多糖碳纳米胶及其制备方法与其药学组成物

1.本发明涉及纳米聚合物工程领域，尤其本发明还涉及酚多糖纳米胶及其在抗 凝血、抗肿瘤和抗氧化的应用。本发明另涉及制备酚多糖纳米胶的方法。


背景技术：

2.凝血块是透过一系列多方面的反应形成的，此些反应是在血管受损时发生的。 所述凝血级联反应(cascade)由数种凝血因子及凝血酶激活，其中凝血酶是透过 其酶原凝血酶的一系列蛋白质水解过程所形成的丝胺酸蛋白酶(thromb.res. 2014；133:s139-s148)。凝血酶透过从其三个次单元中的两个(α链、β炼和 γ链)切割得到小胜肽(即纤维蛋白肽a和纤维蛋白肽b)来催化纤维蛋白原的聚 合。具有d和e结构域的可溶性二聚体纤维蛋白原透过聚合作用转化为不溶性纤 维蛋白，从而阻止血液流动并促进止血，进而防止大量失血。惟，血栓形成症(一 种可能导致动脉和静脉血栓形成的凝血异常)可能对肺、脑或心脏造成严重损害， 甚至可能导致肺栓塞、中风、心脏缺血和急性心肌梗塞(blood transfus.2011； 9:120-138)。因此，有效预防和治疗异常血栓形成至关重要。一般而言，治疗 涉及透过干扰凝血途径中一种或多种凝血因子的产生和/或减少血小板聚集来预 防血管栓塞，从而避免血管内血块的形成并减少血栓形成。大多数抗凝血剂透过 抑制不同的凝血因子而作用，凝血因子分为直接抑制剂、间接抑制剂和维生素k 拮抗剂(thromb.haemost.2015；113:931-942)。维生素k拮抗剂(如华法林 (warfarin))透过干扰维生素k环氧还原酶而作用，该酶可催化维生素k依赖 性凝血因子(例如因子ii、vii、ix和x)的肝羧化反应。直接凝血酶抑制剂(directthrombin inhibitor，dti)，例如阿加曲班(argatroban)、达比加群(dabigatran) 和比伐努定(bivalirudin)，直接抑制凝血酶活性。肝素和低分子量肝素，例如 依诺肝素(enoxaparin)、磺达肝素(fondaparinux)和阿哌沙班(apixaban)， 是广泛使用的间接抗凝剂，主要透过抑制xa因子而发挥作用(drug discov.today 2010；15:1058-1069)。然而，最常使用的抗凝剂华法林和肝素具有明显的局限 性，包括治疗范围狭窄、半衰期长、药物相互作用众多以及副作用(例如出血、 恶心和肾毒性)。因此，肝素和华法林的这些局限性激发了新型抗凝剂的开发。
3.由多个酚结构单元组成的天然多酚分子广泛分布于水果、蔬菜、种子和各种 藻类中。它们具有抗癌、抗糖尿病、抗炎、抗氧化剂和抗凝血功能(molecules 2016； 21:708；crit.rev.food sci.nutr.2016；56:419-444；nutrients 2016；8: 552)。例如，据shobharani等人报导，来自sargassum sp.的纯化萃取物，其含 有多醣和多酚，具有抗凝血特性(int.j.biol.macromol.2014；65:542-548)。 bijak等人则发现黑苦莓和葡萄籽中富含多酚的萃取物具有抗凝血酶的作用 (phytother.res.2013；27(1):71-76)，而malinowska等人另报导，上述萃 取物由于其抗凝血活性而具有预防血小板活化和心血管症状的潜力(eur.j.nutr. 2013；52(3):1049-1057)。在进行这些研究之前，系统性地研究了一系列天然 黄酮类化合物，它们在苯环(a和b)和杂环(c)上含有不同的酚或羟基，以抑 制凝血酶。发现苯酚基团的数目及其位置与其抗凝血活性有关(thromb.res.2010； 126:
e365-e378)。然而，天然多酚酸化合物存在稳定性问题，且其丰度低，以 及复杂的萃取和纯化过程使其更加昂贵。若能开发新的材料，既具有天然多酚酸 分子的抗癌、抗糖尿病、抗炎、抗氧化剂和抗凝血功能，又能克服天然多酚化合 物的稳定性及纯化萃取问题，并确保能应用于人体，将对医疗有极大的贡献。


技术实现要素：

4.基于前述内容，本发明提供一种由生物启发且环保的一锅合成(one-potsynthesis)制法，其由具有成本效益且易于取得的多糖中制备纳米胶，而无需使 用任何催化剂和有毒溶剂。
5.在一方面，本发明提供具有抗凝血活性、抗肿瘤和抗氧化活性的酚多糖纳米 胶。在至少一个实施例中，所述纳米胶包括类石墨烯纳米片及多糖，其中，所述 类石墨烯纳米片与多糖经复合以形成交联的超分子结构。
6.在至少一个实施例中，类石墨烯纳米片包含至少一部分多糖的碳化产物。在 一些实施例中，所述碳化产物透过干式加热多糖而形成。
7.在至少一个实施例中，多糖为海藻酸的盐类，例如海藻酸钠、海藻酸钙、海 藻酸镁及其任何组合。
8.在至少一个实施例中，多糖具有自由端和固定端，且多糖的固定端结合至类 石墨烯纳米片的表面。
9.在至少一个实施例中，交联的超分子结构在其表面上具有官能基。在一些实 施例中，该官能基选自羟基、酯、酚、羧基及其任何组合。
10.在至少一个实施例中，酚多糖纳米胶的水合直径范围为20纳米(nm)至490nm， 例如，水合直径的下限不小于20nm或上限为不大于490nm，例如约45nm、约 50nm、约60nm、约80nm、约100nm、约120nm、约150nm、约180nm、约 200nm、约225nm、约250nm、约275nm、约300nm、约350nm、约400nm、 约425nm、约450nm以及约460nm。在一些实施例中，酚多糖纳米胶的水合直 径范围为40nm至250nm。
11.在至少一个实施例中，酚多糖纳米胶的ζ-电位在-26.5mv(zeta potential) 至-47.5mv的范围内，例如，ζ电位下限不小于-47.5mv或上限不大于-26.5mv。 在一些实施例中，酚多糖纳米胶具有在-30mv至-45mv范围内的ζ电位，例如， 约-32.5mv、约-35mv、约-37.5mv、约-40mv以及约-42.5mv。
12.在至少一个实施例中，类石墨烯纳米片具有(100)和(112)晶格平面。
