基于免疫胶体金的猕猴桃褪绿环斑病毒的可视化检测方法

1.本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种基于免疫胶体金的猕猴桃褪 绿环斑相关病毒(actinidia chlorotic ringspot-associated virus，accrav)的可视 化检测方法。


背景技术：

2.目前，基于胶体金免疫层析法而诞生的胶体金试纸条由于其良好的敏感性 和特异性，检测时间短，不需要借助专业仪器设备，可直接通过肉眼直接观察 结果，便于田间野外使用等优点而受到研究者的青睐。
3.胶体金试纸条利用抗原-抗体的特异性结合，并且以胶体金作为标记物，达 到显色的目的，以此来判断是否存在病毒。使用胶体金标记已知的特异性抗体， 再将金标抗体固定于金标垫，在nc膜上分别固定已知的特异性抗体和二抗两条 线，在检测待测样品时，将样品滴加到玻璃纤维制作的样品垫上，由于毛细作 用，样品会向金标垫流动，倘若样品中存在特异性的抗原，这些抗原会和金标 抗体中的特异性抗体结合形成复合物，继续往前流动，经过nc膜上固定特异性 抗体处时，复合物被抗体拦截，沉积在此处，显示出胶体金的颜色，达到检测 的作用，若样品中不含特异性抗原，那么经过此处时，不会有任何颜色的变化， 余下的未与特异性抗体结合的金标抗体继续向前流动，与二抗结合，出现颜色 上的变化。但现有技术中关于将胶体金试纸条应用于猕猴桃褪绿环斑相关病毒 的可视化检测的技术方案尚未见报道。因此，亟需设计一种用于基于免疫胶体 金的猕猴桃褪绿环斑病毒的可视化检测方法，以填补现有技术的空白。
4.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有猕猴桃叶片研磨后的 液体较为浓稠，影响检测速度。
5.解决以上问题及缺陷的难度为：研磨后静置，再取上层清液进行检测。
6.解决以上问题及缺陷的意义为：避免黏液堵塞试纸条，加快检测速度。


