特定组织状态的质谱测定的制作方法

特定组织状态的质谱测定
1.本技术是基于2018年12月14日提交的、申请号为201811533314.2、发明创造名称为“特定组织状态的质谱测定”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及从空间分辨质谱信号的在组织学的组织切片中特定组织状态(例如肿瘤组织变性)的空间分布的测定和可视化。


背景技术：

3.参见图1,通过质谱成像分析(质谱成像，ims)获得薄组织切片的空间分辨质谱。为此，例如使用切片机(microtome)产生来自人类、动物或甚至植物个体的感兴趣的器官的深度冷冻组织片的薄组织切片(10)，并将其放在样本载玻片(30)上(步骤a)。当将maldi方法用于电离(maldi＝基质辅助激光解吸电离)时，随后将吸收激光能量的基质(60)应用到样本表面；这可以通过将基质溶液(40、50)间歇喷涂到薄组织切片(10)上来完成(步骤b)；参见例如de102006019530b4、gb2437623b、us7667196b2；m.sch
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renberg。已经为随后的质谱采集建立了光栅扫描方法。
4.光栅扫描方法包括在maldi质谱仪中用聚焦激光束脉冲(70)扫描薄组织切片，以产生用于组织成分的一维或二维强度分布，可在质谱中检测到该一维或二维强度分布(200)(步骤c)；参见例如us5808300；f.caprioli。因此，用精细聚焦的激光脉冲(70)至少照射每个光栅点一次，且该光栅点提供可以覆盖大范围分子量(例如1至30千道尔顿(1道尔顿＝1原子质量单位u))的质谱。在现代飞行时间质谱仪中，光栅点的直径仅为大约5微米；可以获得高达每秒一万个质谱(200)。直径约5微米的精细光栅点增加了每个分析物分子的离子产率(80)，因此原则上是优选的。然而，由于薄组织切片的材料通过持续的激光照射而耗尽，因此只能从这样的精细光栅点获得非常少量的质谱(200)。
5.改善光谱质量的方法包括将组织表面划分成稍大的像素，并为这些像素中的每一个产生较好质量的质谱。例如，可以在光栅扫描中对像素进行采样，并且可以对来自该像素的所有质谱进行求和，而不考虑组织类型。或者对通过精细光栅扫描获得的小区域(即像素区域)的质谱进行简单地求和。然而，也可以通过像素尺寸的激光点产生像素的质谱，并且利用在同一目标区域上的许多重复激光照射来获取像素的质谱，同样通过求和产生更好质量的质谱。像素优选为正方形，以便完全覆盖组织；它们的边长可以为10微米至200微米。
6.可以通过适当的软件从像素的质谱生成所谓的“质量图像”。这包括在光谱中选择表征肽或蛋白质的离子质量，或围绕该质量的小质量范围，并在薄组织切片的区域上以图形方式显示其强度分布。例如，这使得鼠脑中神经肽的分布，或者待描述的阿尔茨海默(alzheimer)动物模型的脑中β-淀粉样蛋白肽的分布，与特定的形态特征相关成为可能。
7.这种具有质量图像的简单方法的显着缺点在于以下事实：迄今为止在这样的光谱中仅分析地发现了少量具有相对高浓度的特征，例如对于组织样本中的特定组织状态是特别典型的高浓度的肽。该途径迄今为止限制了该方法，并且阻止了更广泛应用于那些组织
状态，这不能归因于一个单个肽或蛋白质的出现。
8.与这些类型的成像方法无关，对“标志物”的靶向搜索已经发展成临床导向研究的令人关注的领域(w.pusch等，pharmacogenetics 2003；4463-476)。这通常涉及体液(例如血液、尿液或脊髓液)以及组织提取物，通过用色谱相提取、固相提取或其他选择性方法将体液处理成具有不太复杂的分析物成分的粗级分，然后用质谱表征。由此获得的质谱显示出源自肽和蛋白质的质量信号的或多或少复杂的模式。通过比较来自健康和患病个体样本的质谱，可以找到肽或蛋白质，这些肽或蛋白质(单独或一起，有时在强度比的特定限度内)是个体健康状态的特征。