13.在一态样，本发明另提供一种制备上述酚多糖纳米胶的方法，所述方法包括 透过干式加热使多糖碳化。在一些实施例中，进一步包括将碳化的多糖溶解在水 中。
14.在至少一个实施例中，干式加热在150℃至300℃的温度下进行，例如，下限 不小于150℃或上限不大于300℃。在一些实施例中，加热温度在180℃至300℃ 的范围内，例如，大约190℃、大约200℃、大约210℃、大约220℃、大约230 ℃、大约240℃、大约250℃、大约260℃、大约270℃、大约280℃和大约290℃。
15.在另一方面，本发明提供一种用于抗凝血的组合物，例如用于预防或治疗易 于透过抗凝血剂所改善的疾病或病症的药学组成物。所述组合物包含上述酚多糖 纳米胶中的任何一种及其药学上可接受的载体。
16.在另一方面，本发明提供一种用于抗氧化的组合物，例如用于预防或治疗易 于透过抗氧化剂所改善的疾病或病症的药学组成物。所述组合物包含上述酚多糖 纳米胶中的任何一种及其药学上可接受的载体。
17.又一方面，本发明提供一种用于抗肿瘤的组合物，例如用于预防或治疗肿瘤 转移的药学组成物。所述组合物包含上述酚多糖纳米胶中的任何一种及其药学上 可接受的载体。
18.又一方面，本发明提供一种上述酚多糖纳米胶在制备预防或治疗疾病或病症 的药学组成物的应用，其特征在于所述疾病或病症是易于透过抗凝血剂或抗氧化 剂所改善的疾病或病症或是肿瘤疾病或病症。
19.在至少一个实施例中，抗凝血剂或抗氧化剂易于改善的疾病或病症可以是血 栓形成症、血管血栓形成、肺栓塞、心脏缺血、缺血性中风、隐源性中风 (cryptogenic stroke)、来源不明的栓塞性中风、心肌梗塞、肺动脉高压(pulmonaryarterial hypertension)、或气喘。
20.在至少一个实施例中，肿瘤疾病或病症系选自由膀胱癌、骨癌、血癌、乳癌、 黑色素瘤、甲状腺癌、副甲状腺癌、骨髓癌、直肠癌、咽喉癌、喉癌、肺癌、食 道癌、胰腺癌、胃癌、舌癌、皮肤癌、脑瘤、子宫癌、头颈癌、胆囊癌、口腔癌、 结肠癌、肛围癌(anal and perianal cancers)、中枢神经系统肿瘤、肝癌、及结 直肠癌所组成的群组。
21.本发明中提供的纳米胶是类石墨烯纳米片嵌入的多酚海藻酸盐纳米胶(以下 称为「graphene-like nanosheet-embedded polyphenolic-alginate nanogels， gns/alg-ngs」)，其透过缩聚(交联)、碳化和在对多糖(例如海藻酸钠)进行 干式加热反应过程中原位钝化而形成，如图1a所示，不需使用任何化学催化剂 或溶剂。此外，嵌入类石墨烯量子点(gqds)的海藻酸纳米胶(gqds/alg-ngs)由于 具有多酚酸等官能基团，因此具有良好的抗氧化活性。gns/alg-ngs具有高水溶性、 生物兼容性和优异的抗凝血特性，使其成为治疗血栓性疾病的潜在候选药物，如 图1b所示。由于gns/alg-ngs对凝血酶的强亲和力及对其他凝血因子(例如， 因子v、vii、xi和xii)的抑制作用，其具有较高的抗凝血活性。此外，gns/alg-ngs 的部分碳化结构上酚基的形成涉及其抗凝血活性。介导gns/alg-ngs抗凝血活性 的多种机制使其成为预防异常血栓形成的有效抗凝血剂。另外，抗癌细胞迁移实 验、抑制癌细胞侵袭实验及动物实验显示有优异的抗肿瘤转移活性以及肿瘤组织 滞留性，具有与目前治疗癌症的药物，进行协同治疗的高度潜力，也可成为治疗 癌症的潜在候选药物。
附图说明
22.图1a显示agns/alg-ng的制备示意图以及gns/alg-ng碳量子点(carbonquantum dots,cqd)推测结构示意图，其中，1表示海藻多糖分子结构式，2表示 未碳化完全之聚合物，3表示纳米胶体，4表示石墨。图1b显示抗凝血应用的示 意图。
23.图2的照片由左至右依序显示去离子水中的alg-ngs-150、alg-ngs-180、 gns/alg-ngs-210、gns/alg-ngs-240、gns/alg-ngs-270和gns/alg-ngs-300经离 心后的分散情形。
24.图3显示透过琼脂凝胶电泳测定法所测量海藻酸钠、alg-ngs和gns/alg-ngs 的电荷和尺寸分布。
25.图4a(a)至(f)分别显示在不同温度下合成所制备产物的穿透式电子显微镜 (transmission electron microscopy，tem)图像。图4b(a)至(f)分别显示高解 析穿透式电子显微镜(high-resolution transmission electron microscopy， hrtem)图像。
26.图5a和图5b分别显示海藻酸钠、alg-ngs和gns/alg-ngs的紫外线-可见光 (uv-vis)吸收和荧光光谱。
27.图6(a)至(g)分别显示海藻酸钠、alg-ngs-150、alg-ngs-180、 gns/alg-ngs-210、gns/alg-ngs-240、gns/alg-ngs-270和gns/alg-ngs-300的x 射线衍射(x-ray diffraction，xrd)光谱。
28.图7a(a)至(g)分别显示透过x射线光电子能谱法(x-ray photoelectronspectroscopy，xps)所检测到海藻酸钠、alg-ngs-150、alg-ngs-180、 gns/alg-ngs-210、gns/alg-ngs-240、gns/alg-ngs-270和gns/alg-ngs-300的 c1s xps光谱。图7b(a)至(g)分别显示透过x射线光电子能谱法(x-rayphotoelectron spectroscopy，xps)所检测到海藻酸钠、alg-ngs-150、 alg-ngs-180、gns/alg-ngs-210、gns/alg-ngs-240、gns/alg-ngs-270和 gns/alg-ngs-300的o1s xps光谱。