技术实现要素：

7.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于免疫胶体金的猕猴桃褪 绿环斑病毒的可视化检测方法，尤其涉及一种方便快捷的用于猕猴桃褪绿环斑 相关病毒(actinidia chlorotic ringspot-associated virus，accrav)的可视化检测 方法。
8.本发明是这样实现的，一种基于免疫胶体金的猕猴桃褪绿环斑病毒的可视 化检测方法，根据猕猴桃褪绿环斑相关病毒外壳蛋白抗体，结合lateral flowimmunoassays(lfias)试纸可视化的结果，实现对accrav的快速检测。
9.进一步，所述基于免疫胶体金的猕猴桃褪绿环斑病毒的可视化检测方法包 括以下步骤：
10.步骤一，进行胶体金标记accrav抗体的最适ph确定；
11.步骤二，进行最适抗体蛋白用量的确定；
12.步骤三，进行试纸条的组装；
13.步骤四，利用胶体金试纸条进行病毒的检测。
14.进一步，所述第一步包括：将胶体金溶液分装至包裹锡箔纸的玻璃瓶中， 检测粒径大小；
15.将ph＝5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的胶体金与过量accrav抗体进行偶 联，通过加入10％的氯化钠溶液使未被抗体包裹的胶体金发生凝集，并观察颜 色改变和测量od
525
值的变化，以ph值为横坐标，以对应的od
525
为纵坐标， 得到曲线图。
16.进一步，所述第二步包括：将胶体金溶液调整ph，与不同浓度的accrav 抗体进行偶联，通过加入10％的nacl溶液，使没有被抗体包裹的胶体金发生 凝集，并观察颜色改变和测量od
525
的值，以试管的编号为横坐标，对应的吸光 度为纵坐标，得到曲线图。
17.进一步，所述第三步包括：选择玻璃纤维膜作为样品垫，聚酯膜作为金标 垫，选择适合的nc膜和吸水纸；将样品垫裁剪为2.2cm
×
0.4cm，用样品垫处 理液浸泡2h后室温干燥后备用；将金标垫裁剪为0.5cm
×
0.4cm，用金标垫处 理液浸泡30min后室温干燥后，再用制备好的金标抗体浸湿后于37℃烘干备 用；将nc膜裁剪为2cm
×
0.4cm，分别在1cm和1.7cm处点0.2μl的accrav 抗体和羊抗兔二抗，室温干燥后滴加包被液浸润，室温干燥备用；将吸水纸裁 剪为1.7cm
×
0.4cm备用，将pvc胶板裁剪为6cm
×
0.4cm，依次将样品垫、金 标垫、nc膜、吸水纸粘附到胶板上，最后再用塑料外壳包装。
18.进一步，所述第四步包括：将制备好的金标垫、样品垫、nc膜和吸水纸组 装成试纸条并加上塑料外壳，进行金标抗体的标记与活性检测，c线固定羊抗 兔二抗，t线固定accrav抗体，分别滴加pbs、accrav抗原、含有tmv、 cmv、acv-1、acva和clbv的样品至样品垫，经层析作用后观察结果。
19.结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提 供的基于免疫胶体金的猕猴桃褪绿环斑病毒的可视化检测方法，通过胶体金标 记accrav抗体的最适ph、最适抗体蛋白用量、试纸条的组装、检测应用等， 建立了利用胶体金试纸条实现对accrav的快速检测的方法。
20.本发明根据猕猴桃褪绿环斑相关病毒外壳蛋白抗体，结合lfias试纸可视 化的结果，实现了对accrav的快速检测，利用这一方法可以在猕猴桃植株或 组培苗快速鉴定出是否含有该病毒，进而达到预防以及采取针对性措施的目的， 减少病害带来的损失；并且本发明的检测方法检测时间短，所需要设备简单， 对操作人员要求低，检测结果可视化，能够有效降低检测成本。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所 需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明 的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下 还可以根据这些附图获得其他的附图。
22.图1是本发明实施例提供的基于免疫胶体金的猕猴桃褪绿环斑病毒的可视 化检测方法流程图。
23.图2是本发明实施例提供的胶体金溶液在400～600nm波长范围内的吸收 光谱示
意图。
24.图3是本发明实施例提供的胶体金标记抗体最适ph的确定示意图。
25.图4是本发明实施例提供的胶体金溶液最适蛋白用量的确定示意图。
26.图5是本发明实施例提供的胶体金试纸条模式图。
27.图6是本发明实施例提供的accrav胶体金试纸条的特异性检测示意图。
28.图7是本发明实施例提供的accrav胶体金试纸条的性能测试结果示意 图。
具体实施方式
29.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例， 对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以 解释本发明，并不用于限定本发明。
30.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于免疫胶体金的猕猴桃褪 绿环斑病毒的可视化检测方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
31.如图1所示，本发明实施例提供的基于免疫胶体金的猕猴桃褪绿环斑病毒 的可视化检测方法包括以下步骤：
32.s101，进行胶体金标记accrav抗体的最适ph确定；
