一种希瓦氏菌-纳米材料杂合细胞的构建方法及其应用

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种希瓦氏菌-纳米材料杂合细胞的构建方法及其应用。


背景技术：

2.随着染料与印染工业的发展，染料废水已成为当前最重要的水体污染源之一。这类废水具有颜色深，生化需氧量（bod）、化学需氧量（cod）值较高，组成复杂多变，排放量大，分布面广，难降解等特点。若直接排放将给生态环境带来严重危害。因此寻找高效经济的染料降解方法成为环境领域的热点。
3.目前，国内外对印染废水处理的方法有很多研究，常用的方法主要有混凝沉淀法、化学氧化法、吸附法、膜分离法和生物法等。化学絮凝法投资少，脱色效率高，但会产生大量泥渣；化学氧化法脱色效率高，但去除有限：电化学法运行简单，去除率高和脱色好，但能耗大、成本高，存在副反应；吸附法运转可靠，处理效果好，但费用高；膜分离法分离效率高，但成本高、易堵塞。而在新兴起的纳米材料领域，纳米硫化亚铁由于催化效率高、还原性强被广泛应用于含铬废水处理。但是纳米硫化亚铁但是其主要存在的问题是纳米材料消耗量大、费用高。
4.相对于传统方法，生物降解脱色法具有其低成本、环境友好性、适用于染料范围广等特点，但是存在降解效率低的问题。基于此，本发明构建一种新型的希瓦氏菌-纳米材料杂合细胞，利用微生物和纳米材料优势互补，实现高效染料污染水体修复。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明构建了一种希瓦氏菌-纳米材料杂合细胞，其结合微生物和纳米材料的优势，利用微生物的生物还原性原位实时再生具有高效催化性能的纳米材料，实现有机染料的高效多周期处理，提高单位质量纳米材料的处理效率。
6.为达到上述目的，本发明采取如下技术手段：本发明提供了一种希瓦氏菌-纳米材料杂合细胞的构建方法，所述方法包括步骤有：（1）将希瓦氏菌接种到lb培养基中，摇床培养获得菌液；（2）将步骤（1）获得的菌液离心，取沉淀菌泥加入到无氧反应缓冲液中，加入水溶性三价铁盐溶液和水溶性硫源盐溶液；摇床培养，获得希瓦氏菌-纳米材料杂合细胞。
7.进一步地，步骤（1）中所述的希瓦氏菌为奥奈达希瓦氏菌shewanella oneidensis mr-1。
8.步骤（1）中所述希瓦氏菌接种到lb培养基的比例关系为接种量与lb培养基的体积比为 0.05～0.8:100。
9.步骤（1）中所述摇床培养的条件为：温度20~37℃、震荡转数50~300rpm、时间10～20h。
g/l、10mm乳酸钠、0.1 mm的cacl2和1 mm的mgso4。
24.实施例1（1）将希瓦氏菌（奥奈达希瓦氏菌(shewanella oneidensis mr-1)，购自atcc美国模式菌种保藏中心，菌种编号atcc700550）接种到lb培养基中进行培养，希瓦氏菌接种量与lb培养基的体积比为0.4：100；置于温度30℃的摇床中以震荡转数200 rpm培养12h获得菌液，菌表面基本光滑无明显颗粒；（2）将lb液体培养基和m9培养基按照体积比为20:80充分混合，加热煮沸、充氮气后高压灭菌，再添加无菌乳酸钠至终浓度为18 mm，得到无氧反应缓冲液；将步骤（1）培养的希瓦氏菌液以5000rpm转速离心5min，取沉淀菌泥加入到300ml制备的无氧反应缓冲液中，其终浓度控制在od
600
=0.1；将初始浓度均为0.1m的氯化铁溶液和硫代硫酸钠溶液加入接种菌泥后的无氧反应缓冲液中，氯化铁和硫代硫酸钠终浓度为100μm；置于30℃摇床中以震荡转数200rpm培养13h，获得希瓦氏菌-纳米材料杂合细胞。
25.图1是细胞的sem表征图；图中，a是希瓦氏菌sem电镜图，b是希瓦氏菌-纳米材料杂合细胞的sem电镜图。如图1可见，希瓦氏菌呈椭圆状，构建的希瓦氏菌-纳米材料杂合细胞在希瓦氏菌胞外具有明显的纳米颗粒。培养期间肉眼观察杂合细胞颜色逐渐变黑，可知二价铁浓度逐渐增加。
26.取出保存在厌氧工作站中的希瓦氏菌-纳米材料杂合细胞，以8000 rpm离心5 min，弃去上清液，使用无氧水离心洗涤3次；再分别使用75%、100%乙醇、丙酮洗涤，将最后离心的沉淀置于厌氧工作站中干燥，沉淀干燥完成以后使用玛瑙研钵将黑色固体研磨成粉末，取适量粉末样品进行eds元素分析表征。图2 是eds元素表征图；如图2所示，可以证实铁元素和硫元素的存在，证明胞外纳米颗粒为铁硫化物。
27.实施例2本实施例中分别将野生型希瓦氏菌、无碳源希瓦氏菌、无碳源杂合细胞作为对比例，验证实施例1所构建的杂合细胞及对比例对甲基紫的去除效率。对比例的培育构建方法与实施例1基本相同，区别分别为：野生型希瓦氏菌培养环境中不添加氯化铁和硫代硫酸钠；无碳源杂合细胞的无氧反应缓冲液中不含lb和乳酸钠：无碳源希瓦氏菌除无氧反应缓冲液中不含lb和乳酸钠之外，也不添加氯化铁和硫代硫酸钠。
