基于树突状细胞判断水产过敏原作用的联合型代谢标志物及其应用和检测试剂盒

1.本发明属于分析化学，生物化学以及水产食品技术领域，具体涉及基于树突状细胞判断水产过敏原作用的联合型代谢标志物及其应用和检测试剂盒。


背景技术：

2.食物过敏是世界性公共卫生问题，水产品中鱼类、甲壳类和贝类是常见的过敏食物来源。我国水产品过敏人群比例较高，且水产品过敏反应通常具有免疫交叉性。随着水产品消费量的增加，由食用水产品引起的过敏发病率呈上升趋势，水产食物引发的过敏问题日益受到关注。
3.目前食物过敏的诊断主要有食物激发试验、皮肤点刺实验和血清免疫球蛋白e(ige)抗体水平实验。食物激发试验程序复杂，须在专业医务人员和完备设施条件下进行，花费大量的人力和财力。皮肤点刺实验特异性不高，并且由于没有统一标准化的测试物，不同机构间结果95％阳性的预测值存在一定差异。血清ige水平是反映机体识别致敏原的客观指标，但作为体外诊断方法，常与体内诊断方法联合进行确证。进一步开发一种准确、稳定的方法用于判断水产过敏原暴露危害，具有重要的现实意义。
4.食物过敏涉及多种类型免疫反应，以i型过敏(即ige介导)的食物过敏为主。食物过敏原进入机体，经抗原提呈细胞识别，激活t细胞并诱导b细胞产生ige抗体。而肥大细胞表面的ige受体与之结合，使机体处于致敏状态。当再次接触致敏原时，可触发肥大细胞脱颗粒反应，进而启动过敏病理过程。树突状细胞(dendritic cell，dc)是体内最强的专职抗原提呈细胞，能够识别、摄取和加工外源性抗原并提呈给t细胞，进而促进ige的产生，激活肥大细胞，加速食物过敏的进程。dc细胞在食物过敏致敏阶段承担着抗原信息接收、加工和呈递作用，通过调控dc的功能可增强或者抑制机体的免疫应答，因此dc细胞生理状态的评价对食物过敏进程的认识及免疫防治具有重要价值。
5.脂质组学为代谢组学研究范畴中的重要分支。借助色谱-质谱联用等技术，脂质组学研究可对生物体中的脂质代谢物开展高通量的定性定量分析，在机体生理状态评价中具有独特优势。作为细胞膜的重要组成部分，脂质参与调节生命活动的很多重要过程，例如细胞的能量储存、物质运输、信号传导，细胞的发育、分化以及细胞凋亡等。近年来，脂类标志物在癌症、糖尿病、多囊卵巢综合征等重要疾病的临床诊断和研究中已有许多成功的案例。
6.鉴于脂质代谢物在生物体中的关键调控作用，本发明采用基于超高效液相色谱-质谱联用技术的脂质组学研究方法，检测不同状态下dc细胞中的脂类代谢物，经过生物信息学分析，筛选dc细胞经水产典型过敏原(原肌球蛋白)暴露后的典型脂质标志物。本发明提出了脂质标志物心磷脂(cl 68:4)、心磷脂(cl 68:5)、心磷脂(cl 69:5)和心磷脂(cl 70:5)的联合使用用于判别水产典型过敏原(原肌球蛋白)暴露作用的新用途。由于单一代谢物所受影响因素较多，脂类物质在生命体有着多重“身份”，因此从dc细胞模型中筛选出由少数代谢物构成的联合型代谢标志物，并以判别公式计算“判别可能性”p值
(probability)，有助于改善判别灵敏度以及特异性。目前尚无将该四种脂质代谢物联合，用于判别水产典型过敏原(原肌球蛋白)作用的报道。


技术实现要素：

7.针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供基于树突状细胞判断水产过敏原作用的联合型代谢标志物及其应用和检测试剂盒的技术方案。
8.本发明具体通过以下技术方案实现：
9.本发明第一方面提供基于树突状细胞判断水产过敏原作用的联合型代谢标志物，该水产过敏原为原肌球蛋白，该标志物包括：心磷脂(cl 68:4)、心磷脂(cl 68:5)、心磷脂(cl 69:5)和心磷脂(cl 70:5)。
10.本发明第二方面提供联合型代谢标志物在判断水产过敏原作用中的用途。
11.本发明第三方面提供联合型代谢标志物在判断水产过敏原作用中的方法，采用联合标志物变量p进行判断：
