一种抑制神经长入的复合纤维环凝胶制备方法及应用

1.本发明涉及生物材料技术领域，特别涉及一种抑制神经长入的复合纤维环凝胶制备方法及应用。


背景技术：

2.椎间盘退变，是下腰痛的主要病因之一，患病率和致残率均高。退变椎间盘中存在大量m1型巨噬细胞，可通过释放神经生长因子(nerve growth factor，ngf)及促炎因子，形成慢性炎性微环境，诱导神经长入内层纤维环，并造成神经敏化，从而诱发椎间盘性腰痛。故如何制备一种功能化材料，有效调控退变椎间盘中的慢性炎性微环境和其介导的神经长入及敏化，从而缓解腰疼症状，是亟待解决的难题。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种抑制神经长入的复合纤维环凝胶制备方法及应用，以解决现有技术中存在的技术缺陷。
4.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
5.一种抑制神经长入的复合纤维环凝胶制备方法，包括以下步骤：
6.1)将离体的牛尾椎间盘髓核组织浸入表面活性剂中，反复冻融后继续加入表面活性剂进行振荡处理以破坏细胞膜结构，然后采用十二烷基硫酸钠洗涤、加dna酶振荡处理去除残留dna，最后灭菌、真空冷冻干燥，得到daf材料；
7.在daf材料中加入盐酸和胃蛋白酶，调节ph至7.3-7.5，于37℃水浴锅中放置10-30min，得到daf水凝胶；放置4℃或-20℃冰箱待用；
8.2)将trka-in-1和阳离子聚合物溶解于dmso中，加水搅拌，透析，得到ti-cnp溶液；具体的：取阳离子聚合物以1-4％w/v溶解于dmso中，得到溶液a；取小分子药物trka-in-1以0.25-1％w/v溶解于dmso中，得到溶液b，将溶液b逐滴滴加进溶液a中，边滴加边搅拌，加水继续搅拌，透析，得到ti-cnp溶液；
9.3)将ti-cnp溶液与步骤1)得到的daf水凝胶以体积比1:1混合，振荡，得到ti-cnp-daf水凝胶，即抑制神经长入的复合纤维环凝胶，具体的：将ti-cnp溶液与daf水凝胶以体积比1:1混合，振荡，得到ti-cnp-daf水凝胶，即抑制神经长入的复合纤维环凝胶，放至4℃或-20℃冰箱待用(若3天内使用，则置于4℃条件下存放；若长期存放则置于-20℃的条件下)。
10.进一步地，步骤1)所述表面活性剂为1-3wt％tritonx-10；所述dna酶酶活力为100-300u/ml。
11.进一步地，步骤1)所述盐酸加入量至daf溶液浓度为5-10mg/ml；所述daf与胃蛋白酶的质量比为(10-15)：1。
12.步骤1)所述离心转速为10000-15000r/min，时间为10-15min，弃去难以溶解的组织颗粒。
13.步骤2)所述trka-in-1和阳离子聚合物的质量比为1：(2-8)。
14.进一步地，所述阳离子聚合物(cnp)为包括壳聚糖(cs)、聚乙烯亚胺(pei)、聚赖氨酸(pll)，以及壳聚糖(cs)、聚乙烯亚胺(pei)、聚赖氨酸(pll)与聚己内酯(pcl)、聚丙交酯(pla)和聚乙交酯(pga)的共聚物、与聚碳酸酯(pc)的两亲性接枝(g)或嵌段(b)共聚物，包括cs-g-pcl、cs-g-pla、cs-g-pga、cs-g-plga、cs-g-pc、pcl-b-pei、pla-b-pei、pga-b-pei、plga-b-pei、pc-b-pei、pcl-b-pll、pla-b-pll、pga-b-pll、plga-b-pll、pc-b-pll。
15.进一步地，步骤2)所述透析具体是指：采用分子量为3000w的透析袋在装满超纯水的烧杯中透析2-4d，将透析液更换为50％乙醇，继续透析24h，最后将透析液更换为超纯水，透析24h。
16.进一步地，步骤3)所述ti-cnp溶液的浓度为0.4-1％(w/v)。
17.本发明还提供一种利用上述方法得到的抑制神经长入的复合纤维环凝胶。
18.本发明还提供一种抑制神经长入的复合纤维环凝胶在椎间盘组织工程材料的构建中的应用。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