28.将实施例1中获得的希瓦氏菌-纳米材料杂合细胞从厌氧工作站中取出，以6000rpm，离心8min；用新鲜m9洗涤、重悬至60ml模拟甲基紫废水（实施例1制备的无氧反应缓冲液中加入终浓度为7.5mg/l的甲基紫染料）中，保持希瓦氏菌终浓度在od
600
=0.1，置于30℃摇床培养。设置取样时间分别为0h、0.25h、1h、2h、14h、26h、34h，每次取样1ml，将取得的样品于12000 rpm转速下离心5min，在580nm处利用分光光度计测定上清液中污染物甲基紫的浓度，并绘制降解曲线。采用相同方法测定对比例的甲基紫的去除效率，绘制降解曲线。
29.图3是甲基紫降解效果图；如图3可见，构建的希瓦氏菌-纳米材料杂合细胞对甲基紫的去除效率是野生型希瓦氏菌的4.3倍，是无碳源杂合细胞的3倍。希瓦氏菌-纳米材料杂合细胞具有良好的甲基紫降解效果。
30.实施例3将实施例1构建的希瓦氏菌-纳米材料杂合细胞在厌氧条件下，重悬到初始浓度为
7.5mg/l的模拟甲基紫废水中，每隔2 h取样，样品12000rpm离心5min，在580nm处利用分光光度计测定甲基紫浓度；待反应体系甲基紫降解完毕后，再次注入甲基紫废水溶液，使反应体系甲基紫浓度为7.5mg/l，直至甲基紫染料不再被降解，绘制降解曲线。
31.图4是实施例1制备的希瓦氏菌-纳米材料杂合细胞的多周期降解甲基紫效果图；由图4可见，所制备的希瓦氏菌-纳米材料杂合细胞可以实现对硫化亚铁（fes）的周期性还原降解，其单位质量fes处理能力提高了3.6倍，具有良好的细胞耐受性。具有良好的有机染料多周期还原降解前景。
32.实施例4（1）将希瓦氏菌（购自atcc美国模式菌种保藏中心，菌种编号atcc700550）接种到lb培养基中进行培养，希瓦氏菌接种量与lb培养基的体积比为0.8：100；置于温度20℃的摇床中震荡转数50 rpm培养20h获得菌液，菌液浓度od600值为0.5；（2）将lb液体培养基和m9培养基按照体积比1: 99混合后加热煮沸，充氮气后高压灭菌，添加无菌乳酸钠至终浓度为20mm得到无氧反应缓冲液；将过夜培养的希瓦氏菌液以2000rpm转速离心10min，取沉淀菌泥加入到300ml无氧反应缓冲液中，其终浓度控制在od
600
=0.05；将硝酸铁溶液和亚硫酸钠溶液加入接种菌泥后的无氧反应缓冲液中，硝酸铁和亚硫酸钠的终浓度为100μm；置于4℃摇床中以震荡转数50rpm摇床培养20h，获得希瓦氏菌-纳米材料杂合细胞。
33.将获得的希瓦氏菌-纳米材料杂合细胞3000rpm离心10min，m9培养基洗涤，加入到含有有机染料甲基紫的无氧反应缓冲液中，获得有机染料降解体系，摇床中培养至菌液终浓度od600为0.05。
34.实施例5（1）将希瓦氏菌接种到lb培养基中进行培养，希瓦氏菌接种量与lb培养基的体积比为0.8：100；置于温度10℃的摇床中，以震荡转数200 rpm培养15h获得菌液，菌液浓度od600值为2；（2）将lb液体培养基和m9培养基按照体积比1:50混合后加热煮沸，充氮气后高压灭菌，添加无菌乳酸钠至终浓度为50mm得到无氧反应缓冲液；将过夜培养的希瓦氏菌液以8000rpm转速离心2min，取沉淀菌泥加入到300ml无氧反应缓冲液中，其终浓度控制在od
600
=4；将硫酸铁溶液和低硫酸钠溶液加入接种菌泥后的无氧反应缓冲液中，硫酸铁和低硫酸钠终浓度为50μm；置于37℃摇床中以震荡转数300rpm培养5h，获得希瓦氏菌-纳米材料杂合细胞。
35.将获得的希瓦氏菌-纳米材料杂合细胞7000rpm离心5min，m9培养基洗涤，加入到含有有机染料甲基紫的无氧反应缓冲液中，获得有机染料降解体系，摇床中培养至菌液终浓度od600为5。
36.实施例6（1）将希瓦氏菌接种到lb培养基中进行培养，希瓦氏菌接种量与lb培养基的体积比为0.2：100；置于温度37℃的摇床中，以震荡转数300 rpm培养10h获得菌液，菌液浓度od600值为4；（2）将lb液体培养基和m9培养基按照体积比1: 20混合后加热煮沸，充氮气后高压灭菌，添加无菌乳酸钠至终浓度为0.1mm得到无氧反应缓冲液；将过夜培养的希瓦氏菌液以
6000rpm转速离心5min，取沉淀菌泥加入到300ml无氧反应缓冲液中，其终浓度控制在od600=2；将柠檬酸铁溶液和硫酸钠溶液加入接种菌泥后的无氧反应缓冲液中，柠檬酸铁和硫酸钠终浓度为80μm；置于37℃摇床中以震荡转数300rpm摇床培养8h，获得希瓦氏菌-纳米材料杂合细胞。
37.以上实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。