12.p＝1/(1 e-36.954a-75.558b 167.971c 18.584d 40.337
)
13.上述公式中a为心磷脂(cl 68:4)的相对含量，b为心磷脂(cl 68:5)的相对含量，c为心磷脂(cl 69:5)的相对含量，d为心磷脂(cl 70:5)的相对含量；
14.若p＞0.5则判断为水产过敏原暴露。
15.本发明第四方面提供检测联合型代谢标志物的试剂盒，包括：
16.a标准品：心磷脂(cl 56:0)和心磷脂(cl 72:4)；
17.b预处理提取液：包含0.33ug/ml脂肪酸(c16:0-d3)同位素内标的甲醇溶液；
18.c洗脱液：流动相a为含10mm乙酸铵的乙腈/水溶液(v/v＝6∶4)，流动相b为含10mm乙酸铵的异丙醇/乙腈溶液(v/v＝9∶1)。
19.本发明第五方面提供检测试剂盒计算联合标志物变量的方法，包括以下步骤：
20.(1)受试dc样本预处理：dc细胞样品加入预处理提取液，随后加入甲基叔丁基醚和超纯水，进行脂类代谢物的提取；
21.(2)将步骤(1)处理后提取的受试样本脂类代谢物进行基于超高效液相色谱一质谱联用的分离与鉴定；
22.(3)以心磷脂标准品对检测到的离子进行辅助定性确认；
23.(4)对于经鉴定所得受试样本中的四个目标心磷脂，将其色谱峰强度首先进行细胞样本蛋白干重校正，随后再分别与内标物(脂肪酸(c16:0-d3))比较，获得上述四种代谢物的相对浓度；
24.(5)将心磷脂(cl 68:4)、心磷脂(cl 68:5)、心磷脂(cl 69:5)与心磷脂(cl 70:5)经二元逻辑回归计算得到联合标志物变量p。
25.进一步，以心磷脂标准品对检测到的离子进行辅助定性确认具体包括：
26.i)将试剂盒中心磷脂标准品进行超高效液相色谱-质谱分析，确定标准品的色谱保留时间、实测质核比、以及二级质谱特征离子，结合lipid maps数据库及试剂盒中的心磷脂标准品，确定心磷脂的二级质谱断键规律，负离子模式下，脂肪酸从甘油中协同发生丢失，可获取m/z为153的特征离子及对应脂肪酸根离子；
27.ii)受试细胞样品中，在合理的质核比耐受阈值下分别提取理论质核比为
1399.96484、1397.94934、1411.96484、1425.98059的心磷脂(cl 68:4)、心磷脂(cl 68:5)、心磷脂(cl 69:5)和心磷脂(cl 70:5)色谱峰；
28.iii)分别核对上述色谱峰的二级质谱离子是否符合心磷脂二级质谱断键规律，同时结合色谱保留行为，确认四个目标心磷脂。
29.本发明原理具体为：
30.(1)利用超高效液相色谱-四级杆和轨道阱杂交傅里叶变换超高分辨率质谱联用的脂质组学分析技术，对阴性对照组(pbs)与过敏原(华贵类栉孔扇贝来源的原肌球蛋白)暴露组(mtm)的dc细胞分别进行脂质代谢轮廓分析，获取脂质代谢物定性定量分析结果。
31.(2)基于mtm与pbs组的比较，根据多变量分析所得变量权重值(vip)及单变量分析结果筛选差异脂类化合物，结合差异倍率变化，进行潜在标志物的发现。具体做法包括：
32.i)首先筛选满足多变量偏最小二乘判别模型中vip》1的脂质；
33.ii)筛选满足单变量双因素方差分析中具有显著性差异(p-value《0.05&fdr《0.05)的脂质；
34.iii)获取以上两种数据分析方法的脂质代谢物交集；
35.iv)在上述交集中，挑选两组比较中变化倍率大于2.5倍的脂质(ratio》2.5或《0.4)；
36.v)挑选不同采样时间点下符合非参数检验具有显著性差异的脂类代谢物(p-value《0.05&fdr《0.05)；
37.vi)基于接收者受试工作特征曲线(roc)分析，保留曲线下面积等于1(auc＝1)的脂质代谢物。
38.(3)应用干扰组(含牛血清白蛋白(bsa)组与脂多糖(lps)组)细胞样本对以上筛选出的潜在标志物进行验证，筛选条件为：
39.i)干扰组分别与mtm比较，保留具有显著差异(p-value《0.05&fdr《0.05)的脂质；
