黄芩提取物在制备预防和/或治疗呼吸道病毒感染的药物中的应用的制作方法

1.本发明属于医药领域，具体涉及黄芩提取物在制备预防和/或治疗呼吸道病毒感染的药物中的应用。


背景技术：

2.病毒引起的急性呼吸道感染分病毒性上呼吸道感染和病毒性下呼吸道感染，前者表现为普通感冒、急性咽炎、扁桃体炎、喉炎，后者表现为气管-支气管炎、肺炎。病毒性呼吸道感染发病率高，人群普遍易染，小儿、老人、营养不良及患有慢性病者更易患病，且以冬春季发病较多。其中，流感病毒、冠状病毒因其强感染性和高致死率目前已引起广泛重视。
3.冠状病毒在自然界中广泛存在，其自然宿主包括家畜、禽类、鼠类及野生哺乳类动物等，尤其是有飞翔能力的哺乳动物-蝙蝠，是多种冠状病毒的自然储存宿主，也是病毒扩散、传播及致动物或人类疾病流行的传染源。目前已有研究表明，人冠状病毒感染可致呼吸系统疾病，如支气管炎、毛细支气管炎和肺炎等，2002年冬至2003年春严重急性呼吸综合征(sars)，2012至2014年的中东呼吸综合征均是由冠状病毒感染引起。2019年新型冠状病毒(2019-ncov)是继sars冠状病毒和mers冠状病毒之后新发现的在人类中有高致病性的新型冠状病毒，是引起新型肺炎爆发的原凶。冠状病毒传染性强，人群普遍易感。因病毒爆发突然，且变异性强，目前并未有合适的抗病毒药物进行有效治疗。
4.流感病毒是一种造成人类及动物患流行性感冒的rna病毒，它会造成急性上呼吸道感染，并借由空气迅速的传播，在世界各地常会有周期性的大流行。流感病毒感染将导致宿主细胞变性、坏死乃至脱落，造成粘膜充血、水肿和分泌物增加，从而产生鼻塞、流涕、咽喉疼痛、干咳以及其它上呼吸道感染症状，当病毒蔓延至下呼吸道，则可能引起毛细支气管炎和间质性肺炎。由于流感病毒感染会降低呼吸道粘膜上皮细胞清除和黏附异物的能力，所以大大降低了人体抵御呼吸道感染的能力，因此流感经常会造成继发性感染，由流感造成的继发性肺炎是流感致死的主要死因之一。
5.病毒感染还会诱导干扰素的表达和细胞免疫调理，造成一些自体免疫反应，包括高热、头痛、腓肠肌及全身肌肉疼痛等，病毒代谢的毒素样产物以及细胞坏死释放产物也会造成和加剧上述反应。因此研发抗病毒药物，抵御病毒的感染、传播，治疗缓解相关肺炎等症状，迫在眉睫。
6.中药不仅具有耐药性低、副作用和不良反应少等优点，而且还有抑制病毒复制、调节免疫功能、改善血液循环、解热镇痛及抗菌消炎等综合功效，在防治上呼吸道病毒感染方面具有独特优势和广阔的发展前景。目前报道具有直接抗病毒作用的单味中药大多数为清热解毒类中药，如连翘、金银花、野菊花、黄连、黄芩、大青叶、鱼腥草、柴胡、牛蒡子等。
7.在中药复杂的成分中，“黄酮类物质”是目前研究比较清楚的一类活性成分，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗菌和广泛的抗病毒等作用。研究表明，黄酮类物质不仅通过直接杀灭病毒，阻止病毒的吸附、穿入、复制、转染，更重要的是还能增强机体免疫力，阻止病毒致
细胞病变，改善临床症状，激发调动机体的一切免疫防御系统发挥抗病毒作用。
8.黄芩素、黄芩苷是黄芩中的主要黄酮类物质，近年来研究发现，黄芩素作为苷元，其抑制炎症反应、抗病毒、清除自由基的药理活性均优于黄芩苷。但由于黄芩素在药材中的含量较低，现有文献研究大多集中在黄芩苷或以黄芩苷为主要成分的提取物，对黄芩素及其他有效组分的研究较少；涉及的病毒模型大多为hiv、呼吸道合胞病毒、登革热病毒和h1n1流感病毒、巨细胞病毒、脑炎病毒和单纯疱疹病毒等。


技术实现要素：

9.本发明的目的是提供一种黄芩提取物在制备预防和/或治疗呼吸道病毒感染的药物中的应用。