9.图2示出了来自w.pusch等人的上述工作的适当的表示。在第一步骤(左)中，使用包含变性和正常样本的一组训练数据来发现生物标志物模式。已经预先确定了所有训练数据样本的临床诊断。然后，生物信息学程序应用不同的数学算法，根据上调或下调(甚至唯一)的信号的生物标志物模式确定预测模型。在第二步骤(中间的)中，通过对一组验证数据进行分类来评估生物标志物模式。与训练数据一样，该组也包含具有已知临床诊断的变性和正常样本。使用前一步骤中生成的预测模型来预测样本的分类(正常或变性)。在例示中，借助于两种生物标志物x和y的模式例示分析。因此，只需要考虑两个维度x和y。然而，该原理可以容易地扩展到n维空间中的n个生物标志物的模式。然后通过计算灵敏度和特异性以及阳性和阴性预测值来评估得到的样本总体性，并且该类预测/独立验证导致对这些参数的更好评估。如果预测模型的质量可靠，则可以通过该模型对未知样本进行分类(步骤3，右栏)。
10.也可以通过成像质谱将以这种方式已经获得的标志物用于组织分化。专利说明书de102004037512b4(us7873478b2；gb2418773b；j.franzen、m.sch
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renberg、d.suckau)描述了标志物如何用于组织状态的图形表示。该专利说明书及其所有内容应通过引用包含在此。
11.然而，遗憾的是，通常情况是来自组织的单个质谱的质量不足以确定无疑地检测标志物。标志物通常如此弱以至于它们不能在背景下充分突出，或者信号强度的精度如此低以至于不能以足够的精度确定用于标志物的不同信号强度的比率的附加条件。
12.发明目的
13.由于光谱质量不够高，通常不能以足够的确定性来检测来自各个像素的质谱的组织状态和组织变性的已知标志物。本发明的一个目的是提供一种方法，该方法组合所获得的质谱以提高质量，从而可以进行质谱组织状态分化和特定组织状态的识别。


技术实现要素：

14.这里，术语“特定组织状态”，在极限情况下也是“组织变性”，应理解为按照以下方面的组织切片的区域状态：应力、病理变化、感染、由异生物质的影响带来的变化、由基因工程带来的变化、由突变引起的变化、特定的代谢表型或与该组织的正常状态相比的其他变化。特别强调的是癌组织的区域。
15.变性组织的质谱能够与未变性组织的质谱不同，但通常它们非常相似。轻微差异通常不是变异的特征，因此不能用于识别变性。然而，变性组织的质谱可包含所谓的“标志物”，其可用于质谱分析地识别组织变性。标志物是质谱中物质信号的特定特征强度模式
(也称为质量信号分布或质量信号特征)，其指示特定的组织状态。这里的物质可能是肽或蛋白质，其被过低或过度表达从而产生一种模式，但它们也可能包括蛋白质的翻译后修饰、它们的降解产物、内源性代谢物或其他物质(如脂质、聚糖、糖类、或甚至是药物)在组织中的积累。标志物可包括单个质量信号或几个质量信号。在几个质量信号的情况下，可以应用彼此具有特定比率的信号强度的条件。标志物可以非常弱并且特征比可以具有非常窄的限制：因此，为了提高质量，则必须组合光谱以便以足够的精度呈现信号强度。
16.本发明提出了一种方法，此外，利用该方法，在不提供任何其他先前信息(“无监督”)的情况下确定具有相似质谱的组织区域，并且对这些区域的质谱求和，以便将光谱质量提高到这样的程度，即能够确定地识别组织状态和组织变性的已知标志物的概率显着增加。具有相似质谱的区域可以大规模互连，但也可以小规模地彼此隔离。