29.图8显示透过傅立叶变换红外光谱法(fourier transform infraredspectroscopy，ft-ir)所检测到海藻酸钠、alg-ngs和gns/alg-ngs的ft-ir光 谱。
30.图9(a)至(f)显示透过在270℃下加热海藻酸钠10至240分钟来形成 gns/alg-ngs的时程形成(time-course formation)的tem图像。
31.图10显示所提出的gns/alg-ngs-270的形成机制示意图。
32.图11a至图11c显示海藻酸钠的热重分析(thermogravimetric analysis， tga)和差示扫描量热法(differential scanning calorimetry，dsc)的结果。 图11a显示在150℃至300℃下海藻酸钠的恒定tga数据。150：alg-ngs-150；180： alg-ngs-180；210：gns/alg-ngs-210；240：gns/alg-ngs-240；270： gns/alg-ngs-270；300：gns/alg-ngs-300。图11b显示海藻酸钠的温度依赖性tga。 图11c显示海藻酸钠的dsc曲线。
33.图12显示海藻酸钠和gns/alg-ngs-270的2,2-二苯基-1-吡啶并肼基 (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，dpph)清除活性。
34.图13a至图13c显示在298k以及氘化水(d2o)的环境中浓度为50mg/ml的 海藻酸钠(图13a)及gns/alg-ngs-270(图13b和图13c)的1h核磁共振(nuclearmagnetic resonance，nmr)谱。
35.图14a至图14d显示gns/alg-ngs的体外抗凝血反应，其中图14a显示散射 光强度；图14b显示凝血酶凝血时间(thrombin clotting time，tct)；图14c 显示凝血酶原时间(prothrombin time，pt)；图14d显示活化的部分凝血原激 酶时间(activated partial thromboplastin time，aptt)；ctrl：控制组。
36.图15显示具有或不具有gns/alg-ngs-270的凝血酶的非变性聚丙烯酰胺凝胶 电泳(native-page)的结果。m：蛋白质阶梯分子量标记。
37.图16显示用于计算凝血酶和gns/alg-ngs-270的解离常数(dissociationconstant，kd)的图。
38.图17显示多酚gns/alg-ngs-270与天然(多)酚化合物(即槲皮素、儿茶素、 柚皮素、咖啡酸和阿魏酸)的凝血酶抑制活性的比较。
39.图18a和图18b分别显示透过dpph清除测定法和folin-ciocalteu测定法比 较海藻酸钠、alg-ngs和gns/alg-ngs的抗氧化活性。
40.图19显示以h2o2处理后的gns/alg-ngs-270的tct测定的结果。ctrl：控制 组。
41.图20显示在人血浆中不存在(对照)或存在gns/alg-ngs-270的情况下，所 显示凝血因子的相对活性。
42.图21a和图21b分别显示海藻酸钠(i)、gns/alg-ngs-270(ii)和岩藻聚 醣(iii)的抗凝血作用于凝血酶活化和高岭土活化的血栓弹力图 (kaolin-activated thromboelastography，teg)。
43.图22a至图22d分别显示透过活细胞/死细胞的细胞活力、亮视野(brightfield)和荧光图像以及溶血测定法显示gnsalg-ngs的生物兼容性。
44.图23a至图23d显示gns/alg-ngs在动物模型中的抗凝血作用，其中，图23a 显示大鼠尾巴出血时间；图23b显示离体失血；图23c显示aptt测定的结果；图 23d显示凝血酶原时间(pt)测定的结果。
45.图24显示在尾巴出血实验中静脉内(intravenous，iv)注射gns/alg-ngs 后14天内的雄性sprague-dawley大鼠的标准化体重。
46.图25a与图25b依序显示十种哺乳类活细胞的细胞活力直方图，且图25c显 示溶血测定法的结果，藉以了解gnsalg-ngs的生物兼容性(*p《0.05,***p《 0.001；n＝3)。
47.图26a分别为0小时、控制组、(a)海藻酸钠、(b-g)不同温度处理的alg-ngs 或gns/alg-ngs的抑制癌细胞迁移活性实验结果图。图26b为(a)海藻酸钠、(b-g) 不同温度处理的alg-ngs或gns/alg-ngs的细胞迁移率量化直方图(*p《0.05, ***p《0.001；n＝3)。
48.图27a分别为fbs 0％、控制组、(a)海藻酸钠、(b-g)不同温度处理的alg-ngs 或gns/alg-ngs的抑制癌细胞侵袭活性实验结果图。图27b为图27a的细胞数目 量化直方图(*p《0.05,***p《0.001；n＝3)。
49.图28a(a)分别为控制组、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml以及400μg/ml 的gns/alg-ngs-270的抑制癌细胞迁移活性实验结果图。图28a(b)分别为控制 组、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml以及400μg/ml的gns/alg-ngs-270的抑制 癌细胞侵袭活性实验结果图。图28b(a)为图28a(a)的细胞迁移率量化直方图 (*p《0.05,***p《0.001；n＝3)。图28b(b)为图28a(b)的细胞数目量化 直方图(*p《0.05,***p《0.001；n＝3)。
