一种聚合物修饰抗体类药物的修饰度的测定方法与流程

1.本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种聚合物修饰抗体类药物(特别是peg修饰单克隆抗体)的修饰度的测定方法及其应用。


背景技术：

2.蛋白质类药物主要包括多肽、酶、细胞因子、激素、抗体等一些具有特殊功能的蛋白质，随着生物技术的发展，人们可以通过发酵工程、基因工程、蛋白质工程、酶工程等途径获得所需的蛋白质。但经过大量的临床研究发现，未经任何修饰的蛋白类药物在体内具有半衰期短、免疫原性强、稳定性差、易被体内酶降解等缺陷，从而降低了临床效果。为此，人们尝试通过多种途径对蛋白类药进行改造以适应于临床应用。
3.聚乙二醇(peg)是一种在溶液中可自由卷曲的不带电荷的水溶性聚合物，具有无毒、微弱的抗原性和良好的生物相容性，用其共价修饰蛋白质，可以增加蛋白质的体内循环半衰期和减小其抗原性，增加蛋白质的溶解性并会改变蛋白质在人体内的生物学分布。自1977年abuchowski，davis(j.biol.chem.1977,252:3578-3581.)等人首次报道用peg修饰蛋白质以来，peg已经被广泛地应用于蛋白多肽类药物的修饰研究，蛋白质peg化技术已经成为降低蛋白质生物药物的免疫原性、改善其药代动力学/药效学性质最有效的方法之一。近年来，peg还作为连接子用于抗体药物偶联物(antibody drug conjugates，adc，其由抗体(antibody)、药物(drug)以及连接子(linker)三部分组成)的制备。抗体药物偶联物因其良好的靶向性及抗肿瘤活性，可实现“精准治疗”，已成为抗肿瘤抗体药物研发的新热点和重要趋势，受到越来越多的关注。
4.由于蛋白质上可以发生修饰的位点较多，因此，反映peg对蛋白质修饰程度的平均修饰度或peg结合数，对该类药物构效关系研究与质量控制具有重要意义。目前，peg平均修饰度的检测方法主要有：三硝基苯磺酸(ttbs)法、荧光胺法、质谱法、液相色谱法、毛细管法、傅里叶变换红外光谱(ftir)、拉曼散射光谱、酶解法等。在实际应用中发现ttbs法和荧光胺法简单易操作，但受外界干扰大，造成较大的实验误差，例如专利文献cn108267590a的比较例中所述。cn108267590a公开了一种peg修饰蛋白的peg结合数检测方法，其采用酶解法将待测peg修饰蛋白样品处理后将peg释放出来，检测peg的质量，通过蛋白及peg的摩尔比推算出peg修饰蛋白中peg结合数。但酶解法中有可能释放peg不完全，为避免游离peg干扰，往往还需要对酶解样品进行纯化。专利文献cn109682901a公开了一种聚乙二醇化蛋白类药物的平均修饰度测定方法，其包括使用与未修饰蛋白类药物标准品、聚乙二醇标准品的浓度呈线性关系的多种类型的检测器，分别建立未修饰蛋白类药物标准品、聚乙二醇标准品的浓度与其各自浓度对应的每种类型检测器响应值的标准曲线的步骤，步骤较为繁琐，实际检测中工作量较大。


技术实现要素：

5.为克服现有技术的不足，本发明提供一种聚合物修饰蛋白类药物(特别是peg修饰
单克隆抗体)的修饰度的测定方法及其应用。
6.在本发明第一方面，提供一种聚合物修饰抗体的修饰度的测定方法，其包括将待测样品通过maldi-tof检测、将待测样品经还原剂处理后分别通过lc-q-tof和maldi-tof检测的步骤。
7.具体地，将待测样品经还原剂处理后分别通过lc-q-tof和maldi-tof检测的步骤包括：
8.(1)将待测样品与还原剂混合，进行还原反应；
9.(2)将步骤(1)所得产物分别通过lc-q-tof和maldi-tof检测。
10.任选地，该方法还包括将所得lc-q-tof检测结果和maldi-tof检测结果进行相互验证的步骤。
11.具体地，如果需要，待测样品可以经过稀释后与还原剂混合，稀释剂可以为缓冲液，例如nh4hco3溶液。
12.具体地，所述还原剂可以选自：β-巯基乙醇、三(2-羧乙基)磷、二硫苏糖醇(dtt)中一种或多种的组合，特别是dtt。