20.dna等核酸作为细胞破裂所释放的损伤相关分子模式(damage-associated molecularpatterns,damps)的主要成分之一，已被证实是诱导巨噬细胞发生炎症反应的重要分子，本发明首先制备了纤维环脱细胞基质(decellularized annulus fibrosus，daf)水凝胶，该水凝胶具有诱导干细胞向纤维环细胞定向分化，缓解椎间盘组织退变的作用。然后采用阳离子聚合物，通过自组装形成cnp，其对核酸分子具有强的结合能力，可有效减少核酸cpg诱导的巨噬细胞m1型极化，cnp可能通过改善局部炎症微环境，维持干细胞生物学功能，有利于daf更好地发挥促进干细胞向纤维环细胞定向分化的作用。最后再利用两亲性阳离子聚合物将疏水药物trka-in-1包载在内核中形成载药纳米颗粒(ti-cnp)，ti-cnp被神经元轴突摄取后释放trka-in-1，阻断疼痛受体trka的胞内活性区。同时，cnp改善炎症环境，也可减轻炎性激惹造成的疼痛。从而在多个层面实现抑制神经生长和致痛物质释放的目的。
21.本发明通过拟构建ti-cnp-daf，通过研究证明ti-cnp-daf能调控炎性微环境，并抑制神经长入及神经敏化，从而缓解椎间盘源性腰痛。同时，炎性微环境的抑制还能利于组织的再生修复，提升椎间盘修复效果。本发明所制备的新型复合椎间盘修复材料可高效抑制椎间盘内炎性微环境及其介导的下游神经长入和敏化，实现对椎间盘源性腰痛各环节的全面阻断，为椎间盘组织工程材料的设计提供了新的思路。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
23.图1为搭载姜黄素的pc-b-pei纳米颗粒的药物释放图；
24.图2为pc-b-pei纳米颗粒(cnp)抑制cpg诱导的巨噬细胞炎症因子合成的效应图；
25.图3为ti-cnp的构建及性能检测，其中，a，搭载trka-in-1的pc-b-pei纳米颗粒的载药效率和载药量；b，载药阳离子纳米颗粒的紫外波普图；c，载药阳离子纳米颗粒的透射
电镜；d，载药阳离子纳米颗粒的zeta电位和粒径检测；e，rt-qpcr检测载药阳离子纳米颗粒抑制致痛因子合成的作用；f，蛋白印迹检测载药阳离子纳米颗粒抑制致痛因子合成的作用；
26.图4为ti-cnp-daf的构建，其中，a，苏木精-伊红染色法检测新鲜纤维环组织(faf)和daf的组分和结构；b，dapi荧光染色检测新鲜纤维环组织(faf)和daf的细胞组分；c，daf、cnp-daf和ti-cnp-daf的扫描电镜检测；
27.图5为ti-cnp-daf抑制神经元合成致痛物质的功能检测，其中，a，免疫荧光显示致痛因子cgrp，神经元标记物(pgp9.5)，细胞核标记物(dapi)及cgrp平均荧光强度统计图；b，免疫荧光显示致痛因子tac1，神经元标记物(pgp9.5)，细胞核标记物(dapi)及tac1平均荧光强度统计图。
具体实施方式
28.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
29.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
30.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
31.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
32.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
33.本发明所用牛尾椎间盘髓核组织为市场上购买。
34.一种抑制神经长入的复合纤维环凝胶制备方法，包括以下步骤：
35.(1)纤维环脱细胞基质(daf)水凝胶的制备
36.取离体的、年龄在2-6岁的牛尾椎间盘髓核组织剪碎放入50ml离心管，加入质量分数为1-3％tritonx-10浸没组织。将离心管完全浸入液氮冷冻10min，然后在37℃水浴锅中放置至完全解冻，如此反复冻融5次。加入质量分数为1-3％tritonx-10振荡48-96h以破坏细胞膜结构，然后用质量分数为0.5-2％十二烷基硫酸钠洗涤12-24h、100-300u/ml dna酶在37℃条件下振荡处理12-24h去除残留dna。最后用灭菌双蒸水清洗3-5次，进行真空冷冻干燥后获得daf材料。