17.例如，对于光谱库中的同一性搜索，已知用于确定质谱与相似度的评估系数的相似性的方法。在下文中，当它们的相似性的比较超过相似度的评估系数的设定阈值时，质谱被认为彼此相似。
18.本发明基于以下经验：变性的组织通常形成显示相似质谱的互连区域。然而，很可能相同的薄组织切片的其他区域显示相同的组织类型，但是没有变性。本发明的一个关注点是区分这些区域。
19.为了找到具有相似质谱的组织区域，可以针对它们的相似性来互相对照检查所有像素的质谱，但是这需要非常大量的相似性测定。对于仅具有约100*100像素(一万个质谱)的小片组织，则5
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107(5000万)个相似性测定已经是必要的。如果将与所选像素的质谱相似的那些质谱从对其他像素的进一步相似性测定中排除，则可以减少数量n
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(n-1)/2，其大致对应于像素数n的平方的一半。
20.此外，提出了一种需要多个相似性测定的方法，该多个相似性仅略微大于像素数n。为此，随机选择多个像素(“随机种子”)，并且现在将每个随机种子的质谱与来自周围环境的像素的质谱进行比较。只要质谱与原始随机种子的相似性高于指定阈值或大于与相邻随机种子的相似性，就可以在所有方向上继续与周围环境的质谱的比较。以这种方式找到具有相似质谱的像素的初始互连区域，即，如所有经验所示，属于相同组织类型的区域，无论是否变性。当区域中的像素数达到设定值时，能够(但不是必须)终止计算。通过重复该方法分配在第一次运行之后未分配给任何区域的像素。然后从尚未分配的像素中选择新的随机种子。可以在必要时重复该方法，直到薄组织切片的感兴趣区域基本上被覆盖。
21.针对标志物存在，检查来自互连区域(或仅来自该区域的一部分)的每个总和质谱。因此，明确含有标志物的区域被确定为属于特定组织状态。然后可以在质谱图像中相应地标记组织表面上的对应像素或位置。如果几个区域含有不明确的标志物指示，则可以将它们的质谱求和，以便提高的质量增加标志物识别的确定性。在这种情况下，也可以使用和光谱确定组织状态的特征，然后将其分配给组织切片上的各个像素或区域。
22.在进行标志物搜索之前，还可以确定在每种情况下是否存在标志物实际适合的组织类型。一些标志物仅针对一种或仅几种组织类型。
附图说明
23.通过参考以下说明可以更好地理解本发明。例示中的元件不一定按比例绘制，而
spectrometry(使用基质辅助激光解吸/电离质谱法进行自动细菌鉴定的算法)”)阐述了用于库的参考光谱的生成和用于调查中的样本的质谱与库的参考光谱之间的相似性分析的计算方法。然而，必须针对每个参考光谱确定平均质量、平均质量周围的扩散/范围(spread)、平均强度、平均强度周围的扩散以及重复光谱中该质量信号出现的百分比频率，因此这种方法不是优选的。
33.为了识别微生物，质谱中的信号质量是至关重要的。信号的强度只是次要的。与此相反，生物体中的不同组织状态通常不通过在不同质量处发现的信号来区分。更常见的情况是观察到相同的质量信号，但它们的强度不同。遗憾的是，单独光谱中信号的信噪比通常不足以在单独光谱中进行可靠的信号检测(参见图3，右侧的光谱)。例如，可以通过以下方式解决该问题：通过在平均光谱上执行信号检测，或者通过从各个光谱确定信号位置，然后从原始数据确定信号位置处的每个单独光谱的强度值(例如，经由信号位置周围的质量间隔确定平均值或最大值)。