10.本发明中所述呼吸道病毒感染由下述至少一种病毒引起：冠状病毒、流感病毒。
11.所述冠状病毒具体可为人冠状病毒hcov-oc43；所述流感病毒具体可为流感病毒h3n2(流感病毒a/汉防/359/95)。
12.本发明所述的黄芩提取物中含有黄芩素、千层纸素a和汉黄芩素。进一步地，本发明所述的黄芩提取物中不含黄芩苷。
13.更进一步的，所述黄芩提取物通过酶解-醇提取法提取得到。
14.具体提取方法如下：取黄芩药材加水，在特定温度下进行酶解，干燥至恒重，得到黄芩酶解药粉；称取黄芩酶解药粉，加入无水乙醇或乙醇水溶液进行提取，过滤合并滤液，减压浓缩，真空干燥，即得黄芩素提取物。
15.其中，所述黄芩药材与水的质量比为1：(5-6)，优选1：5。
16.所述酶解的温度为40℃，时间12-24小时，优选24小时，ph值为6-7，优选ph 值为6。
17.所述黄芩酶解药粉与无水乙醇或乙醇水溶液的质量比为1：(10-12)，优选1： 10。所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为50-100％，具体如50％、60％、70％、80％、 95％。
18.所述提取可为回流提取。所述回流提取可提取1次，提取时间可为2h。
19.采用酶解-醇提取法，通过对酶解温度、酶解时间、乙醇加入量等参数控制，可获得黄芩素单一成含量的有效组分提取物。
20.上述酶解是指利用黄芩药材中所含内源酶—β-d-葡萄糖苷酸酶进行酶解。
21.进一步优选的提取方法如下：
22.取黄芩药材适量，加5倍量的水，调ph为6，在40℃下进行酶解24h，干燥至恒重；称取黄芩酶解药粉，加入10倍量的无水乙醇，回流提取2h，提取1次，过滤，滤液减压浓缩，60℃真空干燥，即得黄芩提取物。
23.所述方法还包括对上述黄芩提取物进一步分离的步骤：
24.取预先处理好的大孔树脂lx-38装于树脂柱中，装柱径高比为1：8，反复用去离子水冲柱，使柱内树脂充分压紧，上样时将柱上部去离子水放至与树脂面齐平后开始上样。取黄芩提取物100mg，上样浓度为1mg/ml，以一定速度吸附上样，待上样液面与树脂面齐平时，用0.8bv 30％乙醇进行除杂洗脱，再接着用4bv的50％乙醇、 4bv60％乙醇、3bv的100％乙醇进行洗脱，收集100％乙醇洗脱液，旋干溶剂，真空干燥，即得组分c。
25.或，所述黄芩提取物也可通过酸水解法提取得到。
26.具体提取方法如下：取黄芩药材，加水煎煮，煎液浓缩，酸调ph值至1.0～2.0， 80
℃保温30min，静置过夜，抽弃上清液，得沉淀；沉淀物加水分散均匀加入碱调ph＝7.0，加等体积的体积分数85％乙醇水溶液，搅拌使溶解，抽滤弃沉淀，滤液中加酸调ph 为1.0～2.0，60℃保温30min，静置，抽弃上清液，得沉淀；沉淀依次用水洗、醇洗，减压干燥得黄色粉末；取所述黄色粉末，加入5-6倍量浓硫酸，搅拌均匀，滴加4-5 倍量蒸馏水，放置15min，将此溶液再搅拌中倾入水中，析出黄色沉淀，滤取沉淀用水洗至中性，减压真空干燥，即得黄芩提取物。
27.所述加水煎煮至少进行1次，优选进行两次。
28.每次加水煎煮，所述黄芩药材与水的质量比为1：10，煎煮的时间可为2小时。
29.本发明所述药物包括所述黄芩提取物以及药学上可接受的载体或辅料。
30.进一步的，所述药物还包括药学上可接受的抗病毒的药物或其他相关活性物质。
31.本发明药物的剂型包括口服制剂、注射制剂、经皮给药制剂、粘膜给药制剂、肺部吸入给药制剂或肠道给药制剂；
32.所述药物的剂型包括：滴剂、口服液、片剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂、膜剂、凝胶剂、散剂、乳剂、自乳化制剂(如自微乳)、滴丸剂、栓剂、气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、贴剂、贴膏剂、溶液剂、软膏剂或乳膏剂。