50.图29a为本发明实施例9的小鼠动物模型实验设计简图。图29b为动物实验 给药期间(控制组pbs、低剂量组50mg/kg gns/alg-ngs-270以及高剂量组100 mg/kg gns/alg-ngs-270)小鼠的肿瘤大小变化曲线图。图29c为动物实验在pbs、 50mg/kg以及100mg/kg的gns/alg-ngs-270组别中，小鼠牺牲后的肿瘤重量直 方图。图29d为动物实验给药期间(pbs、50mg/kg以及100mg/kg的 gns/alg-ngs-270)小鼠的体重变化曲线图。图29e为动物实验在pbs、50mg/kg 以及100mg/kg的gns/alg-ngs-270组别中，不同小鼠牺牲后的肺部照片，圈选 处为肿瘤。图29f及图29g分别为动物实验在pbs、50mg/kg以及100mg/kg的 gns/alg-ngs-270组别中，小鼠牺牲后的肺结节数目及小鼠癌化指数直方图(*p《 0.05,**p《0.01,***p《0.001；n＝6)。
具体实施方式
51.以下通过例示用于说明本发明的实施方式。熟习此技艺的人士可由本说明书所 揭示的公开内容轻易地了解本发明的优点及功效。本发明亦可通过其它不同的实 施方式加以实现或应用。本说明书中的各项细节亦可基于不同的观点和应用，在 不悖离本发明所揭示的范围下赋予不同的修饰与变更。
52.应注意的是，如本文中所使用，单数形式术语「一个」、「一种」及「所述」 除非明确地限于一个指示物，否则包括复数个指示物。除非上下文另外明确指出， 否则术语「或」与术语「和/或」可互换使用。
53.如本文中所使用，术语「包括」或「包含」是指包括在本发明中的组成、方法 及其相应的一个或多个组件，但对于包括未指定的组件是开放的。
54.本发明涉及用于抗凝血剂或抗氧化剂的酚多糖纳米胶。酚多糖纳米胶包括类石 墨烯纳米片和多糖，其中，所述类石墨烯纳米片包括所述多糖的至少一部分的碳 化产物，且所述类石墨烯纳米片与所述多糖经复合以形成交联的超分子结构。在 一些实施例中，用于制备纳米胶的多糖可为海藻酸的盐。
55.海藻酸盐由与β-(1
→
4)连接的d-甘露糖醛酸(m)和与α-(1
→
4)连接的 l-葡萄糖醛酸(g)单元组成。海藻酸钠因其高生物兼容性、低成本和添加二价阳 离子(例如mg
2
和ca
2
)可适度形成的凝胶能力而在食品工业、制药业和许多生物 医学应用(例如伤口敷料、药物递送和免疫疗法)中得到广泛应用。然而，海藻 酸盐具有线性构型的尿烷(聚脲醛酸)，没有硫酸盐和磺酸盐基团，其抗凝血活 性通常被忽略。因此，化学硫酸化是提高海藻酸盐抗凝血效率的常用方法 (carbohydr.polym.201；83:1797-1803；biomacromolecules 2014；15: 2744-2750)。然而，由于不稳定的生物活性和在硫酸化过程中对有机溶剂的需求， 因此改进受到限制。此外，化学修饰的多糖很复杂，硫酸化的多糖很容易降解 (molecules 2017；22:778)。
56.在本发明中，透过干式加热海藻酸盐制备酚多糖纳米胶，以获得碳化产物。自 下而上合成的碳量子点(carbon quantum dot，cqd)和碳化的聚合物点(carbonizedpolymer dot，cpd)导致在其热合成过程中形成具有各种官能基的芳族结构域。
57.因此，在至少一个实施例中，本发明的纳米胶中形成的交联的超分子结构在其 表面上具有至少一个官能基，例如羟基、酯、苯酚和羧基，从而可用于纳米胶的 生物应用。
58.在一些实施例中，本发明提供一种用于治疗易于透过抗凝血剂或抗氧化剂改善 的疾病或病症的药物组合物或用于预防或治疗肿瘤转移的药学组成物。所述药物 组合物包含上述纳米胶及其药学上可接受的载体。
59.如本文中所使用，术语「药学上可接受的载体」是指药学上可接受的材料、组 合物或载体，例如稀释剂、崩解剂、黏合剂、润滑剂、助流剂和表面活性剂，其 为不会消除活性成分的生物学活性或特性的物质(例如，本文中所使用的纳米胶)； 也就是说，可以将载体施用于受试者而不会引起不希望的生物学作用或以有害的 方式与其中所包含的医疗组合物的任何成分相互作用。
60.如本文中所使用，术语「治疗」是指获得期望的药理和/或生理作用(例如减 轻或消除病症、疾病或病状)、或一种或多种与病症、疾病或病状相关的症状、 或缓解或消除病症、疾病或病状本身的原因。就完全或部分预防疾病或其症状而 言，所述效果可以是预防
性的；或者对于完全或部分治愈、缓解、减轻、补救或 改善疾病或归因于所述疾病或其症状的不利影响，所述效果可以是治疗性的。
61.如本文中所使用，术语「预防」是指包括延迟和/或预防病症、疾病或病状和/ 或其伴随症状发作的方法；阻碍受试者患有病症(disorder)、疾病(disease) 或病状(condition)；或降低受试者患病症、疾病或病状的风险。
62.如本文中所使用，术语「受试者」是指哺乳动物，例如人，但是也可以是另一 种动物，例如家畜(例如，狗、猫等)、农场动物(例如，牛、绵羊、猪、马等) 或实验动物(例如猴子、囓齿动物、鼠科动物、兔子、豚鼠等)。术语「患者」 是指怀疑或患有某种疾病或病状的「受试者」。
63.如本文中所使用，术语「肿瘤」是指过度生长或生长速度超过正常组织的增生 组织，包含良性肿瘤与恶性肿瘤。良性肿瘤容易移除且较无转移的问题。「恶性 肿瘤」容易通过人体的淋巴组织、血液或体液蔓延扩散至其他器官，俗称的「癌 症」亦属于恶性肿瘤。恶性肿瘤包含但不限于膀胱癌、骨癌、血癌、乳癌、黑色 素瘤、甲状腺癌、副甲状腺癌、骨髓癌、直肠癌、咽喉癌、喉癌、肺癌、食道癌、 胰腺癌、胃癌、舌癌、皮肤癌、脑瘤、子宫癌、头颈癌、胆囊癌、口腔癌、结肠 癌、肛围癌、中枢神经系统肿瘤、肝癌、及结直肠癌等。
64.已透过许多实例说明本发明，以下实施例仅是例示性的，无意以任何方式限制 本发明的适用范围。
65.实施例
66.材料和方法
67.在以下实施例1-9中所使用的材料和方法详细描述如下。在本发明中使用但在 本文中未注释的材料为可商购的。
68.(1)类石墨烯纳米片嵌入的多酚海藻酸盐纳米胶(gns/alg-ngs)的定性
69.使用tecnai g2 f20 s-twin(philips/fei，hillsboro，og，美国)在200kv 下运行的穿透式电子显微镜(tem)系统分析gns/alg-ngs的粒径和形态。于环境 温度下，使所述gns/alg-ngs谨慎地沉积在300目碳涂层铜网格上。