34.作为两个或更多个质谱的相似性测定的基础，例如，每个质谱可以被认为是身份值/标识值的矢量。该矢量可以包含光谱的所有质量值；然而，先前的特征检测通常用于仅选择信号实际存在于无所不在(omnipresent)的背景(所谓的“peak picking(峰值拾取)”，参见例如de19808584 c1；gb2334813b；us6288389b1；j.franzen)之上的那些质量值。然后可以使用所有已知的确定矢量相似性的方法来确定相似性值。例如，这些是明氏(minkowski)距离、或者特别是欧几里德(euclidian)距离和街区(city-block)(或曼哈顿(manhattan))距离、余弦距离、皮尔森(pearson)相关性等。
35.为了找到具有相似质谱的组织区域，针对其相似性，可以相对于彼此检查组织切片上所有n个像素的质谱。该过程导致非常多的相似性测定。对于仅具有约100*100像素(一万个质谱)的小片组织，则已经需要大约5
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107(5000万)个相似性测定。然后，所需的数量m由表达式m＝n
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(n-1)/2表示，其大致对应于像素数n的平方的一半。如此大量的光谱比较需要长的计算时间，这可以通过现代计算机来实现。然而，如果其相似性高于指定阈值的起始像素的比较像素的质谱被排除在进一步的相似性测定之外，则可以有利地减少计算时间。
36.为了进一步减少计算时间，此外提出了一种需要多个相似性测定的方法，其仅略微大于像素数n。为此，随机选择多个像素(“随机种子”)，并且现在将每个随机种子的质谱与来自周围环境的像素的质谱进行比较。只要质谱与原始随机种子的相似性高于指定阈值或大于与相邻随机种子的相似性，就可以在所有方向上继续与来自周围环境的质谱的比较。以这种方式找到具有相似质谱的像素的初始互连区域，即，如所有经验所示，属于相同组织类型的区域，无论是否变性。
37.当区域中的像素数达到设定值时，可以(但不一定)终止计算。通过重复该方法对第一次运行之后未分配给任何区域的像素进行分配。然后从尚未分配的像素中选择新的随机种子。可以每当需要时重复该方法，直到薄组织切片的感兴趣区域基本上被覆盖。
38.当基本上已经找到所有区域时，针对相似性，检查来自不同互连区域的质谱，以便确定相同组织的隔离区域。
39.异常组织状态的标志物可能仅对单一组织类型是特殊的。在进行已知标志物的搜索之前，因此需要确定是否存在组织类型，可以肯定的是，标志物实际上适合于该组织类
型。
40.如果找到具有可以使用标志物的组织类型的区域，那么现在将来自这样的区域的质谱求和，至少只要光谱的质量足够高以便能够毫无疑问地确定存在标志物。如果该区域中的质谱数不足以进行确定的识别，则通常可以确定标志物以某一概率是否存在或者是否其根本不存在。可以对相同组织类型的所有区域进行该检查。然后可以将标志物可能存在的那些区域的质谱求和。因此可以特别地增强光谱质量，直到确定这些区域的组织正常或变性，即处于特定状态。
41.结果可以是仅该组织类型的一些区域表现出异常组织状态的标志物，而该组织类型的其他区域处于正常状态。然而，这种情况往往相当不寻常，因为感染、应激或以其他方式不同的组织通常也不同于标志物外的质谱中的正常组织，尽管只是轻微的，因此具有相似质谱的互联的组织区域通常处于同一状态。
42.该基本方法的另一个实施例在于首先用已知方法确定相同组织的区域，然后对来自这些区域的如此多的质谱求和，使得光谱质量足够高以能够识别已知标志物。从de102010009853b4(t.alexandrow；对应于us8605968b2和gb2478398b)获知这种通过保边平滑(edge-preserving smoothing)各个质量的图像来确定组织区域的方法。也可以使用光学显微镜方法确定组织区域。为此，可以在获得质谱后去除基质层，并且可以用常规方法对薄组织切片进行染色并在显微镜下对其进行检查(参见s.o.deininger和a.walch：de102008023438b4、ep2124192b1)。