33.本发明药物可用任何公知的给药方法给药。
34.本发明药物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。上述给药剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其他治疗手段的方案。
35.本发明药物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的药物与其他治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。
36.与现有技术相比，本发明具有如下有益技术效果：
37.本发明通过提取分离制备的以黄芩素为主要成分的黄芩提取物，对特定病毒株的冠状病毒具有良好的抑制作用，将黄芩提取物进一步分离纯化，制备的以汉黄芩素为主要成分的提取物，也对特定病毒株的冠状病毒和流感病毒具有良好的抑制作用，实验中也发现提取物中黄芩素含量并非是越高抗病毒效果就越好，黄芩提取物也并非对所有的冠状病毒或流感病毒均有抑制作用，通过本发明可为抗呼吸道病毒感染的药物研制提供方向。
附图说明
38.图1为黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素a的混合对照品溶液及黄芩提取物1～4的hplc图，a表示混合对照品溶液的hplc图，b表示提取物1的hplc图， c表示提取物2的hplc图，d表示提取物3的hplc图，e表示提取物4的hplc图(其中 1为黄芩苷，2为黄芩素，3为汉黄芩素，4为千层纸素a)；
39.图2为黄芩素、汉黄芩素、千层纸素a的混合对照品溶液及组分b、c的hplc图， a表示混合对照品溶液的hplc图，b表示组分b的hplc图，c表示组分c的hplc图(其中1为黄芩素，2为汉黄芩素，3为千层纸素a)；
40.图3为组分c抗流感病毒蛋白结果；
41.图4为组分c抗流感病毒mrna结果；
42.图5为组分c抗冠状病毒蛋白结果；
43.图6为组分c抗冠状病毒mrna结果。
具体实施方式
44.下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
45.实施例1、采用酶解-醇提取法制备黄芩提取物1～2
46.酶解-醇提取法制备工艺流程：取黄芩药材，加一定量的水，在一定温度下进行酶解(内源酶—β-d-葡萄糖苷酸酶进行酶解)，干燥至恒重；称取酶解药粉，加入一定量的无水乙醇回流提取，过滤，滤液减压浓缩，60℃真空干燥，即得黄芩提取物。
47.采用酶解-醇提取法，通过调研，酶解溶剂(水)范围设定为4、5、6、7、8倍，酶解温度范围设定为40℃、50℃、60℃、70℃，酶解时间范围设定为4h、6h、8h、 12h、24h，酶解ph范围设定为3、4、5、6、7，在10倍量的100％乙醇回流提取2h，提取1次，以所得提取物中黄芩素、汉黄芩素、千层纸素三者含量之和为指标，考察上述反应参数。
48.在酶解时间24h，酶解ph＝5，酶解温度40℃条件下，考察酶解溶剂(水)的加入量对黄芩素、汉黄芩素、千层纸素三者含量之和的影响，见表1。
49.表1
[0050][0051]
由表1可见，酶解溶剂倍量为5倍量时，以所得提取物中黄芩素、汉黄芩素、千层纸素三者含量之和相对较高。
[0052]
在酶解溶剂(水)5倍量，酶解时间24h，酶解ph＝5条件下，考察酶解温度对黄芩素、汉黄芩素、千层纸素三者含量之和的影响，见表2。