37.称取一定量灭菌后的daf材料，加入0.01m盐酸中，使daf浓度为5-10mg/ml，按daf
与胃蛋白酶质量比为10-15:1的比例加入胃蛋白酶，室温持续搅拌24-48h，将溶解消化后的daf进行离心(10000-15000r/min，10-15min)，弃去难以溶解的组织颗粒，将溶解好的daf分装至2ml离心管中，调节ph至7.3-7.5，于37℃水浴锅中放置10-30min，最后将获得的水凝胶放至4℃或-20℃冰箱待用。
38.(2)负载疏水性trka拮抗剂(trka-in-1，ti)的cnp/daf水凝胶(ti-cnp-daf)的构建
39.取阳离子聚合物以1-4％w/v溶解于dmso(二甲基亚砜)中，得到溶液a；取小分子药物trka-in-1以0.25-1％w/v溶解于dmso中，得到溶液b，将溶液b逐滴滴加进溶液a中，边滴加边搅拌，得到的混合液阳离子与trka-in-1的质量比为(2-8)：1。逐滴滴加反应溶液总体积2-4倍体积的超纯水，边滴加边搅拌。若出现絮状沉淀可超声振荡，至无明显沉淀。利用透析袋(3000w左右分子量)在装满超纯水的烧杯中透析2-4d后，将透析液更换为50％乙醇，继续透析24h，最后将透析液更换为超纯水，透析24h，得到ti-cnp溶液。
40.将阳离子聚合物浓度为0.4-1％w/v的ti-cnp溶液与daf以1：1的体积比振荡混合，得到ti-cnp-daf水凝胶，即抑制神经长入的复合纤维环凝胶，最后将获得的水凝胶放置4℃或-20℃冰箱待用。
41.实施例1
42.一种抑制神经长入的复合纤维环凝胶制备方法，包括以下步骤：
43.(1)纤维环脱细胞基质(daf)水凝胶的制备
44.取年龄在2-6岁的牛尾椎间盘髓核组织剪碎放入50ml离心管，加入质量分数为2％tritonx-10浸没组织。将离心管完全浸入液氮冷冻10min，然后在37℃水浴锅中放置至完全解冻，如此反复冻融5次。加入质量分数为2％tritonx-10振荡72h以破坏细胞膜结构，然后用质量分数为1％十二烷基硫酸钠洗涤18h、200u/ml dna酶在37℃条件下振荡处理18h去除残留dna。最后用灭菌双蒸水清洗4次，进行真空冷冻干燥后获得daf材料。
45.称取一定量灭菌后的daf材料，加入0.01m盐酸中，使daf浓度为7.5mg/ml，按daf与胃蛋白酶质量比为12:1的比例加入胃蛋白酶，室温持续搅拌36h，将溶解消化后的daf进行离心(12000r/min，12min)，弃去难以溶解的组织颗粒，将溶解好的daf分装至2ml离心管中，调节ph至7.4，于37℃水浴锅中放置20min，最后将获得的水凝胶放至4℃冰箱待用。
46.(2)负载疏水性trka拮抗剂(trka-in-1，ti)的cnp/daf水凝胶(ti-cnp-daf)的构建
47.二嵌段聚碳酸酯p(mtc-chol)
20-b-pac
25
的合成：以苯甲醇bnoh作为引发剂，dbu/tu作为催化剂，mtc-chol和ac作为单体，干燥的cdcl2作为溶剂，在手套箱中室温下发生开环聚合制备而得。p(mtc-chol)
20-b-pac
25
与pei
600
分别溶于dmf中。室温下，p(mtc-chol)
20-b-pac
25
的dmf溶液逐滴滴加进pei
600
/dmf溶液中，反应30min，随后利用ch3i与多余的pei
600
的氨基反应，加入过量的nacl饱和溶液进行离子置换，随后进行透析与冻干，得到侧基为pei
600
修饰的pc-b-pei聚合物。
48.取pc-b-pei聚合物以2.5％w/v溶解于dmso中，得到溶液a；取小分子药物trka-in-1以0.6％w/v溶解于dmso中，得到溶液b，将溶液b逐滴滴加进溶液a中，边滴加边搅拌，得到的混合液pc-b-pei与trka-in-1的质量比为6：1。逐滴滴加反应溶液总体积3倍体积的超纯水，边滴加边搅拌。若出现絮状沉淀可超声振荡，至无明显沉淀。利用透析袋(3000w左右分
