一种抑制奶牛源大肠杆菌的中草药配方及其制备方法

1.本发明涉及中草药配方技术领域，更具体的说是涉及一种抑制奶牛源大肠杆菌的中草药配方及其制备方法。


背景技术：

2.奶牛源大肠杆菌(escherichia coli，e.coli)是引起奶牛乳房炎(mastitis)、子宫内膜炎(endometritis)、犊牛腹泻(calfdiarrhea)的主要病原菌之一，由于较高的死亡率、发病率和治疗费用，对奶牛行业造成巨大的经济损失。奶牛源大肠杆菌属于环境病原菌，广泛分布于自然界中，其中粪便是污染的主要来源，其检出率的高低与环境污染程度有很大关系，在动物养殖过程中环境气候突然的改变，饲养环境变差及饲养管理不当等因素，都能诱发和促使该病加重。
3.目前对该病的防治主要是利用化学药品、抗生素或减活、灭活疫苗，其中抗生素为主要治疗方式，但抗生素的不合理使用使动物产生严重的耐药性问题，越来越多的抗生素治疗无效，造成环境、水源、土壤的污染，药物残留还对食用者构成潜在的威胁。
4.因此，提供一种生物安全性高的防治奶牛源大肠杆菌病的药物是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了一种抑制奶牛源大肠杆菌的中草药配方，不仅可以避免细菌耐药性产生，可以减少肉制品药物残留和环境污染，降低生产成本。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.一种抑制奶牛源大肠杆菌的中草药配方，由以下重量份的原料组成：黄连5～8份、五味子3～5份、乌梅3～5份和石榴皮2～3份，本发明充分依据黄连、五味子、乌梅、石榴皮药物性质、功效等特点进行配方，对人工感染奶牛源大肠杆菌的小鼠具有较好的预防效果。黄连，为毛茛科黄连属植物，具有清热燥湿，泻火解毒功效。主治湿热痞满，湿热泻痢，高热神昏，痈肿疖疮，目赤牙痛，消渴，外治湿疹等症状。其属于广谱抑菌药物，可消除菌株耐药性，调和各种药物之间的作用，对各种细菌、真菌均有一定的抑制作用，其中黄连中的碱性成分具有较强的抑菌作用；五味子，主产于西南地区及长江流域以南各省，味酸、甘，性温，归肺、心、肾经，研究发现，五味子具有抗炎、保护肝脏、抗氧化、抗菌等药理作用，古代方剂中常用于治疗久泻不止等肠道疾病和消渴症等，现代临床根据其药理作用特点将五味子应用于腹泻、糖尿病、肝脏疾病、高血脂、呼吸道疾病及抗肿瘤等方面，并取得良好的疗效。五味子主要成分有木脂素，具有抗菌、抗病毒等作用，据研究发现其可以通过改变大肠杆菌细胞膜的通透性，影响菌株线粒体内膜及细菌的能量代谢和蛋白质的合成，从而达到较好的抑菌效果；乌梅，俗称黄仔、酸梅、干枝梅等，主产于云南、福建、四川、安徽、贵州等地。乌梅是我国传统的药食同源中药，其主要化学成分类型为有机酸类、黄酮类、萜类、多糖类等。现代药理研究表明，乌梅具有治疗哮喘、治疗溃疡性结肠炎、调节免疫、抗氧化、抗肿瘤、抑菌等作用，
乌梅，为性平药物，主要归肝、脾、肺、大肠经，其主要化学成分类型为有机酸类、黄酮类、萜类、多糖类等，其具有治疗哮喘、溃疡性结肠炎、调节免疫、抗氧化、抗肿瘤、抑菌等作用，据研究发现乌梅中的柠檬酸和苹果酸可以破坏细胞膜和和阻滞细菌dna的合成从而起到抑菌效果；石榴皮为石榴科植物石榴的果皮，石榴皮气微弱，味涩，以皮厚实、红褐色者为佳，被誉为“大自然恩赐的天然抗生素”。中医认为，石榴皮性味酸、涩、温、小毒，归肾、大肠经，功效涩肠止泻、止血、解毒、抗菌、杀虫等作用，其含有多种生物活性化合物，主要包括鞣质类、黄酮类、生物碱和有机酸等，石榴皮提取物具有广谱抗菌作用，研究发现石榴皮中的成分可以抑制细菌生物膜的形成和毒力因子的表达作用。
8.优选的，抑制奶牛源大肠杆菌的中草药配方由以下重量份的原料组成：黄连7份、五味子5份、乌梅5份和石榴皮3份。
9.上述抑制奶牛源大肠杆菌的中草药配方的制备方法，包括以下步骤：
10.s1、按配比称取各味中草药，加水浸泡2h，武火加热煮沸后改文火煎煮30min，过滤得一煎液；
11.s2、滤渣加水，武火加热煮沸后改文火煎煮30min，过滤得二煎液；