[0053]
表2
[0054][0055]
由表2可知，酶解温度为40℃时，提取物中黄芩素、汉黄芩素、千层纸素a三者含量之和相对较高。
[0056]
在酶解溶剂(水)5倍量，酶解温度酶解温度为40℃，酶解ph＝5条件下时，考察酶解时间对黄芩素、汉黄芩素、千层纸素三者含量之和的影响，见表3。
[0057]
表3
[0058][0059][0060]
由表3可知，酶解时间为24h时，提取物中黄芩素、汉黄芩素、千层纸素三者含量之和相对较高。
[0061]
在酶解溶剂(水)倍量5倍量，酶解温度40℃，酶解时间为24h条件下，考察酶解ph对黄芩素、汉黄芩素、千层纸素三者含量之和的影响，见表4。
[0062]
表4
[0063][0064]
由表4可知，酶解ph值为6时，提取物中黄芩素、汉黄芩素、千层纸素三者含量之和相对较高。
[0065]
综上，由表1-4可知，酶解溶剂加入量为5倍量，酶解温度为40℃，酶解时间为 24h，酶解ph＝6，得到所得提取物中黄芩素、汉黄芩素、千层纸素三者含量之和相对较高。
[0066]
以上述参考指数为基础，暂定乙醇浓度为100％，回流提取时间为2h，回流提取次数为1次，考察乙醇加入的倍量，对提取物中黄芩素、汉黄芩素、千层纸素三者含量之和的影响，结果见表5。
[0067]
表5
[0068][0069]
由表5可知，乙醇倍量为10倍时，提取物中黄芩素、汉黄芩素、千层纸素三者含量之和相对较高。
[0070]
在酶解溶剂，酶解温度，酶解时间，酶解ph值不变条件下，选定乙醇倍量为10 倍，乙醇浓度为100％，回流提取时间为2h条件下，考察回流提取次数对提取物中黄芩素、汉黄芩素、千层纸素三者含量之和的影响，结果见表6。
[0071]
表6
[0072]
[0073]
由表6可知，回流提取次数为1次时，提取物中黄芩素、汉黄芩素、千层纸素三者含量之和相对较高。
[0074]
在酶解溶剂，酶解温度，酶解时间，酶解ph值不变条件下，选定乙醇倍量为10 倍，乙醇浓度为100％，回流提取次数为1次条件下，考察回流提取时间对提取物中黄芩素、汉黄芩素、千层纸素三者含量之和的影响，结果见表7。
[0075]
表7
[0076][0077]
由表7可知，回流提取时间为2h时，提取物中黄芩素、汉黄芩素、千层纸素三者含量之和相对较高。
[0078]
在酶解溶剂，酶解温度，酶解时间，酶解ph值不变条件下，选定乙醇倍量为10 倍，回流提取次数为1次，回流提取时间为2h条件下，考察乙醇浓度对提取物中黄芩素、汉黄芩素、千层纸素三者含量之和的影响，结果见表8。
[0079]
表8
[0080][0081]
由表8可知，乙醇浓度为100％时，提取物中黄芩素、汉黄芩素、千层纸素三者含量之和相对较高。
[0082]
综上，从表1-表8可知，采用酶解-醇提取法对黄芩提取时，以黄芩素、汉黄芩素、千层纸素三者含量之和为指标，选定的提取条件为，酶解溶剂加入量为5倍量，酶解温度为40℃，酶解时间为24h，酶解ph＝6，乙醇倍量为10倍，乙醇浓度为100％，回流提取次数为1次，回流提取时间为2h。
[0083]
在酶解溶剂倍量、酶解温度，酶解时间，酶解ph值，乙醇倍量，回流提取次数，回流提取时间不变下，选用不同的乙醇浓度进行提取，得到提取物中黄芩素、汉黄芩素、千层纸素三者含量最高和最低两种提取物，分别为黄芩提取物1、黄芩提取物2。
[0084]
黄芩提取物1具体制备方法为：取黄芩药材适量，加5倍量的水，调ph为6，在 40℃下进行酶解24h，干燥至恒重；称取黄芩酶解药粉，加入10倍量的无水乙醇，回流提取2h，提取1次，过滤，滤液减压浓缩，60℃真空干燥，即得黄芩提取物1。
[0085]