43.该基本方法的另一实施例使用来自库的组织类型的参考质谱作为相似质谱区域的搜索的起始点。选择组织类型的参考光谱，其中已知标志物用于所寻求的组织应力。对于该参考质谱，在组织中寻找类似的质谱。可以对来自这里发现的组织区域的质谱再次求和，就像在上述方法中一样，从而获得这样的高光谱质量，使得已知标志物变得可识别。
44.所有描述的用于识别特定状态的组织的方法始于使用切片机形成薄组织切片，优选来自深度冷冻的组织片或嵌入有机固体材料(例如石蜡)中并化学固定(例如福尔马林固定)的组织块。将薄组织切片置于合适的支撑物上。支撑物可以是玻璃样本载玻片，例如，其表面设有用于质谱仪的透明但导电的表面涂层。然而，也可以使用其他支撑物，例如金属支撑物。玻璃样本载玻片特别适用于上述在光学显微镜下识别组织区域的方法。根据所需的物质类别，可能需要在组织表面上进行空间分辨酶促反应。为此，通常将酶喷涂在上面。
45.然后用合适的基质物质的溶液喷涂薄组织切片，用于通过基质辅助激光解吸进行电离。例如，喷涂可以在装置上进行，该装置使样本载玻片在喷嘴下方移动，从而产生均匀的喷涂涂层。这里必须注意，喷涂后运行的液体不损害物质的位置精度。最合适的是具有中间干燥的间歇喷涂，如de102006019530b4(m.sch
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renberg；对应于us7667196b2和gb2437623b)中所示的。在这个过程中，结晶基质物质从薄切片中吸收这些物质，这些物质可以嵌入晶体本身中或在结晶期间嵌入晶体之间的晶界中。
46.这里基质物质的选择可以极大地影响哪些生物分子引起光谱中的信号。例如，以这种方式用2,5-二羟基苯甲酸(dhb)或芥子酸(sa)制备蛋白质，用-氰基-4-羟基肉桂酸(chca)制备肽，用3-羟基吡啶甲酸(3-hpa)制备核酸，以及用dhb或用于maldi ms分析的三羟基苯乙酮制备含糖结构。然后将样本引入质谱仪并获得质谱。
47.首先基于基本上已知的组织结构指定像素尺寸。这里我们假设要研究来自于精细
结构组织的测量5毫米
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5毫米的切片。例如，50微米
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50微米的像素尺寸适合于此。像素尺寸应尽可能大，但另一方面，它应尽可能少地重叠结构边界。
48.几种方法可以获得质谱：(i)使用精细聚焦激光束一次在一个单独像素上进行光栅扫描，包括质谱的与组织类型无关的总和，(ii)使用其焦点对应于像素尺寸的激光束获取质谱，包括来自相同像素区域的若干连续获得的质谱的总和，或(iii)上述方法的混合。无论选择哪种方法，这里的重要方面在于对于每个像素可以获得在开始时已经具有高质量的与组织类型无关的和光谱。
49.这里仅通过示例简要讨论光栅扫描。光栅扫描包括质谱的逐像素采集，其中在组织样本的每个点中，通过精细聚焦的激光束执行质谱的一次或优选几次采集。不管组织类型如何，对像素的所有点的质谱求和，以便实现更高的动态测量范围并且还改善质量信号的统计。“点”的直径大致对应于激光光斑的直径，即样本上激光束的直径，该直径可以通过聚焦来设定。质谱仪中的固态激光器允许焦距小至约5微米；因此，可以在50微米边缘长度的一个像素中获取100个光栅点的质谱。如果在薄组织切片的材料用完之前可以在每个光栅点处获取四个质谱，则我们获得来自于每个像素中的400个质谱的总和。为每个像素保存总和光谱。对于边长为5毫米的正方形组织表面，这意味着测量10000个和质谱，每个和质谱根据400个单独的质谱求和。采用10千赫采集速率，400万个单独的质谱的采集花费约7分钟。