70.透过动态光散射(dls，zetasizer nano zs90，malvern instruments，malvern， uk)测定未处理的海藻酸钠和gns/alg-ngs在5mm磷酸钠缓冲液(ph 7.4)中的 水合直径和zeta电位(ζ电位)。
71.使用单色微板分光亮度计(synergy 4multi-mode；biotek instruments， winooski，vt，usa)记录5mm磷酸钠缓冲液(ph 7.4)中gns/alg-ngs的光致 发光(photoluminescence，pl)光谱。透过与硫酸奎宁标准品(在0.1m h2so4 中qy＝54％)进行比较，以确定gns/alg-ngs的荧光量子产率(quantum yields， qys)。
72.透过将gns/alg-ngs溶液沉积到硅片上，接着在室温下干燥，以制备x射线衍 射(xrd)样品。xrd测量是在室温下使用x射线衍射仪(d/max 2200vpc，rigaku， sendagaya，shibuyaku，东京，日本)以cuk
α1
谱线(，能量＝8.8kev) 进行的。x射线光电子能谱(xps)使用escalab 250光谱仪(vg scientific，eastgrinstead，england，uk)，以alkαx射线辐射作为激发的x射线源进行。使 用vario el立方分析仪(elementar，hanau，germany)对c、h和o进行gns/alg-ng 的元素分析(elemental analysis，ea)。
73.结合能(binding energy)以284.6ev处的c1s峰为标准进行校正。使用傅立 叶变
换红外光谱仪(ft-ir，ft/ir-6100，jasco，easton，md，美国)在500cm-1
至4,000cm-1
的透射模式下进行16次扫描，以分析可能已存在于gns/alg-ng中 的官能基。
74.在傅立叶变换红外光谱(ft-ir)测量过程中，使用高纯度氮气进行吹扫，以 最大程度地降低水蒸气的干扰。使用tga仪器(q500，ta instruments，new castle， de，usa)和ta 2010仪器(ta instruments)分别在空气中(60ml/min)进行 热重分析(tga)及差示扫描量热分析(dsc)。
75.使用锥板(圆锥主轴：cpa-40z)黏度计(brookfield，model dv1mlv， middleboro，ma，usa)测量黏度。循环伏安法(cyclic voltammetry，cv)在pbs 溶液中透过使用由玻碳电极(glassy carbon electrode，gce)作为工作电极， 铂电极作为对电极，以及饱和甘汞电极(saturated calomel electrode，sce) 作为参比电极。使用恒电位仪/恒电流仪autolab pgstat204(metrohm autolab， utrecht，the netherlands)在-1.2v至1.2v的电压范围内进行循环伏安法。 使用avance 600mhz光谱仪(bruker，billerica，ma，usa)，并参考其溶剂信 号。
76.(2)琼脂凝胶阻滞
77.将海藻酸钠和所得的gns/alg-ngs样品(5mg/ml；15μl)分别与10％甘油 混合，然后透过凝胶电泳在1.0％琼脂凝胶和40mm tris-乙酸盐缓冲液/1mm乙 二胺四乙酸(tae缓冲液，ph 8.0)中于100v下持续30分钟进行电泳后，将凝 胶以带正电荷的亚甲基蓝(0.1mg/ml，150ml)染色，并在tae缓冲液(ph 8.0) 中脱色30分钟。
78.(3)凝血酶凝血时间(tct)测定
79.对于tct分析，根据中国台湾台北马偕纪念医院研究伦理委员会的规章制度， 人血浆来自健康人的捐赠。此外，将两倍稀释的人血浆与gns/alg-ngs或其他抑 制剂(最终浓度为500μg/ml)在475μl磷酸盐缓冲液(pbs)中于37℃培育5 分钟。然后，添加25μl的15nm凝血酶以启动凝血级联反应。透过使用fp-6500 分光亮度计(jasco，tokyo，japan)测量650nm处的散射光强度来监测凝血酶 活性和凝血块形成。
80.(4)大鼠尾部出血测定和凝血酶原时间以及活化的部分凝血活酶时间测定
81.为了评估gns/alg-ngs的实用性，在雄性sprague-dawley大鼠(200g至250 g)上进行体内尾巴切口出血模型测定。在中国台湾台北实验动物中心的实验动物 照护及使用委员会的许可下进行动物实验(批准号：105021)。麻醉健康大鼠， 然后静脉内注射依诺肝素和gns/alg-ngs-270的pbs溶液，剂量为5
×
10-1
mg/kg， 然后等待5分钟。之后将尾尖切开(4mm)，并浸入生理缓冲液中。将流血停止 的时间记为出血时间。使用学生t检验进行统计分析。大鼠存活的可能性透过 kaplan-meier方法计算。
82.为了在人体血浆样品中进行凝血酶原时间(pt)测定，将海藻酸钠或 gns/alg-ngs(0.5mg/ml，100μl)分别与200μl人血浆在37℃培育3分钟，然 后添加200μl的pt试剂以启动外在凝血级联反应。透过测量散射光的强度来监 测凝结，直到信号达到饱和为止。为了测定活化的部分凝血活酶时间(aptt)， 将160μl人血浆与240μl(0.5mg/ml)的每种抑制剂(海藻酸钠或gns/alg-ngs) 在37℃培育5分钟。然后，加入100μl的aptt试剂，然后培育3分钟。为了启 动固有的凝血级联反应，添加100μl预热的cacl2溶液。aptt被认为是散射光强 度达到平稳状态的时间。为了计算pt和aptt，选择结束时间作为散射光信号强度 介于最低值和最大值之间的点。
物敏感，而且对许多还原剂也很敏感。因此，所述测定法可用于测量样品的总还 原能力。
96.(9)血栓弹力图