黄芩提取物2具体制备方法为：取黄芩药材适量，加5倍量的水，调ph为6，在40℃下进行酶解24h，干燥至恒重；称取黄芩酶解药粉，加入10倍量的50％乙醇，回流提取2h，提取1次，过滤，滤液减压浓缩，60℃真空干燥，即得黄芩提取物2。
[0086]
实施例2、采用酸解法制备黄芩提取物3～4
[0087]
酸水解法制备工艺流程：取黄芩药材，水煎煮，煎液浓缩，2mol/l盐酸调ph值至1.0
～2.0，80℃保温30min，静置过夜，抽弃上清液，得沉淀；沉淀物加水分散均匀加入40％氢氧化钠调ph＝7.0，加等量85％乙醇，搅拌使溶解，抽滤弃沉淀，滤液中加 2mol/l盐酸调ph为1.0～2.0，60℃保温30min，静置，抽弃上清液，得沉淀；沉淀依次用水洗、醇洗，减压干燥得黄色粉末；取上述黄色粉末适量，加入浓硫酸适量，用玻璃棒搅匀，滴加蒸馏水，放置15min，将此溶液再搅拌中倾入水中，析出黄色沉淀，滤取沉淀用水洗至中性，减压真空干燥，即得黄芩提取物。
[0088]
采用酸水解法，通过对浓硫酸用量的控制及考察，获得黄芩素含量为80％以上的黄芩提取物，分别为黄芩提取物3、黄芩提取物4。
[0089]
黄芩提取物3具体制备方法：取黄芩药材，加10倍量的水煎煮2小时，煎煮两次，合并两次煎液并浓缩，2mol/l盐酸调ph值至1.0～2.0，80℃保温30min，静置过夜，抽弃上清液，得沉淀；沉淀物加水分散均匀加入40％氢氧化钠调ph＝7.0，加等量85％乙醇，搅拌使溶解，抽滤弃沉淀，滤液中加2mol/l盐酸调ph为1.0～2.0， 60℃保温30min，静置，抽弃上清液，得沉淀；沉淀依次用水洗、醇洗，减压干燥得黄色粉末；取上述黄色粉末适量，加入5倍量浓硫酸，用玻璃棒搅匀，滴加4倍量的蒸馏水，放置15min，将此溶液再搅拌中倾入水中，析出黄色沉淀，滤取沉淀用水洗至中性，减压真空干燥，即得黄芩提取物3。
[0090]
黄芩提取物4具体制备方法：取黄芩药材，加10倍量的水煎煮2小时，煎煮两次，合并两次煎液并浓缩，2mol/l盐酸调ph值至1.0～2.0，80℃保温30min，静置过夜，抽弃上清液，得沉淀；沉淀物加水分散均匀加入40％氢氧化钠调ph＝7.0，加等量85％乙醇，搅拌使溶解，抽滤弃沉淀，滤液中加2mol/l盐酸调ph为1.0～2.0， 60℃保温30min，静置，抽弃上清液，得沉淀；沉淀依次用水洗、醇洗，减压干燥得黄色粉末；取上述黄色粉末适量，加入6倍量浓硫酸适量，用玻璃棒搅匀，滴加 5倍量蒸馏水，放置15min，将此溶液再搅拌中倾入水中，析出黄色沉淀，滤取沉淀用水洗至中性，减压真空干燥，即得黄芩提取物4。
[0091]
实施例3、黄芩提取物的含量测定
[0092]
1.供试品溶液制备
[0093]
精密称取提取物约15mg，置25ml量瓶中，加入含0.02％vc的95％乙醇溶液超声溶解，并定容至刻度，摇匀。精密移取上述溶液1ml置25ml量瓶中，用含002％vc 的95％乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。
[0094]
2.对照品溶液制备
[0095]
另精密称取对照品适量，同法制备成每毫升含有黄芩苷19.23μg、黄芩素19.66μg、汉黄芩素7.98μg、千层纸素a5.14μg的混合对照品溶液。量取供试品溶液和对照品溶液10μl，按“3.色谱条件”进样，记录各色谱峰面积，按外标法计算各成分含量。
[0096]
3.色谱条件
[0097]
采用高效液相色谱法，diamonsil c18色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm)，甲醇-0.05％磷酸水溶液(65:35，v/v)为流动相等度洗脱，流速：1ml/min，柱温：25℃，进样量： 10μl，检测波长：275nm。