33.s102，进行最适抗体蛋白用量的确定；
34.s103，进行试纸条的组装；
35.s104，利用胶体金试纸条进行病毒的检测。
36.下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的描述。
37.本发明实施例提供的基于免疫胶体金的猕猴桃褪绿环斑病毒的可视化检测 方法包括以下步骤：
38.第一步，将购买于上海杰一生物技术有限公司的胶体金溶液分装至包裹锡 箔纸的玻璃瓶中，再检测其粒径大小，用连续波长酶标仪测量了胶体金在 400～600nm波长范围内的吸收光谱(图2)，结果表明胶体金的吸收光谱平滑， 在525nm左右有明显的吸收峰，表明购买的胶体金粒径在30nm左右。
39.将ph＝5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的胶体金与过量accrav抗体进行偶 联，通过加入10％的氯化钠溶液使未被抗体包裹的胶体金发生凝集，并观察颜 色改变和测量od
525
值的变化，以ph值为横坐标，以对应的od
525
为纵坐标， 得到如图所示(图3)的曲线图。由图可知，当ph＝8.0时，胶体金溶液颜色无 变化，未产生凝集现象，od
525
值也最大，说明ph值为8.0时是accrav抗体 的等电点稍微偏碱的ph值，因此确定最佳ph值为8.0。
40.可以扩展至其他病毒的检测，与本方法无差别。
41.第二步，将胶体金溶液调至最适ph，与不同浓度的accrav抗体进行偶联， 通过加入10％的nacl溶液，使没有被抗体包裹的胶体金发生凝集，并观察颜 色改变和测量od
525
的值，以试管的编号为横坐标，对应的吸光度为纵坐标，得 到如图(图4)所示的曲线图。由图可知，从7号开始，颜色无变化，未产生凝 集现象，曲线趋于稳定，说明7号所加的抗体量为稳定胶体金溶液的最小蛋白 量。由表可知，7号所对应的抗体量为30μg/ml，因此为稳定胶体金的最小量。 而稳定胶体金的最适量则需在此基础上再加20％，约为36μg/ml。
42.第三步，选择玻璃纤维膜作为样品垫，聚酯膜作为金标垫，选择适合的nc 膜和吸
水纸。将样品垫裁剪为2.2cm
×
0.4cm，用样品垫处理液(bsa 0.16g、蔗 糖0.16g、peg 0.04g、pvpk 0.032g、pbs 8ml溶解)浸泡2h后室温干燥后 备用；将金标垫裁剪为0.5cm
×
0.4cm，用金标垫处理液(bsa 0.16g、蔗糖0.24 g、peg 0.08g、pbs 8ml溶解)浸泡30min后室温干燥后，再用制备好的金标 抗体浸湿后于37℃烘干备用；将nc膜裁剪为2cm
×
0.4cm，分别在1cm和1.7 cm处点0.2μl的accrav抗体和羊抗兔二抗，室温干燥后滴加包被液(bsa 0.16 g、pbs 8ml溶解)浸润，室温干燥备用；将吸水纸裁剪为1.7cm
×
0.4cm备用， 将pvc胶板裁剪为6cm
×
0.4cm。按图5，依次将样品垫、金标垫、nc膜、吸 水纸粘附到胶板上，最后再用塑料外壳包装。
43.第四步，将制备好的金标垫、样品垫、nc膜和吸水纸组装成试纸条并加 上塑料外壳，进行金标抗体的标记与活性检测，结果如图6所示，c线固定羊 抗兔二抗，t线固定accrav抗体，分别滴加pbs(阴性对照)、accrav抗 原(阳性对照)、含有tmv、cmv、acv-1、acva和clbv的样品至样品垫， 经层析作用，只有滴加的试纸条在检测线和控制线都出现了紫色的点，而只滴 加pbs、含有tmv、cmv、acv-1、acva和clbv的样品的试纸条只有控制 线出现了紫色圆点，这一结果表明，金标抗体均只与特异化抗原和二抗结合， 制备的金标抗体活性良好，能进行特异性反应。
44.下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
45.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种方便快捷的用于检测猕 猴桃accrav的可视化检测方法。通过以下技术方案来实现：包括胶体金标记 accrav抗体的最适ph、最适抗体蛋白用量、试纸条的组装、检测应用等，建立 了利用胶体金试纸条实现对accrav的快速检测的方法。
46.本发明的有益效果是：本发明根据猕猴桃褪绿环斑相关病毒外壳蛋白抗体， 结合lfias试纸可视化的结果，实现了对accrav的快速检测，利用这一方法可 以在猕猴桃植株或组培苗快速鉴定出是否含有该病毒，进而达到预防以及采取 针对性措施的目的，减少病害带来的损失；并且本发明的检测方法检测时间短， 所需要设备简单，对操作人员要求低，检测结果可视化，能够有效降低检测成 本。
47.下面结合试验对本发明的技术效果作详细的描述。
48.将12份待检测的猕猴桃叶片分别用胶体金试纸条和rt-pcr进行检测，结 果如图7所示，结果显示，12份样品中，胶体金试纸条法检测到5份阳性，7 份阴性。rt-pcr检测结果与胶体金试纸条检测结果一致。通过胶体金试纸条层 析法与rt-pcr检测结果对比可知，二者检测结果完全一致，说明胶体金试纸 条可以作为猕猴桃褪绿环斑病毒检测的一种辅助手段。
49.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于 此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明 的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的 保护范围之内。