40.ii)同时要求干扰组与pbs组无显著差异(p-value》0.05&fdr》0.05)；
41.iii)符合以上两个验证条件，最终优选出心磷脂(cl 68:4)、心磷脂(cl 68:5)、心磷脂(cl 69:5)和心磷脂(cl 70:5)这一联合标志物组合。
42.本发明的有益效果为：
43.本发明涉及dc细胞中的脂类代谢物心磷脂(cl 68:4)、心磷脂(cl 68:5)、心磷脂(cl 69:5)和心磷脂(cl 70:5)联合使用作为标志物，用于判别水产食品典型过敏原(原肌球蛋白)暴露作用的新应用。本发明还涉及暴露作用判别的试剂盒。所述试剂盒可实现高灵敏、高效检测本发明涉及的四种小分子代谢物，且具有检测成本低，重复性好的特点。
44.本发明内容建立于食物过敏早期致敏阶段，有利于拓宽体外早期水产食物过敏的诊断手段。上述四种小分子代谢物联合使用具有较好的应用前景。
附图说明
45.图1.四种脂质标志物的结构式及其二级碎裂特征。a为心磷脂(cl 68:4)，b为心磷脂(cl 68:5)，c为心磷脂(cl 69:5)，d为心磷脂(cl 70:5)。
46.图2.各组样本中脂质标志物的含量(以均值
±
标准偏差表示)。a、b、c、d分别为心磷脂(cl 68:4)、心磷脂(cl 68:5)、心磷脂(cl 69:5)和心磷脂(cl 70:5)。*表示p《0.001且
fdr《0.001。
47.图3.roc曲线分析。(a)发现集中联合标志物的roc曲线图(pbs vs.mtm)。(b)验证集中联合标志物的roc曲线图(阳性干扰组(包括bsa与lps)vs.mtm)。
具体实施方式
48.以下结合实施例来进一步说明本发明。
49.实施例1
50.本实施例采用的检测试剂盒如下：
51.标准品：(1)心磷脂(cl 56:0)和心磷脂(cl 72:4)(购于avanti polar lipids公司)，所述标准品用于dc细胞中心磷脂类代谢物的辅助定性；(2)细胞样品预处理提取液：包含0.33ug/ml脂肪酸(c16:0-d3)同位素内标的甲醇溶液，采用蛋白干重结合内标的方法校正四种心磷脂的含量；(3)洗脱液：流动相a为含10mm乙酸铵的乙腈/水溶液(v/v＝6:4)，流动相b为含10mm乙酸铵的异丙醇/乙腈溶液(v/v＝9:1)。
52.1.细胞样本收集
53.dc2.4细胞按照1
×
106/well接种于6孔板，待细胞贴壁愈合度达到80％左右，加入500ug/well华贵类栉孔扇贝来源的原肌球蛋白(mtm)，阴性对照组加入等体积的pbs。分别培养24h和48h后，弃去细胞上清液，pbs洗板三次，放入液氮中10～15s，终止酶反应，随后转移到-80℃保存备用。
54.2.样品预处理
55.样本预处理过程在冰上操作，首先加入1ml含有0.33ug/ml脂肪酸(c16:0-d3)同位素内标的甲醇溶液，用细胞刮刀刮取细胞，转移到5ml离心管中。加入2.5ml mtbe，涡旋30s，并于1000rpm，10℃条件下震荡30min。随后加入750μl超纯水，涡旋1min，并于6℃，12000g条件下离心10min。两相分离后，定量收集上层疏水相并在冷冻离心浓缩仪中真空干燥，所得冻干样品于-80℃条件下储存。
56.脂质冻干样品进入超高效液相色谱-质谱联用仪检测前，采用甲醇/二氯甲烷混合溶液(v/v＝1:2)复溶，再加入乙腈/异丙醇/水(v/v/v＝65:30:5，含5mm乙酸铵)稀释进样。
57.3.数据采集
58.(1)超高效液相色谱条件：采用thermo fisher ultimate 3000(uplc，thermo，usa)系统，色谱柱为acquity uplc beh c8柱(2.1
×
100mm
×
1.7μm，waters，usa)。分离过程中，柱温设置为55℃，进样室温度控制在8℃。流动相a为乙腈：超纯水＝6:4(含10mm的乙酸铵)，流动相b为异丙醇：乙腈＝9:1(含10mm的乙酸铵)。采用梯度洗脱模式，梯度如下：先将32％b保持1.5min，然后在1.5～15.5min区间线性增加到85％b，然后在0.1min内线性增加到97％b并保持到18min，随后在0.1min内降到32％b，直至平衡到下一次进样。整个过程流速保持在0.26ml/min。