97.血栓弹力图(teg；血栓弹力图分析仪，haemoscope corporation，niles，il， usa)被用于评估海藻酸钠、gns/alg-ngs-270及常见具有显着抗凝血活性的硫酸 多糖岩藻多糖(fucoidan)的抗凝血效果。全血凝块透过凝血酶介导的纤维蛋白聚 合和血小板活化的黏弹性形成。
98.从一名健康志愿者(24岁)收集血液样本装到有柠檬酸钠(3.2％)的试管中。 马偕纪念医院的采血是根据相关法规进行的。实验前，将普通的一次性塑料teg 杯(haemonetics)在37℃下平衡。在凝血酶激活的teg分析中，将生理缓冲液中 的海藻酸钠、gns/alg-ngs-270、岩藻聚醣或其他市售药物(0.1mg/ml至0.5mg/ml， 52μl)与288μl全血混合，并在37℃的teg杯中培育10分钟。然后，将凝血酶 溶液(15nm，20μl)添加到teg杯中以引发全血凝集，然后监测30分钟。同样 地，将相同浓度的样品与相同量的全血(288μl)和高岭土(kaolin)溶液(14μl) 混合，然后在高岭土活化teg分析中，于37℃的teg杯中培育10分钟。然后，将 氯化钙溶液(cacl2，14μl)添加到teg杯中，以引发全血凝集，然后监测30分 钟。以血栓弹力图分析仪测量37℃下的血凝块形成，直到形成稳定的血凝块或已 经过了一个小时。将运动度设置为围绕固定塑料销钉的4.75
°
，以测量凝块反应 时间(r)(分钟)、凝块动力学(k，从凝块形成到振幅达到20mm的时间)(分 钟)、α角(α，从r值到k值的斜率形成，代表纤维蛋白积聚和交联的加速度) (度)和最大振幅(ma，在teg描迹最宽处测得的振幅)。滞后时间、α角和最 大振幅由teg analytical软件(tas)4.2.3版(haemonetics)自动计算。
99.(10)体外细胞毒性测定
100.为确定gns/alg-ngs的体外细胞毒性，使用huvec(human umbilical veinendothelial cell line，人脐静脉内皮细胞株)、hek-293t(human embryonickidney 293cell line，人胚肾293细胞株)、rd(human rhabdomyosarcoma cellline，人横纹肌肉瘤细胞株)、hepg2(human liver cancer cell line，人肝癌 细胞株)和a549(human lung adenocarcinoma epithelial cell line，人肺腺 癌上皮细胞株)的细胞。所有细胞系均获自美国典型培养物保存中心(atcc， manassas，va，usa)。另外还有4t1(4t1 murine mammary cancer cell line， 小鼠乳腺癌细胞株)、tramp-c1(transgenic adenocarcinoma of the mouseprostate c1 cell line，小鼠前列腺癌细胞株)、mdck(madin-darby canine kidneycells，狗肾小管上皮细胞株)、mcf10a(人类乳腺上皮细胞株)、hacat(人类角 质形成细胞株)。
101.huvec和a549细胞株分别在m199和f-12k培养基中培养，hacat、hek-293t、 mcf10a、rd、hepg2和tramp-c1细胞株在dmem培养基中培养。，4t1在rpmi-1640 培养基中培养。在37℃下，于5％co2中向培养基中添加胎牛血清(fbs，10％)、 抗生素-抗真菌药(penicillin-streptomycin 1％)、l-麸酰胺酸(2.0mm)和 非必需胺基酸(non-essential amino acid，neaa，1％)。透过台盼蓝(trypanblue)排除测定法(gibco，thermo fisher scientific，waltham，ma，usa)确 定细胞数，并使用prestoblue测定法确定细胞活力。简而言之，将所有细胞系中 每孔约1.0
×
104个细胞与相应的培养基分别在96孔板中于37℃及含5％co2的培 养基中培育12小时。然后，将每个孔中的培养基替换为100μl含有gns/alg-ngs (0.1mg/ml至1.0mg/ml)的培养基，然后培育72小时。将细胞以pbs仔细清 洗三次，并使
用prestoblue试剂(十倍稀释，每孔100μl)处理4小时。然后，在540/590nm的激发/发射波长下测量荧光强度(if590)(synergy4multi-mode；biotekinstruments)。因为荧光强度与细胞数量直接相关，所以对照组(不含gns/alg-ngs的培养基)中的细胞活力假定为100％。
102.活/死存活力/细胞毒性试剂盒(invitrogen)还用于检查活细胞和死细胞。将hek-293t细胞保持在溶于dmem培养基中的细胞培养室中，所述培养室在含有95％空气和5％co2的37℃湿润气氛下。将hek-293t细胞株在24孔板中培养72小时(约1.0
×
105细胞/孔)。随后，将培养液替换为含有gns/alg-ngs(0.1mg/ml至1.0mg/ml)的培养液，并培养72小时。以pbs洗涤3次后，将hek-293t细胞培养物以由pbs(1ml)、乙二胺均二聚体-1(ethd-1；2μl)和钙黄绿素乙酰氧基甲基(钙黄绿素-am；0.5μl)并在荧光显微镜下观察(axiovert200m，carlzeiss，oberkochen，germany)。
103.(11)溶血分析
104.用于溶血测定的人红血球细胞(rbc)由中国台湾台北马偕纪念医院捐赠。从一名健康志愿者(25岁男性)收集到的血液样本装到有乙二胺四乙酸(edta)的试管中，并立即(收集后30分钟内)离心(相对离心力(rcf)3,000g，10分钟，4℃)去除血清。使用无菌等渗生理缓冲液稀释红血球细胞以获得红血球细胞储备悬浮液(约4.0体积％血细胞)。为了进行分析，将100μl的红血球细胞储备悬浮液与等份的gns/alg-ngs分散液(0.1mg/ml至1.0mg/ml)在1.5ml微量离心管中于37℃培育1小时。然后，将等分试样在rcf是1,000g的条件下离心10分钟。根据上清液(200μl)在576nm(od
