一种诃子果提取物的应用及含其的生发育发产品的制作方法

1.本发明具体涉及一种诃子果提取物的应用及含其的生发育发产品。


背景技术：

2.现在人们频繁的染发、烫发，使得健康的头发和头皮变得脆弱，出现一系列头发和头皮问题，例如：头发干枯、分叉、发黄、没有光泽，头皮瘙痒、敏感、泛红、早衰。健康的头皮孕育健康的头发，随着大家对头皮健康认识的提升，人们关注的重点从单纯的发丝护理进阶到头皮护理和毛囊护理。头皮本身的老化是导致头发问题不容忽视的内部因素，特别是现代年轻人，在快节奏、高压力的环境下生活，头皮和头发的早衰现象是十分普遍的。因此关注并平衡头皮内部健康，改善头皮屏障功能，滋养头皮，是保护头皮年轻、充满活力的第一步，主要可以从修复和预防头皮损伤、抵御外界刺激、缓解损伤引起的炎症和不适症状等方面做到养护头皮。
3.毛囊深植于头皮之下，里面的部分膨起形成毛球和乳状突起，这是一个高活性区域，头发数量减少的原因主要是活跃的毛囊数量减少，或者即使是活跃的毛囊，也处于亚健康状态，无法支持健康头发的正常生长。因此会出现头发减少，发丝变细和干燥脱屑的情况。
4.毛乳头细胞是一群位于毛囊底部的真皮源性细胞，由真皮间质细胞分化，聚集成团发育而来。通过细胞外基质的变化，毛乳头细胞在毛囊的形态学发生和成年毛囊的周期性生长过程中具有重要的作用。提供头发生长所需的营养物质可以促进毛乳头细胞的增殖，恢复毛囊活力，坚固发根促进头发生长。研究毛乳头细胞分化及其发挥生物学功能的分子机制的研究对了解组织器官的发育和再生具有重要的指导意义。
5.在细胞或组织的正常生理代谢过程中会产生活性氧，另外一些环境因素如紫外照射、吸烟、环境污染等也可以诱导活性氧产生，活性氧产生后，可以导致细胞内脂质、蛋白质和dna等的氧化损伤。研究显示，头发和头皮比身体其他部位更容易聚集污染物质，环境污染通过激活ahr通路，增强头皮活性氧生成，上调相关的因子(tgf-β2，tnf-α和ptgs2)并刺激人头发毛囊毛乳头细胞中的炎性细胞因子(il-6,il-8和gm-csf)，从而导致头发和头皮损伤。
6.诃子为使君子科诃子属植物诃子(terminadia chebula retz.)或绒毛诃子(terminadia chebula retz.var.tomentella kurt.)的干燥成熟果实。诃子原产于印度、缅甸等地，在我国云南、广东、广西、西藏等地均有分布。诃子出自梵文，当时根据佛教中梵文的发音，把它翻译为诃黎勒。诃子用药历史悠久，早在唐朝时期，诃子已作为药物从印度引用至本草里；诃子(诃黎勒)与毗黎勒(毛诃子)，庵摩勒(余甘子)称为三勒浆，为古代佳酿，早在唐代已为贡品，可敬献帝王，煎汤待客。诃子在藏药中甚至被视为“药中之王”，其味苦、酸、涩，性平，有涩肠敛肺，降火利咽之功效，在临床上主要用于治疗久泻久痢，脱肛便血，肺虚咳嗽，久咳音哑等。由于诃子比较嫩的时候，从外形到性味、功能和主治，都与青果大同小异，又与藏区有关，所以把没有成熟的诃子称为“藏青果”，用于治慢性咽喉炎，咽喉
干燥等症状。在古印度，人们喜欢用三果(诃子、毛诃子、余甘子)与墨旱莲一起制成发油，涂抹在头皮上，可以治疗头屑和头皮发痒，同时具有乌发作用，防止头发过早变成灰色。
7.近年来国内护发产品在化妆品市场中占据的份额呈现持续高速增长的趋势，与其形成鲜明对比的是护发产品深层次机制研究的缺失，因此本领域技术人员亟需研发一种能够有效解决头发和头皮损伤问题的护发产品。


技术实现要素：

8.本发明所解决的技术问题在于解决现有技术无法有效解决头发和头皮损伤问题的缺陷，从而提供一种诃子果提取物的应用及含其的生发育发产品。本发明制备的诃子果提取物具有良好的抗氧化能力，提高人毛囊真皮乳突细胞atp含量，增强人毛囊真皮乳突细胞活性，增强头皮健康，促进头发生长。