59.(2)质谱条件：采用四极杆和轨道阱杂交傅里叶变换超高分辨率质谱仪(q-exactive，thermo，usa)，质谱分析过程采用电喷雾离子源负离子模式进行检测。质谱参数设置为：喷雾电压3.0kv，鞘气流速50arb，辅助气流速15arb，辅助气温度为400℃，毛细管温度为325℃，采集范围为200-1800m/z，采集速率1.7spectra/s，二级分析采集top 10的母离子进行hcd裂解模式，碰撞能量为25～35ev。采集过程中采用xcalibur软件(thermo，usa)记
录总离子流图与ms谱图。
60.4.数据预处理
61.将ulpc-q exative获得的原始质谱数据导入msdial软件进行峰识别、峰提取和峰对齐(http：//prime.psc.riken.jp/compms/index.html)，排除信噪比低于10的信号峰。所得的峰表用xcalibular进行脂类物质的鉴定，并以心磷脂标准品对检测到的离子进行辅助定性确认。经鉴定的脂类符合以下三个条件：
62.(1)一级质谱ms精确质量数(理论值
±
5ppm)；
63.(2)二级质谱ms/ms裂解规律；
64.(3)色谱保留时间规律
65.将准确鉴定的脂类化合物导入tracefinder(thermo，usa)进行化合物的定量。随后，结合细胞蛋白称重与内标，进行色谱峰强度的校正。
66.5.结果分析
67.四种脂质标志物的结构式及二级质谱如图1所示。与pbs组相比，mtm组中所涉四个脂质标志物均显著下调(图2)。使用数据统计软件spss，进一步将心磷脂(cl 68:4)、心磷脂(cl 68:5)、心磷脂(cl 69:5)与心磷脂(cl 70:5)经二元逻辑回归计算得到联合标志物p。回归方程如下：
68.p＝1/(1 e-36.954a-75.558b 167.971c 18.584d 40.337
)
69.其中，a为心磷脂(cl 68:4)的相对含量，b为心磷脂(cl 68:5)的相对含量，c为心磷脂(cl 69:5)的相对含量，d为心磷脂(cl 70:5)的相对含量。
70.将所有时间点的pbs与mtm组样本纳入判别比较，基于该联合标志物所得判断变量p，用于判别的roc曲线下面积(auc值)为1，在0.5的cut-off值下，灵敏度与特异性均为100％(表1，图3)，以上结果表明该联合标志物具有较好的判别潜力，可用于水产典型过敏原(原肌球蛋白)作用的判别。
71.实施例2
72.1.细胞样本收集
73.分别设置bsa与lps组，具体为在dc细胞培养中加入等量的牛血清白蛋白和脂多糖。bsa为生物实验过程中常用对照蛋白，lps是一种高免疫原性抗原(内毒素)，可刺激dc细胞成熟。以bsa及lps为干扰组，分别采集dc细胞培养至24h、48h时的bsa、lps、mtm组样本，细胞采集同实施例1。
74.2.样品预处理
75.同实施例1。
76.3.数据采集
77.同实施例1。
78.4.数据预处理
79.同实施例1。
80.5.结果分析
81.基于干扰组(包括bsa与lps)与mtm组的比较，实施例2用于验证上述四个脂质标志物联合使用的可行性，以进一步证实其对水产典型过敏原(原肌球蛋白)作用的判别效果。与bsa及lps组相比，mtm组中所涉四个脂质标志物均显著下调，其变化趋势与实例1一致(图
2)。将所有时间点的干扰组(含bsa与lps组)及mtm组均纳入判别比较，基于该联合标志物所得判断变量p，用于判别的roc曲线下面积为0.944，灵敏度与特异性分别为1.000和0.917(图3，表1)，以上结果进一步证实了上述四种脂质标志物的联合使用对于水产典型过敏原(原肌球蛋白)作用的有效判别。
82.表1.联合标志物的roc判别分析结果
83.