12.s3、合并一煎液和二煎液，离心弃药渣，上清液加热浓缩，得中草药。
13.优选的，s1中中草药与水的配比为1:10；s2中滤渣与水的配比为1:7.5。
14.优选的，s3所述离心为4500r/min，20min。
15.优选的，s3所得中草药的浓度为1g/ml
16.有益效果：
17.本发明一种抑制奶牛源大肠杆菌的中草药配方，利用中草药预防奶牛源大肠杆菌病,不仅可以避免细菌耐药性的产生，还可以降低肉制品中的兽药残留，减少环境、水源、土壤的污染。中草药具有价格低廉、成本低、天然、无毒无残留、不产生耐药性等优点，不会对人和动物产生毒副作用，并且制作工序简单，容易操作，易于实现工厂化生产。
附图说明
18.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
19.图1为本发明实施例3各组小鼠临床表现之粪便表现；
20.图2为本发明实施例3各组小鼠临床表现之眼部表现；
21.图3为本发明实施例3各组小鼠盲肠病理组织变化(he染色)结果图；
22.图4为本发明实施例3各组小鼠小肠病理组织变化(he染色)结果图；
23.图5为本发明实施例3各组小鼠脾脏病理组织变化(he染色)结果图；
24.图6为本发明实施例3各组小鼠肝脏病理组织变化(he染色)结果图。
具体实施方式
25.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通
技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
26.本发明实施例公开了一种抑制奶牛源大肠杆菌的中草药配方，所用原料均为市售可得，对其来源不做具体限定，所涉及的方法，如无特殊提及，均为常规方法，在此不再一一赘述。
27.实施例1
28.1、中草药选材(均购自河北保定安国中草药市场)
29.包括乌梅、五倍子、五味子、黄芩、黄连、百里香、夏枯草、肉桂、丁香、芍药、石榴皮、蒲公英、野菊花、陈皮、鱼腥草、黄芪、无花果、金银花、石竹、紫花地丁、穿心莲、连翘、甘草、藏药蓝花荆芥、杜仲、马鞭草。
30.2、药液制备
31.称取中草药20g，加蒸馏水200ml，浸泡2h，武火加热煮沸后改文火煎煮30min，用12层纱布过滤中药药液，向药渣中加入150ml蒸馏水，同样的方法煎煮，过滤，弃去药渣，合并2次煎煮液，4500r/min离心20min，将药物进行加热浓缩，浓度为1g/ml，4℃保存备用。
32.3、单一成分抑菌(o114血清型)效果测定
33.抑菌直径测定方法：采用牛津杯法测定抑菌直径。牛津杯用之前用蒸馏水清洗干净，121℃高压灭菌，烘干箱烘干备用，配置固体营养琼脂培养基，将高压后的培养基少量倒入平皿中，待培养基凝固后放入牛津杯，倒入固体培养基，待凝固后将牛津杯取出，4℃保存备用，用移液枪吸取100μl制备好的菌液滴加在培养基表面，用高压后棉签涂抹均匀，试验组分别在孔里加入200μl相应的药液，每种药液设3个重复，阴性对照组(涂菌不加药)，将平皿放在37℃恒温培养箱中培养12h，以牛津杯孔周围没有肉眼可见细菌生长的区域为抑菌圈，用直尺测量抑菌圈直径。
34.mic测定方法：96孔板二倍稀释法测定mic。每孔加入100μl lb液，第一孔内加入100μl中草药提取液，依次进行二倍稀释，稀释1～10孔，药物稀释浓度依次为500、250、125、62.50、31.25、15.63、7.80、3.90、1.95、0.97mg/ml，1～10孔内加入制备好的菌液，10μl/孔，第11个孔不加药物为阴性对照组，每种药物重复3次，将96孔板置于37℃恒温培养箱内培养24h，观察结果，在阴性对照孔内出现浑浊的前提下，1～10号孔内液体澄清透明的孔视为该药物对菌株的mic。
35.mbc测定方法：采用平板涂菌法测定mbc。在测定mic基础上，吸取100μl肉眼观察澄清液体分别涂在琼脂培养基上，将培养基放在37℃恒温培养箱培养12h，观察结果，培养基上无细菌生长的药物最低浓度则为该药物对菌株的mbc。
36.各中草药抑菌圈和最小抑菌浓度(mic)、最低杀菌浓度(mbc)见表1.