9.本发明提供一种诃子果提取物的应用，所述应用为所述诃子果提取物在制备抗氧化剂、细胞内atp增强剂或生发育发相关基因的表达促进剂中的应用，所述生发育发相关基因为noggin、ki67、igf-1、cd44、alpl或cyp1b1。
10.所述细胞可为人毛囊真皮乳突细胞。
11.所述诃子果提取物的制备方法包括下述步骤：干诃子果经溶剂提取、过滤，干燥滤液，即得。
12.所述干诃子果可为本领域常规，较佳地为使君子科诃子属植物诃子(terminadia chebula retz.)和/或绒毛诃子(terminadia chebula retz.var.tomentella kurt.)的干燥成熟果实。
13.所述干诃子果较佳地产自泛喜马拉雅地带。
14.所述溶剂可为去离子水。
15.所述干诃子果和所述溶剂的质量比可为1:8-1:11，较佳地为1:10。
16.所述提取可为本领域常规操作，较佳地为搅拌萃取。
17.所述提取的次数可为1-3次，较佳地为2次。
18.所述提取的时间可为1-3h，较佳地为2h。
19.所述提取的温度可为80-110℃，较佳地为90℃。
20.所述提取前较佳地还包括清洗和粉碎的步骤。
21.所述粉碎可为本领域常规操作，较佳地通过高速粉碎机实现。
22.所述粉碎后可经筛网过筛，所述筛网的目数较佳地为60目。
23.所述过滤可为本领域常规操作，较佳地为离心。
24.所述干燥可为本领域常规操作，较佳地为冷冻干燥。
25.本发明还提供一种诃子果提取物在生发育发产品中的应用。
26.本发明还提供一种生发育发产品，其包括所述诃子果提取物。
27.所述诃子果提取物的质量浓度可为0.0001％～2％，其中，百分比为所述诃子果提取物的质量占所述生发育发产品的质量的比。
28.较佳地，所述诃子果提取物的质量浓度为0.0001％～0.01％，更佳地为0.005-0.01％，其中，百分比为所述诃子果提取物的质量占所述生发育发产品的质量的比。
29.较佳地，所述诃子果提取物的质量浓度为0.01％～2％，例如0.1％、1％或2％，其
中，百分比为所述诃子果提取物的质量占所述生发育发产品的质量的比。
30.在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
31.本发明所用试剂和原料均市售可得。
32.本发明的积极进步效果在于：本发明制备的诃子果提取物具有良好的抗氧化能力，提高人毛囊真皮乳突细胞atp含量，增强人毛囊真皮乳突细胞活性，促进基因noggin、ki67、igf-1、cd44、alpl和cyp1b1的表达。可以抵御外界环境刺激，降低敏感，修复和预防头皮损伤，改善头皮屏障、滋养头皮，增强头皮健康，从而由内而外促进头发生长，增加头发密度，使发丝更茁壮，强韧。
附图说明
33.图1为诃子果提取物对人毛囊真皮乳突细胞的毒性作用效果图；
34.图2为诃子果提取物对人毛囊真皮乳突细胞atp的作用效果图；
35.图3为诃子果提取物对人毛囊真皮乳突细胞增殖标志基因ki67的作用效果图；
36.图4为诃子果提取物对人毛囊真皮乳突细胞生长标志基因igf-1的作用效果图；
37.图5为诃子果提取物对人毛囊真皮乳突细胞衰老标志基因cd44的作用效果图；
38.图6为诃子果提取物对人毛囊真皮乳突细胞特征基因alpl的作用效果图；
39.图7为诃子果提取物对人毛囊真皮乳突细胞抗污染相关蛋白基因cyp1b1的作用效果图；
40.图8为诃子果提取物对离体毛囊生长的作用效果示意图；
41.图9为诃子果提取物对离体毛囊生长的作用效果图。