13.在本发明的一个实施方式中，还原剂为dtt，其浓度为100-1000mmol/l(例如100、200、300、400、500、600、800、1000mmol/l)。
14.具体地，步骤(1)中所述还原反应的温度为35-40℃(例如35、36、37、38、39、40℃)，特别是37℃。
15.具体地，步骤(1)中所述还原反应的时间为10-30分钟(例如10、15、20、25、30分钟)，特别是20分钟。
16.具体地，步骤(1)中所述还原反应在振摇条件下进行。
17.具体地，所述maldi-tof的基质为3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸(芥子酸，sa)。
18.具体地，所述maldi-tof的power为150。
19.在本发明的一个实施例中，所述maldi-tof检测所用仪器为maldi-8020。
20.具体地，所述lc-q-tof为uplc-q-tof，所述液相色谱的固定相可以为uplc beh c18，其粒径可以为1-5μm，例如1.7μm。
21.具体地，所述液相色谱的柱温可以为30-50℃(例如30、35、36、38、40、42、44、45、50℃)，特别是35-45℃，例如40℃。
22.具体地，所述液相色谱的流动相流速可以为0.1-1ml/min(例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0ml/min)，特别是0.1-0.5ml/min，例如0.2ml/min。
23.具体地，所述流动相由流动相水相(a)和流动相有机相(b)组成。
24.具体地，流动相a为甲酸水溶液，其浓度为0.01-1％(体积百分比)(例如0.01％、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.4％、0.5％、1％)，特别是0.05-0.2％，例如0.1％。
25.具体地，流动相b为甲酸的乙腈溶液，其浓度为0.01-1％(体积百分比)(例如0.01％、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.4％、0.5％、1％)，特别是0.05-0.2％，例如0.1％。
26.具体地，具体地，所述液相色谱检测采用梯度洗脱；更具体地，洗脱程序包括：
27.0-1min，流动相b，5％，流动相a，余量；
28.1-30min，流动相b，5％
→
25％，流动相a，余量；
29.30-40min，流动相b，25％
→
50％，流动相a，余量；
30.40-50min，流动相b，55％
→
75％，流动相a，余量；
31.50-60min，流动相b，75％
→
100％；
32.60-60.1min，流动相b，100％
→
5％，流动相a，余量；
33.60.1-70min，流动相b，5％
→
stop，流动相a，余量。
34.具体地，所述液相色谱的进样量为1-5μl(例如1、2、3、4、5μl)，特别是4μl。
35.具体地，对于所述lc-q-tof，所述质谱的离子源为esi，离子化模式：正离子。
36.具体地，对于所述lc-q-tof，所述质谱的扫描质量范围为400-3000m/z。
37.具体地，对于所述lc-q-tof，所述质谱的去簇电压(dp)为250v。
38.具体地，对于所述lc-q-tof，所述质谱的碰撞电压(ce)为10v。
39.具体地，对于所述lc-q-tof，所述质谱的accumulation time为0.15秒。
40.具体地，对于所述lc-q-tof，所述质谱的time bins to sum为80。
41.在本发明的一个实施例中，所述质谱仪器为tripletof 6600。
42.具体地，待测样品包括聚合物修饰抗体样品和抗体样品。