子量)在装满超纯水的烧杯中透析3d后，将透析液更换为50％乙醇，继续透析24h，最后将透析液更换为超纯水，透析24h，得到ti-cnp溶液。
49.(3)将pc-b-pei聚合物浓度为2％w/v的ti-cnp溶液与daf以1：1的体积比振荡混合，得到ti-cnp-daf水凝胶，即抑制神经长入的复合纤维环凝胶。
50.实施例2
51.一种抑制神经长入的复合纤维环凝胶制备方法，包括以下步骤：
52.(1)纤维环脱细胞基质(daf)水凝胶的制备
53.取年龄在2-6岁的牛尾椎间盘髓核组织剪碎放入50ml离心管，加入质量分数为1％tritonx-10浸没组织。将离心管完全浸入液氮冷冻10min，然后在37℃水浴锅中放置至完全解冻，如此反复冻融5次。加入质量分数为1％tritonx-10振荡48h以破坏细胞膜结构，然后用质量分数为2％十二烷基硫酸钠洗涤12h、100u/ml dna酶在37℃条件下振荡处理12h去除残留dna。最后用灭菌双蒸水清洗3次，进行真空冷冻干燥后获得daf材料。
54.称取一定量灭菌后的daf材料，加入0.01m盐酸中，使daf浓度为5mg/ml，按daf与胃蛋白酶质量比为10:1的比例加入胃蛋白酶，室温持续搅拌24h，将溶解消化后的daf进行离心(10000r/min，15min)，弃去难以溶解的组织颗粒，将溶解好的daf分装至2ml离心管中，调节ph至7.3，于37℃水浴锅中放置10min，最后将获得的水凝胶放至4℃冰箱待用。
55.(2)负载疏水性trka拮抗剂(trka-in-1，ti)的cnp/daf水凝胶(ti-cnp-daf)的构建
56.取pc-b-pei聚合物以1％w/v溶解于dmso中，得到溶液a；取小分子药物trka-in-1以0.25％w/v溶解于dmso中，得到溶液b，将溶液b逐滴滴加进溶液a中，边滴加边搅拌，得到的混合液pc-b-pei与trka-in-1的质量比为2：1。逐滴滴加反应溶液总体积2倍体积的超纯水，边滴加边搅拌。若出现絮状沉淀可超声振荡，至无明显沉淀。利用透析袋(3000w左右分子量)在装满超纯水的烧杯中透析2d后，将透析液更换为50％乙醇，继续透析24h，最后将透析液更换为超纯水，透析24h，得到ti-cnp溶液。
57.(3)将pc-b-pei聚合物浓度为0.4％w/v的ti-cnp溶液与daf以1：1的体积比振荡混合，得到ti-cnp-daf水凝胶，即抑制神经长入的复合纤维环凝胶。
58.实施例3
59.一种抑制神经长入的复合纤维环凝胶制备方法，包括以下步骤：
60.(1)纤维环脱细胞基质(daf)水凝胶的制备
61.取年龄在2-6岁的牛尾椎间盘髓核组织剪碎放入50ml离心管，加入质量分数为3％tritonx-10浸没组织。将离心管完全浸入液氮冷冻10min，然后在37℃水浴锅中放置至完全解冻，如此反复冻融5次。加入质量分数为3％tritonx-10振荡48h以破坏细胞膜结构，然后用质量分数为0.5％十二烷基硫酸钠洗涤24h、300u/ml dna酶在37℃条件下振荡处理24h去除残留dna。最后用灭菌双蒸水清洗5次，进行真空冷冻干燥后获得daf材料。
62.称取一定量灭菌后的daf材料，加入0.01m盐酸中，使daf浓度为10mg/ml，按daf与胃蛋白酶质量比为15:1的比例加入胃蛋白酶，室温持续搅拌48h，将溶解消化后的daf进行离心(15000r/min，10min)，弃去难以溶解的组织颗粒，将溶解好的daf分装至2ml离心管中，调节ph至7.5，于37℃水浴锅中放置30min，最后将获得的水凝胶放至4℃或-20℃冰箱待用。
63.(2)负载疏水性trka拮抗剂(trka-in-1，ti)的cnp/daf水凝胶(ti-cnp-daf)的构
建
64.取pc-b-pei聚合物以4％w/v溶解于dmso中，得到溶液a；取小分子药物trka-in-1以1％w/v溶解于dmso中，得到溶液b，将溶液b逐滴滴加进溶液a中，边滴加边搅拌，得到的混合液pc-b-pei与trka-in-1的质量比为8：1。逐滴滴加反应溶液总体积4倍体积的超纯水，边滴加边搅拌。若出现絮状沉淀可超声振荡，至无明显沉淀。利用透析袋(3000w左右分子量)在装满超纯水的烧杯中透析4d后，将透析液更换为50％乙醇，继续透析24h，最后将透析液更换为超纯水，透析24h，得到ti-cnp溶液。