37.表1
[0038][0039]
可见，五味子、乌梅、五倍子、黄芩、黄连、石榴皮表现出极度敏感，平均抑菌直径在19.53mm～30.13mm之间，抑菌效果五味子＞乌梅＞五倍子＞黄芩＞石榴皮；其次夏枯草、连翘、丁香、紫花地丁、百里香、黄连中草药表现出高度敏感，平均抑菌直径在15.93mm～18.58mm之间，抑菌效果夏枯草＞连翘＞丁香＞紫花地丁＞百里香＞黄连；蒲公英、肉桂、蓝花荆芥、芍药、鱼腥草、穿心莲表现出中度敏感，平均抑菌直径在10.66mm～14.33mm之间，抑菌效果蒲公英＞肉桂＞蓝花荆芥＞芍药＞鱼腥草＞穿心莲。
[0040]
4、复方成分抑菌效果测定
[0041]
复方ⅰ：乌梅5份、五味子5份、黄芩4份、石榴皮4份、夏枯草2份
[0042]
复方ⅱ：五味子6份、乌梅5份、五倍子4份、无花果3份、百里香2份
[0043]
复方ⅲ：黄连7份、五味子5份、乌梅5份、石榴皮3份
[0044]
复方ⅳ：乌梅6份、五倍子5份、五味子4份、石榴皮3份、百里香2份
[0045]
各中草药抑菌圈和最小抑菌浓度(mic)、最低杀菌浓度(mbc)见表2.
[0046]
表2
[0047]
中草药配方抑菌直径(mm)mic/mbc(mg/ml)复方ⅰ26.6614.04/24.99复方ⅱ26.8612.48/18.73复方ⅲ28.607.80/7.80复方ⅳ26.4915.60/31.25
[0048]
由表2可见，复方ⅲ(黄连、五味子、乌梅、石榴皮)的抑菌效果最显著。
[0049]
实施例2
[0050]
药物安全性评价
[0051]
取40只雌性小鼠(20
±
2g)，随机分为四组，对复方ⅲ中草药的安全性进行评价，其中a为高剂量组(2g/ml)、b为中剂量组(1g/ml)、c为低剂量组(500mg/ml)、d为对照组(生理
盐水)，小鼠试验前一天晚上21点进行断水断粮，第二天的上午9点进行小鼠灌胃，每只小鼠灌服0.2ml，对照组灌服同剂量的生理盐水，小鼠连续灌胃5d，在小鼠第一次灌胃4h之后再进行小鼠饲喂，5d后统计结果。
[0052]
1、各组小鼠临床表现
[0053]
a、b、c组小鼠与d组小鼠临床表现比较差异不大，小鼠精神状态较好，未出现沉郁、卷缩、嗜睡，呼吸急促或者缓慢等现象，小鼠粪便形状、颜色正常。
[0054]
2、各组小鼠体重及采食量
[0055]
在1～5d内a、b、c组与d组小鼠体重比较，小鼠体重均无显著性差异(p》0.05)；小鼠采食量a、b、c组小鼠采食量与d组小鼠采食量比较无显著性差异(p》0.05)，研究结果说明，复方ⅲ(高、中、低)浓度灌胃小鼠对小鼠的体重及采食量未产生影响。
[0056]
3、复方中草药对小鼠安全性试验结果
[0057]
a、b、c组小鼠均未出现死亡情况。
[0058]
表3中草药配方对小鼠安全性试验结果
[0059][0060]
实施例3
[0061]
药物有效性评价
[0062]
取30只雌性小鼠(20
±