43.具体地，所述聚合物修饰抗体中聚合物为水溶性聚合物，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚噁唑啉、聚丙酰胺基吗啉、聚唾液酸、葡聚糖等；在本发明的一个实施例中，所述聚合物为聚乙二醇(peg)，所述方法即为peg修饰抗体的peg结合数的测定方法。
44.具体地，所述聚合物的分子量为400-100000道尔顿(例如400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、10000、50000、100000道尔顿)，特别是400-4000道尔顿。
45.具体地，所述聚乙二醇为直链的或支链的聚乙二醇，特别是直链聚乙二醇。
46.具体地，所述聚乙二醇包括单端活化、双端活化或多端活化的活化基团，特别是单端活化的活化基团；更具体地，所述活化基团包括，但不限于，醛基、羧基、酯基、酰胺基、巯基、环氧基、马来酰亚胺基、琥珀酰亚胺碳酸酯、琥珀酰亚胺乙酸酯、琥珀酰亚胺丙酸酯、羰基醛、酰肼、氨基等。
47.具体地，所述聚合物修饰抗体中抗体为单克隆抗体；在本发明的一个实施例中，所述抗体为egfr单抗，例如耐昔妥珠单抗(necitumumab)。
48.具体地，所述方法包括检测单克隆抗体的轻链和/或重链上的修饰度的测定步骤。
49.具体地，所述方法为测定peg修饰单克隆抗体的轻链和重链上的修饰度的方法。
50.在本发明的一个实施方式中，peg修饰单克隆抗体n3-(ch2ch2o)nch2ch2co-单克隆抗体，n为聚合度；在本发明的一个实施例中，peg修饰单克隆抗体为n3-(ch2ch2o)
12
ch2ch2co-耐昔妥珠单抗。
51.具体地，所述聚合物修饰抗体可以为抗体药物偶联物(adc)，其中聚合物(例如peg)部分作为连接子。
52.在本发明第二方面，提供第一方面所述方法在聚合物修饰抗体的质量控制中的应用。
53.具体地，聚合物、抗体具有本发明第一方面中所述定义。
54.具体地，该应用为第一方面所述方法在peg修饰抗体的peg结合数的测定中的应用。
55.在本发明的一个实施例中，所述抗体为egfr单抗，例如耐昔妥珠单抗
(necitumumab)。
56.在本发明的一个实施方式中，peg修饰单克隆抗体为n3-(ch2ch2o)nch2ch2co-单克隆抗体，n为聚合度；在本发明的一个实施例中，peg修饰单克隆抗体为n3-(ch2ch2o)
12
ch2ch2co-耐昔妥珠单抗。
57.具体地，所述聚合物修饰抗体可以为抗体药物偶联物(adc)，其中聚合物(例如peg)部分作为连接子。
58.根据本发明提供的测定方法，一方面利用lc-q-tof来计算单抗链上的聚合物(例如peg)修饰度，无需将不同修饰度的单抗链进行完全的物理分离或色谱分离，利用解卷积出的分子量差值规律，可同时得到轻链和重链上的聚合物(例如peg)修饰度；另一方面，无需物理分离，用maldi-tof对高达十几万的聚合物修饰抗体(例如peg修饰抗体)进行分子量检测，也可以对还原拆分后的轻链和重链进行分子量检测，可同时得到轻链和重链上的聚合物(例如peg)修饰度；lc-q-tof与maldi-tof联合使用，互为补充，互相验证，可以得到重链和轻链更多的修饰信息，使结果更加可靠。相对于现有技术，本发明提供的测定方法简单，快捷，准确度更高。
附图说明
59.图1所示为egfr单抗经dtt处理后的总离子流图。
60.图2所示为egfr单抗轻链的解卷积谱图。
61.图3所示为egfr单抗重链的解卷积谱图。
62.图4所示为egfr-peg经dtt处理后的总离子流图。
63.图5所示为egfr-peg轻链的解卷积谱图。
64.图6所示为egfr-peg重链的解卷积谱图。
65.图7所示为egfr单抗的maldi-tof谱图。
66.图8所示为egfr-peg的maldi-tof谱图。
67.图9所示为egfr单抗经dtt处理后的轻链的maldi-tof谱图。
68.图10所示为egfr-peg经dtt处理后的轻链的maldi-tof谱图。