50.像素通常形成以正方形、平行四边形或蜂窝状排列的模式，但是当然它们可以反而遵循样本的特定形态，例如对于几毫米长的神经节的轴突会有帮助的。这里唯一重要的方面是像素尺寸适当地匹配待分析区域的尺寸或预期的解剖结构。
51.maldi逐点产生的离子可以用质谱仪检查，该质谱仪使用各种质量分析仪。通常使用具有或不具有离子反射器的飞行时间分析仪(飞行时间质谱仪；tof-ms)。然而，也可以使用具有正交离子注入(otof-ms)的飞行时间质谱仪。傅里叶变换离子回旋谐振质谱仪(ft-icr)也正在被越来越多地使用。
52.在测量之后，然后可以获得每个像素的完整质谱。然后将根据本发明的上述方法应用于该数据，以确定变性组织的区域。然后可在屏幕上以通常的方式图形化显示组织状态。
53.总之，本发明提出了使用来自薄组织切片的用空间分辨率采集的质谱而在组织学样本中搜索组织变性以及用于可视化它们的空间分布的方法。已知标志物用于组织变性，但通常无法在单个质谱中以足够的确定性进行识别。本发明的特征在于以下事实：通过相似性测定在组织表面上寻找具有相似质谱的区域，并且对来自相似质谱区域的如此多的质谱求和，使得求和的质谱的质量足以明确识别(一个或多个)标志物。
54.对于相似性测定，优选使用提供相似性参数的方法。然后，通过以下事实来表征相似质谱的区域：质谱相互之间具有高于相似性参数的设定阈值的相似性。
55.优选地，将组织表面细分为像素，而选择适合于组织结构的像素尺寸。优选地，使用光栅扫描方法对每个像素进行采样，并且无论组织类型如何，对一个像素的质谱求和，以形成用于之后检查变性的组织的空间分辨质谱。
56.第一种方法的特征在于以下事实：针对其他像素的所有质谱，对于相似性对每个单独像素的质谱进行检查，从而产生具有相似质谱的互连区域。然而，这导致非常多的光谱
比较。如果将质谱与相似性阈值以上的原始像素的质谱相似的那些像素排除在相对于其他像素的质谱的进一步相似性测定之外，则可以减少相似性测定的次数。
57.第二种方法的特征在于以下事实：第一区域的搜索从任意选择的像素开始，并且需要确定质谱与所有相邻像素的质谱的相似性。搜索在所有方向上继续，直到在每种情况下达到边界，其中质谱不再相似。然后进行第二区域的搜索，从第一区域外的选定像素开始，依此类推，直到感兴趣的组织区域实际上被具有彼此相似的质谱的区域完全覆盖。
58.此外，本发明提出了一种搜索组织变性的方法，其特征在于以下事实：使用已知方法(例如，光学显微镜)在组织表面上寻找具有相同类型组织的区域，并且从这些区域对如此多的质谱求和，即求和的质谱的质量足以明确识别(一个或多个)标志物。
59.使用通过空间分辨率获得的薄组织切片的质谱来搜索组织学样本中的组织变性的另一种方法的特征在于以下事实：对于组织表面上的一种组织类型，通过局部质谱与参考质谱的相似性测定来识别该组织类型的区域，并且对来自这些区域的如此多的质谱求和，使得求和的质谱的质量足以明确识别(一个或多个)标志物。
60.可以图形地表示组织状态的空间分布，例如在屏幕上。为此，可以如习惯地使用灰度或假色。
61.除了上面详细描述的maldi电离之外，也可以与这里描述的质谱成像方法一起使用其他类型的电离，例如解吸电喷雾电离(desi)或通过初级离子轰击的二次离子形成(二次离子质谱法，sims)。
62.上面已经参考不同的具体示例实施例描述了本发明。然而，应该理解，在不脱离本发明范围的情况下，可以修改所描述的实施例的各个方面或细节。特别地，如果这对于本领域技术人员而言是可行的，则可以根据需要组合不同实施例公开的特征和措施。此外，以上描述仅用于说明本发明，而不是作为对保护范围的限制，该保护范围仅由所附权利要求限定，并考虑可能存在的任何等同物。