576
)处血红蛋白的吸收来测量溶血率。对于0％溶血参考(od
576空白
)，使用无菌等渗生理缓冲液。透过向红血球细胞悬浮液中添加超纯水(od
576超纯水
)来制备表达100％溶血的阳性对照。溶血活性计算如下：
105.溶血(％)＝[(od
576gns/alg-ngs
–
od
576空白
)/(od
576超纯水
–
od
576空白
)]
×
100％。
[0106]
(12)伤口愈合试验(woundhealingassay)
[0107]
将4t1乳腺癌细胞在37℃以密度1.2
×
104/孔培育在24孔中的2孔插件培养室(ibidi，德国)中，细胞贴附后用灭菌钳将插件取下，中间会露出一块间隙(gap)，在0小时以显微镜拍照后，分别改注入500μl不含样本的rpmi培养液(10％fbs)(控制组)、含不同样本(海藻酸盐、alg-ngs或gns/alg-ngs)的rpmi培养液培养12小时并照相，以imagej分析软件分析间隙中尚未被癌细胞占据的无细胞区域(cell-freearea)。迁移率(migrationrate)％＝[(无细胞区域
0小时-无细胞区域
12小时
)/无细胞区域
0小时
]
×
100％。
[0108]
(13)癌细胞侵袭试验(invasionassay)
[0109]
使用具有8μm孔隙的聚碳酸酯薄膜插件的24孔细胞培养盘中(boydentranswellchamber)(bdfalcon，美国麻州)，薄膜上表面加入100μl的灭活生长因子的matrigel(200μg/ml，corning，美国)放置两小时，将700μl培养液(含10％fbs)加入24孔细胞培养盘，并将薄膜插件置入24孔细胞培养盘。之后，在上腔室的培养液(含2％fbs)中加入105cfu的4t1细胞，并在下腔室使用10％fbs培养液用做趋化因子，同时将不同样本(海藻酸盐、alg-ngs或gns/alg-ngs)分别加入上腔室并培养24小时。接着，将薄膜上表面的细胞用棉棒拭去。到达薄膜底部的侵袭细胞用核酸赫斯特荧光染剂(hoechst33342)染色20分钟，在荧光显微镜(olympusix-71，美国)暗视野下观察并计数，将三次独立实验结果以司徒顿t检定和anova进行统计分析(p《0.05)。
150的水合直径(410.2nm)仅比未处理的海藻酸钠(474.6nm) 的水合直径小，表示当在150℃加热时没有发生明显的热解。与gns/alg-ngs-270 相比，由于过度交联和碳化，gns/alg-ngs-300表现出更大的水合尺寸(198.2nm)。
[0123]
表1、海藻酸钠未经处理和干式加热制得的分散液的产率和特性
[0124][0125]a与硫酸奎宁相比(qy：在0.1m h2so4中为54％)。
[0126]b透过元素分析确定。
[0127]
接下来，如上表1所示，未处理的海藻酸钠的ζ电位为约-86mv，这是因为其 在单体单元的c-6位置上有带负电荷的羧基。相比之下，由于脱水导致羟基和羧 基的缩合和碳化的结果，alg-ngs和gns/alg-ngs显示出约-46mv至约-30mv的 ζ电位值。
[0128]
透过琼脂凝胶电泳测定进一步确认了alg-ngs和gns/alg-ngs的尺寸分布，并 将结果显示于图3。如上所述，可观察到alg-ngs和gns/alg-ngs的尺寸分布与其 水合直径和ζ电位值一致。
[0129]
(3)穿透式电子显微镜(tem)图像
[0130]
透过图4a所示的tem图像，可以得到alg-ngs-150和alg-ngs-180含有透过 缩合反应形成的凝胶状的交联聚合物。相比之下，在210℃至300℃加热的 gns/alg-ngs表现出与聚合物基质一起形成的独特颗粒。应注意的是， gns/alg-ngs-270的tem图像显示了平均直径为48.7
±
6.5nm(100个计数)的粒 径。相反地，由于海藻酸钠的碳化程度较高，因此在gns/alg-ngs-300中观察到 相对较低的溶解度(《0.1mg/ml)和较大的碳颗粒。
[0131]
图4b中所示的高解析tem(hrtem)成像，进一步证实了碳化产物中的d-间距 值为0.21nm和0.24nm，此分别归因于石墨烯-平面间距的(100)和(112)晶 格平面，并揭示了除
了交联的纳米凝胶基质外，还形成了类似结晶石墨烯的结构。 然而，alg-ngs-150和alg-ngs-180在hrtem图像中未显示晶格平面，因此表明在 低温加热期间未形成结晶碳核。
[0132]
(4)紫外光-可见光吸收光谱
[0133]
参考图5a所示，除alg-ngs-150外，所有alg-ngs和gns/alg-ngs的紫外光
‑ꢀ
可见光吸收光谱显示在280nm处的吸收带。所述谱带对应于共轭c＝c键(sp2簇) 的π
→
π
*
跃迁，表示海藻酸钠碳化过程中石墨碳的形成。对于alg-ngs-180和所有 gns/alg-ngs，在320nm至360nm处观察到侧峰带，归因于c＝o键结的n
→
π
*
边 缘跃迁和/或夹层π
→
π
*
电荷转移，支持alg-ngs-180和gns/alg-ngs上含氧官能 基的存在。进一步观察到，海藻酸钠在240℃至300℃经历了较高的碳化程度，导 致形成较大的石墨碳网络，从而导致c＝c键的强π
→
π
*
跃迁。
[0134]
接着，检查荧光光谱。在以365nm的波长激发时，gns/alg-ngs显示出以约 450nm为中心的宽荧光带(图5b)。150℃至210℃制备的alg-ngs和gns/alg-ngs 的强荧光可能是由于嵌入纳米胶的交联聚合物基体中的类石墨烯纳米片的形成 (如表1和图5b所示)。在》210℃下制备的gns/alg-ngs的荧光强度较低，主 要是由于碳化程度较高，这可以从合成温度升高时gns/alg-ngs的氧含量降低中 看出(表1)。