69.图11所示为egfr单抗经dtt处理后的重链的maldi-tof谱图。
70.图12所示为egfr-peg经dtt处理后的重链的maldi-tof谱图。
具体实施方式
71.除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
72.本文所引用的各种出版物、专利和公开的专利说明书，其公开内容通过引用整体并入本文。
73.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
74.实施例1
75.以egfr-peg(n3-(ch2ch2o)
12
ch2ch2co-egfr单抗)为实例，说明本发明的检测方法及其检测效果。
76.egfr单抗为耐昔妥珠单抗(necitumumab)，购自礼来(eli lilly)公司。
77.egfr-peg的制备过程如下：按照egfr单抗(以下简称为mab)与n3-peg
12-spa(由北京键凯科技股份有限公司提供)的摩尔比为1:20的投料比进行反应。先量取208μl的mab溶液(浓度：9.6mg/ml)置于1.5ml的离心管中，则量取的mab为2mg。使用5mm ph3.0的pbs溶液配制10mg/ml的n3-peg
12-spa溶液，量取20μl加入到离心管中，充分混合，震荡反应2h。反应完毕后用超滤的方式去除未反应的n3-peg
12-spa。
78.将egfr单抗和egfr-peg样品通过maldi-tof进行上机分析。
79.egfr-peg 1mg/ml，精密量取egfr-peg 50μl加200mm dtt溶液2.5μl，37℃振摇20分钟，样品分别通过lc-q-tof和maldi-tof进行上机分析。
80.在相同条件下对egfr单抗纯品进行检测分析。
81.相关参数如下：
82.q-tof：sciex tripletof 6600
83.maldi-tof：shimadzu maldi-8020
84.表1仪器及参数
[0085][0086]
结果如图1-12所示。
[0087]
lc-q-tof可以对egfr单抗经dtt处理后的轻链、重链的总离子流图(图1)分别进行解卷积而得到轻链的分子量(图2)和重链的分子量(图3)；而对egfr-peg偶联物经dtt处理后的不同peg修饰度的轻链混合物和重链混合物，无需完全分离，在总离子流图上(图4)直接解卷积，根据质量数的差异规律可以得到轻链和重链peg修饰度主要范围在1～3个(见图5和图6)；
[0088]
对egfr单抗和egfr-peg分别直接做maldi-tof，根据质量数差异来计算egfr单抗整体的peg修饰度约是9个(见图7和图8)((152388-146955)/626＝8.7)，因egfr单抗和
egfr-peg分子量较大在lc-q-tof上谱图较为复杂，难以解出peg修饰个数，而maldi-tof在这方面可做补充；
[0089]
对egfr单抗和egfr-peg经dtt处理后的轻链分别做maldi-tof，根据质量数差异来计算egfr单抗轻链的peg修饰度主要范围在1～3个(见图9和图10)，其与lc-q-tof分析结果一致，两者相互验证；
[0090]
对egfr单抗和egfr-peg经dtt处理后的重链分别做maldi-tof，根据质量数差异来计算egfr重链的修饰个数在3个(见图11和图12)，而lc-q-tof在重链的peg修饰方面能提供更多细节，可以补充maldi的信息量较少的不足。
[0091]
从上面的实例可以看出lc-q-tof和maldi-tof即互为补充又能相互验证，对egfr单抗偶联peg的修饰度能提供详细的解析。
[0092]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0093]
本发明中描述的前述实施例和方法可以基于本领域技术人员的能力、经验和偏好而有所不同。
[0094]
本发明中仅按一定顺序列出方法的步骤并不构成对方法步骤顺序的任何限制。