65.(3)将pc-b-pei聚合物浓度为1％w/v的ti-cnp溶液与daf以1：1的体积比振荡混合，得到ti-cnp-daf水凝胶，即抑制神经长入的复合纤维环凝胶，最后将获得的水凝胶放置4℃或-20℃冰箱待用。
66.试验例1
67.为检测材料的释药性能，利用实施例1中的pc-b-pei作为载体材料，在自组装过程中将疏水性指示剂姜黄素(curcumin)装载在核内，获得cur-loaded pc-b-pei球形纳米胶束(图1)。对于cur-loaded pc-b-pei释放实验，选取载药量一定的curcumin-loaded pc-b-pei载药胶束于1000d透析袋中做载药释放实验，ph＝7.4的pbs缓冲溶液中进行释放，每隔一定时间取走2ml pbs并补充2ml新鲜的pbs缓冲溶液。利用荧光分光光度计rf5301测定pbs中curcumin的浓度，激发波长为442nm，扫描范围为480～600nm，激发光带宽和发射光带宽均为10nm，实验全程避光处理，6h内，curcumin释放为8.1％，而后每48h内释放11％左右的药量，总体呈现缓释的趋势。以上结果说明，pc-b-pei阳离子纳米颗粒(cnp)已成功构建，并具有良好的缓释药物能力。核酸cpg刺激可明显促进巨噬细胞合成tnf-α、il-1β、il-6、il-12炎症因子，cnp(500μg/mll)可显著抑制这些炎症因子的合成，说明cnp可明显减少核酸cpg对于巨噬细胞刺激作用，炎症表型被显著抑制(见图2)。
68.试验例2
69.按照实施例1中ti-cnp溶液的制备方法，将trka-in-1与试验例1制备的curcumin-loaded pc-b-pei为原料制备trka-in-1-loaded pc-b-pei。称取一定质量的冻干trka-in-1-loaded pc-b-pei溶解于dmso，利用荧光分光光度计rf5301测定载药量，扫描范围为200-400nm，激发光带宽和发射光带宽均为5nm。结果显示，载药效率达72.66％
±
8.8％，载药量达9.08％
±
1.1％(图3a)。紫外扫描显示，trk-in-1已载入聚合物纳米胶束中(图3b)。载入trka-in-1后，纳米颗粒的形貌发生了明显改变，而且体积也明显增大，但是并未显著改变阳性电位(图3c-d)。
70.将0.05％w/v pc-b-pei和含0.05％pc-b-pei的ti-cnp溶液加入到大鼠背根神经节细胞中，添加或不添加神经生长因子(ngf，100ng/ml)，培养3天后检测致痛物质(cgrp和tac1)的mrna和蛋白表达水平，结果显示ti-cnp可显著减少致痛物质的合成(图3e-f)，说明ti-cnp可释放trka-in-1阻断trka受体，从而抑制ngf对致痛物质合成的促进作用。cgrp-降钙素基因相关肽；tac1-前激肽原1。
71.载药效率(encapsulation efficiency，ee％)＝(载药胶束中含药量/最初投药量)*100％；
72.载药量(drug loading efficiency，dle％)＝(载药胶束中含药量/载药胶束总质量)*100％。
73.试验例3
74.将新鲜的纤维环faf和实施例1制备的daf作为原料，用he染色和dapi染色检测，结果显示，脱细胞处理方法可显著减少组织中的细胞成分，并保留细胞外基质成分(图4a-b)。扫描电镜显示，daf、cnp-daf和ti-cnp-daf均有较大的孔隙(图4c)。说明cnp和ti-cnp负载入daf，不会对孔隙造成明显的影响。
75.将大鼠背根神经元培养在预先铺上daf、cnp-daf、ti-cnp-daf水凝胶的细胞培养板上，添加ngf(100ng/ml)，培养3天后荧光检测致痛物质(cgrp和tac1)，统计结果显示ti-cnp-daf可显著减少致痛物质cgrp和tac1的合成(图5a-b)。综上，从图中可以看出，ti-cnp可释放trka-in-1阻断trka受体，从而抑制ngf对致痛物质合成的促进作用。
76.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。