具体实施方式
42.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
43.实施例1
44.取产于泛喜马拉雅地带的干诃子果100g，清洗干净，干燥后经高速粉碎机粉碎后过60目筛，称取50g粉末于圆底烧瓶中，按照固液比1:10加入去离子水500ml搅拌提取，提取温度90℃，提取时间2h。离心过滤收集滤液，滤渣中再加入去离子水500ml在温度为90℃的条件下搅拌提取2h，离心过滤收集滤液。将两次滤液合并，对滤液进行冷冻干燥，得诃子果提取物。
45.效果实施例1
46.诃子果提取物的总抗氧化能力测试：
47.使用总抗氧化能力检测试剂盒(abts快速法)(碧云天s0121)对诃子提取物进行总抗氧化能力检测。abts在适当的氧化剂作用下会氧化成绿色的abts ，在抗氧化物存在时abts 的产生会被抑制，在414nm或734nm测定abts 的吸光度即可测定并计算出样品的总抗氧化能力。
48.表1中的结果显示，诃子果提取物有较强的抗氧化能力，0.01％时其抗氧化能力达
到0.551873。
49.表1
[0050][0051][0052]
效果实施例2
[0053]
诃子果提取物对毛囊乳突细胞的毒性作用研究：
[0054]
将人毛囊真皮乳突细胞(hair follicle dermal papilla cells，hfdpc-p4)以5000个细胞/孔的水平接入96孔细胞培养板中，培养72小时后移除上清，为每个培养孔更换不含血清的dmem基础培养基，对细胞进行饥饿处理。细胞饥饿16h后做加样处理，空白对照组为dmem基础培养基。细胞继续在37℃、5％co2的条件下培养48h，然后用cck-8试剂盒测定诃子果提取物对人毛囊真皮乳突细胞的毒性作用。
[0055]
结果如图1和表2所示，“#”代表p《0.01，诃子果提取物浓度低于0.01％时对人毛囊真皮乳突细胞没有毒性作用。
[0056]
细胞相对存活率＝诃子果提取物组吸光度值/空白对照组吸光度值
×
100％。
[0057]
表2
[0058]
[0059][0060]
效果实施例3
[0061]
诃子果提取物对毛囊乳突细胞内atp的作用：
[0062]
将人毛囊真皮乳突细胞(hair follicle dermal papilla cells，hfdpc-p4)以5000个细胞/孔的水平接入96孔细胞培养板中，培养72小时后移除上清，为每个培养孔更换不含血清的dmem基础培养基，对细胞进行饥饿处理。细胞饥饿16h后做加样处理，空白对照组为dmem基础培养基。培养48h后使用试剂测量细胞atp含量。取出100μl培养基，设置标准品孔，加入100μl工作液，室温避光反应10min，使用化学发光酶标仪读板，计算细胞内相对atp含量。
[0063]
结果如图2和表3所示，“#”代表p《0.01，浓度为0.005％和0.01％的诃子果提取物可以显著促进人毛囊真皮乳突细胞细胞内atp含量。
[0064]
相对atp含量＝诃子果提取物组atp含量/空白对照组atp含量
×
100％。
[0065]
表3
[0066][0067]
效果实施例4
[0068]
诃子果提取物对毛囊乳突细胞相关基因表达的影响：
[0069]
将人毛囊真皮乳突细胞(hair follicle dermal papilla cells，hfdpc-p4)消化，用含不同浓度诃子果提取物的培养基重悬为5
×
105cells/ml的细胞悬液，用移液管取20μl细胞悬液，垂直接种到一个倒置的10cm的培养皿盖子上，向10cm培养皿的底部加入15mlpbs缓冲液，将带有细胞液滴的培养皿盖培养72h，得到的球状培养物进行rt-pcr实验。