[0098]
4.结果
[0099]
对照品及黄芩提取物1～4样品色谱图见图1，含量检测结果见表9。
[0100]
表9提取物1～4样品的含量测定结果
[0101][0102]
注：“/”表示不含有该成分。
[0103]
由图1可看出，提取物1～4均不含有黄芩苷。
[0104]
实施例4、黄芩提取物1～4抗病毒药效试验研究
[0105]
1.抗冠状病毒hcov-oc43活性筛选
[0106]
1.1测试原理
[0107]
以mrc-5(人胚肺成纤维)细胞为病毒宿主，测定样品抑制病毒引起的细胞病变程度(cpe)。
[0108]
1.2测试材料和方法
[0109]
(1)病毒株：冠状病毒hcov-oc43，-80℃保存。
[0110]
(2)样品处理：样品临用前用dmso配成母液，再用培养液作3倍稀释，各8个稀释度。
[0111]
(3)阳性对照药：利巴韦林(rbv)，湖北天药药业股份有限公司(批号31712252)。
[0112]
(4)测试方法：mrc-5细胞种96孔培养板，24小时后感染冠状病毒10-2
，加入含有不同稀释度样品及阳性对照药的维持液，同时设细胞对照孔和病毒对照孔，待病毒对照组病变程度(cpe)达4 时观察各组细胞病变程度(cpe)，reed-muench计算样品对病毒的半数抑制浓度(ic
50
)。
[0113]
1.3结果
[0114]
结果见表10。结果表明，与抗病毒药物利巴韦林阳性药物相比，黄芩提取物1～4 均显示良好的抗冠状病毒活性，其中提取物1抗冠状病毒hcov-oc43活性最强，提示黄芩素含量并非是越高抗冠状病毒效果就越好。随后申请人对提取物1进行了分离，见实施例5。
[0115]
表10黄芩提取物1～4抗冠状病毒hcov-oc43试验结果
[0116][0117]
注：(1)tc
50
：药物半数有毒浓度；ic
50
：药物对病毒半数抑制浓度；si：即选择指数，其值等于tc
50
/ic
50
，为判断药物效果的安全指标，理论上，选择指数si》1，表示药物有效且安全，si值越大药物越安全。
[0118]
2.抗冠状病毒hcov-229e活性筛选
[0119]
2.1测试原理
[0120]
以h460细胞为病毒宿主，测定样品抑制病毒引起细胞病变程度(cpe)。
[0121]
2.2测试材料和方法
[0122]
(1)病毒株：冠状病毒hcov-229e，-80℃保存。
[0123]
(2)样品处理：样品临用前用dmso配成母液，再用培养液作3倍稀释，各8个稀释度。
[0124]
(3)阳性对照药：利巴韦林(rbv)，湖北天药药业股份有限公司(批号31712252)。
[0125]
(4)测试方法：h460细胞接种96孔培养板，置5％co2，35℃培养。24小时后感染冠状病毒10-3
，同时加入含有不同稀释度样品及阳性对照药的维持液，同时设细胞对照孔和病毒对照孔，5％co2，35℃培养。待病毒对照组病变程度(cpe)达4 时观察各组细胞病变程度(cpe)，用reed-muench法分别计算样品对细胞的半数有毒浓度 (tc
50
)和对病毒的半数抑制浓度(ic
50
)。
[0126]
2.3结果
[0127]
结果见表11。结果表明，黄芩提取物1对冠状病毒hcov-229e未表现出活性。
[0128]
表11黄芩提取物1抗冠状病毒hcov-229e试验结果
[0129][0130]
注：(1)tc
50
：药物半数有毒浓度；ic
50
：药物对病毒半数抑制浓度；si：选择指数，si＝tc
50
/ic
50
。
[0131]
实施例5、组分b和组分c的制备
[0132]