2g)，随机分为3组，禁食禁水12h，将小鼠分为a组(空白对照组)、b组(生理盐水组)、c组(复方ⅲ组)试验前一天晚上21点进行断水断粮，第二天的上午9点进行小鼠灌胃，小鼠灌服剂量为0.2ml/只，对照组灌服同剂量的生理盐水，连续灌胃5d，在第5d灌胃1h后，b、c三组小鼠腹腔每只注射0.2ml ld50菌液(1
×
108cfu/ml)，连续饲喂6d，观察小鼠临床变化，记录小鼠情况。
[0063]
1、小鼠临床表现
[0064]
c组小鼠临床表现与b组小鼠临床表现比较，c组小鼠临床表现较轻，c组个别小鼠在感染菌后出现精神沉郁、扎堆，但小鼠精神状态恢复较快，眼睛周围未出现脓性分泌物，小鼠粪便颜色正常、成形、未出现粘肛现象，(参见附图1、2)
[0065]
2、病理切片观察
[0066]
盲肠：
[0067]
a组盲肠结构完整，黏膜层见上皮细胞排列整齐，杯状细胞未见增生或减少，固有层未见炎性细胞增生，肠腺数量适中，黏膜下层未见充血及炎性细胞浸润；
[0068]
b组盲肠结构较为完整，黏膜层可见黏膜上皮水肿，上皮细胞肿胀(黑色箭头)，胞质呈淡粉或透明染色，上皮间有少量炎性细胞浸润；黏膜下层显著水肿(蓝色箭头)，结缔组织间隙增宽，水肿液呈透明样，淋巴小结结构明显；
[0069]
c组盲肠结构完整，黏膜层见上皮细胞排列整齐，杯状细胞未见增生或减少，固有层未见炎性细胞浸润，肠腺数量适中，黏膜下层未见充血，见少量炎性细胞增生(参见附图3)。
[0070]
小肠：
[0071]
a小肠结构完整，黏膜层见肠绒毛上皮排列整齐，杯状细胞未见增生或减少，固有层未见炎性细胞增生，肠腺数量适中，黏膜下层未见充血，亦未见炎性细胞浸润；
[0072]
b小肠结构完整，黏膜层见肠绒毛上皮排列整齐，杯状细胞未见增生或减少，固有层可见少量红细胞及炎性细胞(黑色箭头)，黏膜下层未见充血，未见炎性细胞浸润；
[0073]
c小肠结构完整，黏膜层见肠绒毛上皮排列整齐，杯状细胞未见增生或减少，固有层未见炎性细胞增生，肠腺数量适中，黏膜下层未见充血，未见炎性细胞浸润(参见附图4)。
[0074]
脾脏：
[0075]
a组肝脏结构正常：肝细胞索排列整齐，小叶间胆管未见增生，汇管区未见炎性反应；
[0076]
b组肝脏内见少量点状坏死灶(黑色箭头)，坏死组织面积较小，周围见炎性细胞(红色箭头)；汇管区中央静脉周围可见炎性细胞浸润；
[0077]
c组肝脏内见少量炎性反应灶(黑色箭头)，炎性细胞多聚集在汇管区，中央静脉周围，肝细胞结构正常，可见肝窦肝索结构，小叶间胆管未见增生。(参加附图6)。
[0078]
3、小鼠存活及死亡情况
[0079]
复方ⅲ对小鼠的保护效果(见表4)，c组小鼠存活率较高，为其c组小鼠存活率为90％。
[0080]
表4
[0081][0082]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0083]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。