[0070]
图3-7和表4显示，浓度为0.01％、0.005％、0.001％的诃子果提取物可以显著促进人毛囊真皮乳突细胞增殖标志基因ki67、细胞生长标志基因igf-1、细胞衰老标志基因cd44、细胞特征基因alpl和抗污染相关蛋白基因cyp1b1的表达。表4中，*表示p＜0.05，#表示p＜0.01。
[0071]
表4
[0072][0073]
效果实施例5
[0074]
带毛囊的皮肤的培养是器官培养的一种，器官培养对于研究发育、伤口愈合、生理学及病理学都具有极其深刻的意义。带毛囊的皮肤培养后的变化主要如下：毛囊生长、毛干变长和毛囊自发进入衰退期。该培养在气/液两相交界面、无血清的培养基中进行培养。
[0075]
具体步骤如下：获取人头皮皮肤，在培养基中加入青霉素、链霉素及两性霉素，冲洗组织5min后修建皮肤表层的毛干，打孔器沿平行于毛囊的方向打孔，将打下来的组织进行培养。
[0076]
准备含有0.05％、0.005％的诃子果提取物培养基，对分离的毛囊进行分组并拍照，培养毛囊7天，隔天换液。每组按照相同的拍照顺序进行拍照，并计算毛囊长度变化。
[0077]
毛囊生长率＝(培养后的毛囊长度﹣培养前的长度)/培养前长度
×
100％。
[0078]
图8-9和表5可以看出三组毛囊的长度变化，其中，毛囊在含0.05％的诃子果提取物的培养基中生长率达8.77％。
[0079]
表5
[0080]
质量浓度％毛囊生长率％(mean
±
sd)nt1.98
±
3.650.0055.02
±
4.800.058.77
±
7.88
[0081]
效果实施例6
[0082]
诃子果提取物对毛囊乳突细胞(dp细胞)相关基因表达的影响
[0083]
含不同浓度的诃子果提取物培养基的制备：将实施例1中制得的诃子果提取物溶于双蒸水，制备成1％母液，用0.22μm滤膜过滤，实验时用培养基分别稀释制备得到含不同浓度(质量百分比0.01％、0.005％、0.001％)的诃子果提取物。
[0084]
实验方法：将人毛囊真皮乳突细胞(hair follicle dermal papilla cells，hfdpc-p4)消化，将含不同浓度的诃子果提取物培养基重悬为5
×
105cells/ml的细胞悬液，用移液管取20ul细胞悬液，垂直接种到一个倒置的10cm培养皿盖子上，向10cm培养皿底部加入15ml pbs，然后轻轻地拿起带有细胞液滴的培养皿盖子，培养72h收获球状培养物做rt-pcr(逆转录pcr)实验，检测基因表达情况。结果以均值
±
sd表示，其中*表示p＜0.05，#表示p＜0.01，如表6所示。
[0085]
表6
[0086][0087][0088]
结果显示，0.01％、0.005％、0.001％诃子果提取物显著促进促毛囊再生基因noggin的表达。相对而言，0.001％诃子果提取物促进效果最好。
[0089]
效果实施例7含诃子果提取物的头发护理液对改善脱发效果的影响
[0090]
将诃子果提取物配置成质量百分比分别为0％、0.01％、0.1％、1％和2％的头发护理液基础配方(即为纯水)中，并对其分组(随机盲测)，10人为一组使用2个月，问卷调查如表7，结果显示，均具有促进头发生长的效果。
[0091]
表7头发护理液使用感受调查结果
[0092] 0％0.01％0.1％1％2％使用舒适感 是否感觉头发厚度增加- 是否感觉头发增多、更浓密
‑‑
是否感觉头发光泽度增加- 是否感觉头发断发程度减少
‑‑
是否感觉头皮更健康-
[0093]
*上表中， 表示非常认同， 表示比较认同， 表示基本认同，-表示没有发现。