取预先处理好的大孔树脂lx-38装于树脂柱中，装柱径高比为1：8，反复用去离子水冲柱，使柱内树脂充分压紧，上样时将柱上部去离子水放至与树脂面齐平后开始上样。取实施例1制备的黄芩提取物1(100mg)，上样浓度为1mg/ml，以一定速度吸附上样，待上样液面与树脂面齐平时，用0.8bv 30％乙醇进行除杂洗脱，再接着用 4bv的50％乙醇、4bv的
60％乙醇、3bv的100％乙醇进行洗脱，分别收集60％乙醇、 100％乙醇洗脱液，旋干溶剂，真空干燥，即得组分b(60％乙醇洗脱液)和组分c(100％乙醇洗脱液)。
[0133]
实施例6、组分b和组分c的含量测定
[0134]
1.供试品溶液配制
[0135]
精密称取样品10mg，置100ml量瓶中，用无水乙醇溶解完全并定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液储备液。精密移取上述储备液0.5ml置50ml量瓶中，用无水乙醇稀释定容至刻度，即得。
[0136]
2.对照品溶液配制
[0137]
称取对照品适量，加入无水乙醇配制成每毫升含黄芩素30μg、汉黄芩素8μg、千层纸素a4μg的混合对照品溶液。
[0138]
3.色谱条件
[0139]
同实施例2中“3色谱条件”。
[0140]
4.结果
[0141]
混合对照品溶液及组分b、c的色谱图见图2，含量测定结果见表12。
[0142]
表12组分b、c含量测定结果
[0143][0144]
实施例7、组分b、c抗冠状病毒hcov-oc43活性筛选
[0145]
1测试原理
[0146]
以h460细胞为病毒宿主，测定样品抑制病毒引起细胞病变程度(cpe)。
[0147]
2测试材料和方法
[0148]
(1)病毒株：冠状病毒hcov-oc43，-80℃保存。
[0149]
(2)样品处理：样品临用前用dmso配成母液，再用培养液作3倍稀释，各8个稀释度。
[0150]
(3)阳性对照药：利巴韦林(rbv)，湖北天药药业股份有限公司(批号31712252)。
[0151]
(4)测试方法：h460细胞接种96孔培养板，置5％co2，35℃培养。24小时后感染冠状病毒10-3
，同时加入含有不同稀释度样品及阳性对照药的维持液，同时设细胞对照孔和病毒对照孔，5％co2，35℃培养。待病毒对照组病变程度(cpe)达4 时观察各组细胞病变程度(cpe)，用reed-muench法分别计算样品对细胞的半数有毒浓度 (tc
50
)和对病毒的半数抑制浓度(ic
50
)。
[0152]
3结果
[0153]
结果见表13。结果表明，组分c具有一定的抗冠状病毒hcov-oc43活性，其余受试药物均未表现出活性。
[0154]
表13组分b、c抗冠状病毒hcov-oc43试验结果
[0155][0156]
注：(1)表中
“–”
表示样品在最大无毒剂量无抗病毒活性。
[0157]
(2)tc
50
：药物半数有毒浓度；ic
50
：药物对病毒半数抑制浓度；si：即选择指数，其值等于tc
50
/ic
50，
为判断药物效果的安全指标，理论上，选择指数si》1，表示药物有效且安全，si值越大药物越安全。对比例1、组分b、c抗冠状病毒hcov-229e活性筛选
[0158]
1测试原理
[0159]
以h460细胞为病毒宿主，测定样品抑制病毒引起细胞病变程度(cpe)。
[0160]
2测试材料和方法
[0161]
(1)病毒株：冠状病毒hcov-229e，-80℃保存。
[0162]
(2)样品处理：样品临用前用dmso配成母液，再用培养液作3倍稀释，各8个稀释度。
[0163]
(3)阳性对照药：利巴韦林(rbv)，湖北天药药业股份有限公司(批号31712252)。
