-5.2
×
10-3
mg/ml)浓度之间等梯度选取十个点，建模测量吸收峰峰值，建模的参比溶液为0.4ml桑色素 2.6ml水；反应溶液为0.4ml桑色素 1.6ml水 1ml(相应浓度)xod，利用曲线图得出公式可知晓其线性关系与r2值，如图13所示的r2＝0.9797可知，检出限在5mu/ml-50mu/ml(5.2
×
10-4
mg/ml-5.2
×
10-3
mg/ml)之间可以达到一个良好的线性关系，黄嘌呤氧化酶浓度与吸光度的对应关系如表9所示，且如图13所示，r2大于0.95，其对应的图谱比较如图14所示。
[0071]
表9黄嘌呤氧化酶浓度/(mg/ml)与吸光度的对应关系9
[0072][0073]
实施例3：新型黄嘌呤氧化酶试剂盒使用方法
[0074]
试剂盒包括：试剂1为100ml缓冲液，其中包含乙二胺四乙酸钠和焦磷酸钠，ph＝7.2-7.5；试剂2为黄嘌呤氧化酶标准品，规格为9.1u/mg，粉末状；试剂3为桑色素，浅黄色粉剂。
[0075]
1.仪器预热；
[0076]
仪器为紫外可见分光光度计，将其开机预热30min以上，稳定光源，调节波长至395
±
3nm，蒸馏水调零。
[0077]
2.工作曲线制作；
[0078]
工作液的配制：取标有工作液配制小瓶的ep管，并向其ep管中加入纯净水0.125ml，使其完全溶解，用移液枪吸取0.1ml，转移至10ml容量瓶中，加纯水定容，备用。该工作液未用完，在4℃的环境下，可储存2周。
[0079]
黄嘌呤氧化酶反应液的配制：称取0.0010g黄嘌呤氧化酶标准品(规格：9.1u/mg)置于5ml玻璃硬质试管中，吸取1.0ml的试剂一，即缓冲液，转移至玻璃硬质试管中，配制9.1mu/ml的xod母液。分别吸取0.066ml xod母液于玻璃试管a、b、c、d、e中，并加入纯水稀释至5.2
×
10-4
mg/ml、7.8
×
10-4
mg/ml、1.04
×
10-3
mg/ml、1.56
×
10-3
mg/ml、2.08
×
10-3
mg/ml、2.6
×
10-3
mg/ml及3.12
×
10-3
mg/ml(该活力浓度仅供参考，可根据具体情况微调)。
[0080]
工作曲线的制作：取0.4ml工作液 1ml各浓度xod 1.6ml水(参比：0.4ml工作液 2.6ml水)水浴25℃反应15min后将反应液移至石英比色皿，测定在395
±
3nm处的吸光度值(od)并记录。将数据导入作图软件如excel画出吸光度值随xod活力变化的拟合曲线。
[0081][0082]
注：参比：0.4ml试剂三工作液 2.6ml蒸馏水
[0083]
3.样品测试
[0084]
取0.4ml工作液 1.0ml样品液 1.6ml水于试管，水浴25℃条件下反应15min(参照上述参比)，将反应液移至石英比色皿测定395
±
3nm处od值并记录。注：若od值超过标准曲线线性范围，则稀释至一定倍数后再次按上述反应后测定，其xod活性计算参照现有技术；
[0085]
(1)细胞或组织样本的制备：
[0086]
细胞：先收集细胞到离心管内，离心后弃上清液；按照细胞数量(104个)：提取液体积(ml)为500～1000：1的比例(建议500万细胞加入1ml提取液)，超声波破碎细胞(冰浴，功率20％或200w，超声3s，间隔10s，重复30次)；4℃离心(8000r)10min，取上清液，置冰上待测。
[0087]
组织：按照组织质量(g)：提取液体积(ml)为1:5～10的比例(建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液)，进行冰浴匀浆。4℃离心(8000r)10min，取上清，置冰上待测。
[0088]
(2)血清(浆)样本：
[0089]
可直接检测
[0090]
xod活性计算为现有技术，需要注意的是若取样品制备液稀释n倍，[xod]＝n(y-b)/a(标准曲线拟合方程：y＝ax b)
[0091]
实施例4新型黄嘌呤氧化酶试剂盒应用实例
[0092]
取0.1g大鼠肝脏加入1ml提取液进行冰浴匀浆，4℃离心(8000r)10min，取上清液，置冰上，之后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得395
±
3nm处吸光度为0.705。则计算出样品液中xod活力为0.019u/ml(0.019u/mg)。
[0093]
如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表
述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。