[0164]
(4)测试方法：h460细胞接种96孔培养板，置5％co2，35℃培养。24小时后感染冠状病毒10-3
，同时加入含有不同稀释度样品及阳性对照药的维持液，同时设细胞对照孔和病毒对照孔，5％co2，35℃培养。待病毒对照组病变程度(cpe)达4 时观察各组细胞病变程度(cpe)，用reed-muench法分别计算样品对细胞的半数有毒浓度 (tc
50
)和对病毒的半数抑制浓度(ic
50
)。
[0165]
3结果
[0166]
结果见表14。结果表明，组分b、c对冠状病毒hcov-229e均未表现出活性。
[0167]
表14组分b、c抗冠状病毒hcov-229e试验结果
[0168]
[0169]
注：tc
50
：药物半数有毒浓度；ic
50
：药物对病毒半数抑制浓度；si：即选择指数，其值等于tc
50
/ic
50，
为判断药物效果的安全指标，理论上，选择指数si》1，表示药物有效且安全，si值越大药物越安全。
[0170]
实施例8、组分c抗流感病毒和冠状病毒的蛋白和mrna试验
[0171]
1抗流感病毒蛋白和mrna试验
[0172]
1.1western blot法检测蛋白表达
[0173]
mdck细胞(每毫升5
×
105)接种于12孔板中培养过夜，pbs洗涤1次后用流感病毒株a/汉防/359/95(h3n2)1/210-4
感染细胞2h，感染后2h加入不同浓度待测药液和阳性对照药。培养24h后提取细胞总蛋白，进行western blot检测。β-actin一抗(1:1000) 和m2一抗(1:400)均4℃孵育过夜，tris-hcl缓冲盐溶液(tris-hcl buffer salinetween,tbst)洗3次后孵育辣根过氧化物酶标记的二抗1h，tbst洗二抗3次后，加增强型化学发光(enhanced chemiluminescent，ecl)显影液(thermo公司)，利用凝胶成像仪进行显影。
[0174]
1.2荧光定量法检测蛋白mrna表达
[0175]
mdck细胞(每毫升5
×
105)接种于24孔板中培养过夜，pbs洗涤1次后用流感病毒株a/汉防/359/95(h3n2)1/2 10-4
感染细胞2h，感染后2h加入不同浓度待测药液和阳性对照药。培养24h后用rneasy mini kit提取细胞内总rna，流感病毒m2的mrna 表达水平用荧光定量法检测。
[0176]
1.3结果
[0177]
结果见图3、图4。结果显示，组分c能剂量依赖性抑制季节性流感病毒株a/汉防/359/95(h3n2)的蛋白m2表达和m2的mrna水平。综上可得，组分c具有很好的抗流感病毒作用。
[0178]
2抗冠状病毒hcov-oc43蛋白和mrna结果
[0179]
2.1western blot法检测蛋白表达
[0180]
h460细胞按照1.5
×
105/ml铺12孔板，37℃培养过夜，按照moi＝0.005感染 hcov-oc43，同时加入梯度浓度药物，35℃培养48hr后提取蛋白，western blot检测 np蛋白表达水平。
[0181]
2.2荧光定量法检测蛋白mrna表达
[0182]
h460细胞按照1.5
×
105/ml铺12孔板，37℃培养过夜，按照moi＝0.005感染 hcov-oc43，同时加入梯度浓度药物，35℃培养24hr后提取rna，qpcr检测np蛋白mrna表达水平。
[0183]
2.3结果
[0184]
结果见图5、图6。结果表明，组分c在浓度为20μg/ml、10μg/ml及5μg/ml时均能够抑制hcov-oc43蛋白水平和mrna水平，抑制率可达70％以上。综上可得，组分c具有很好的抗冠状病毒作用。