[0135]
(5)x射线衍射(xrd)光谱
[0136]
如图6所示，海藻酸钠、alg-ngs及gns/alg-ngs的x射线衍射图谱显示，加 热后海藻酸钠的结晶聚葡萄醣醛酸钠(g形式)单元的排列发生了显着变化。尽管 大多数g形式的特征都保留在alg-ngs-150中，但在较高温度(》210℃)下出现 了0.33nm的平面间距(002)，对应于类石墨烯碳结构的晶格面，以及特征的g 形式峰消失，代表海藻酸钠的部分碳化。
[0137]
透过未处理的海藻酸钠的x射线光电子能谱(xps)获得的c1s光谱的反折绩 (deconvolution)揭示三种类型的碳键，如图7a所示，c-c(284.5ev；34.7％)、 c-o(285.5ev；45.2％)和c＝o(286.7ev；20.1％)。对于alg-ngs-150和 alg-ngs-180，由于缩合反应，c＝o键的百分比降低至约5％至10％，并且酯o-c＝o (288.5ev)键出现。此外，随着合成温度从210℃至300℃，alg-ngs和gns/alg-ngs 中的c＝c(284.0ev，约0.1％至约29.3％)和o-c＝o(约0.8％至约10.7％)键 显示增加的趋势(图7a)，表示在海藻酸盐纳米胶结构中酯键和sp2碳的形成。 透过海藻酸盐的羟基和羧酸基团之间的缩合过程形成酯键。同样地，alg-ngs和 gns/alg-ngs的o1s xps光谱的反折绩显示在531.2ev、532.2ev和532.8ev 处的三个峰，揭示了三种类型的氧键：分别为o＝c、o-h和o-c(图7b)。这些结 果表示，alg-ngs和gns/alg-ngs在它们的表面上具有大量的亲水基团，例如羧基 和羟基部分，这增强了它们的水溶性。
[0138]
(6)傅立叶变换红外光谱(ft-ir)
[0139]
如图8所示，ft-ir光谱在1290和1320cm-1处显示峰，其分别对应于海藻 酸钠的d-甘露醣醛酸(m)和l-葡萄醣醛酸(g)部分。alg-ngs-150和alg-ngs-180 的ft-ir光谱揭示，由于低温下的低碳化，其化学结构与海藻酸钠的化学结构相 似。将合成温度从210℃升高到300℃时，c-o伸展峰在1025/1083cm-1
处明显降 低，并且从240℃开始，在840cm-1
处出现c＝c弯曲峰，从而表示高温下发生碳化 反应。此外，gns/alg-ngs-270的光谱在1330cm-1
处有一个峰，这归因于碳化过 程中由于轻度芳构化而形成的酚基的o-h弯曲。因此，这些结果表示海藻酸钠经 轻度碳化，从而保留了一些官能基并形成新的官能基。
[0140]
(7)gns/alg-ngs结构形成的时程
[0141]
在270℃下加热的海藻酸钠的时程tem图像显示，在加热10分钟内形成胶状 结构(图9)。海藻酸盐的羟基和羧基的缩合导致交联，以形成具有微米尺寸的类 超分子大结构。然后，在碳化的初始阶段，透过热解将形成的超分子结构破碎成 较小的颗粒。进一步碳化导致在加热30分钟至1小时后形成无定形碳簇，然后部 分碳化的海藻酸盐聚合物链或其片段分子构成了ngs，如图10所示。相反地，由 于碳化程度较高，海藻酸钠加热4小时后会形成大量碳残留物，这导致较差的水 分散性。因此，为了保留海藻酸钠的官能基并为生物应用获得最大的水分散性， 较佳的加热时间为3小时。
[0142]
经发现，在加热过程中，海藻酸钠透过三个步骤脱水并分解为二氧化碳：失水、 形成碳质残留物、接着再形成na2co3。在预热分析仪中于恒定温度(150℃至300 ℃)下进行3小时的时程重量损失的热重分析(tga)与所述发现一致(图11a)。 由于水分子的损失，在150℃和180℃加热导致重量损失不到20％。尽管海藻酸 钠的熔点要高得多(》300℃)，但在210℃、240℃、270℃和300℃下的重量损 失约为55％，并呈现增加的趋势，此表示随着温度的升高，脱水和热分解的程度 更高。温度依赖的tga表示海藻酸钠从210℃开始分解(图11b)。在一般大气下， 海藻酸钠的脱水在约60℃至约210℃下发生，并在约210℃至约230℃下分解。海 藻酸钠的差示扫描量热法(dsc)曲线在70℃至125℃下显示宽的吸热带(图11c)， 此归因于失水和透过缩合反应形成的交联聚合物。240℃的放热峰可能是分解初期 的结果，随后是碳原子的轻微氧化以及碳化过程导致嵌入的碳纳米片的形成。一 些类聚合物的海藻酸盐和/或其片段聚合物保留在形成的gns/alg-ngs的表面上， 从而赋予其特定的功能特性和生物活性。
[0143]
实施例3：酚多糖的形成
[0144]
可观察到gns/alg-ngs-270在1330cm-1
处显示明显的ft-ir峰(图8)，其归 属于苯酚基团，具有有效的抗氧化和抗凝血活性。为了进一步表征gns/alg-ngs 中多酚官能基团的存在，使用了2,2-二苯基-1-吡啶并肼基(dpph)测定、 folin-ciocalteu测定、循环伏安法(cv)和核磁共振(nmr)进行光谱分析。dpph 分析显示gns/alg-ngs-270(100μg/ml)具有优异的自由基清除能力，比游离海 藻酸钠的清除能力高约35倍，如图12所示，并支持多酚结构的存在。此外，类 石墨烯的纳米片结构促进gns/alg-ngs-270表面的快速电子转移，并促进氧化还 原反应。
[0145]
接下来，透过folin-ciocalteu试剂(磷钼酸盐和磷钨酸盐的混合物)对 gns/alg-ngs-270中的苯酚总量进行定量，以评估其抗氧化活性。测定的 gns/alg-ngs-270(100μg/ml)还原能力相当于6.1μg/ml槲皮素(n＝5)， 表示形成了酚多糖。相反地，海藻酸钠(100μg/ml)在folin-ciocalteu分析 中显示出微不足道的还原能力。在玻璃碳电极(gce)表面的磷酸盐缓冲盐水(pbs) 中，gns/alg-ngs-270的循环伏安法进一步显示0.8v的氧化峰，这与有关酚基氧 化的报导一致。
[0146]
然后使用高解析的1h-nmr光谱确认复杂样品中的酚基，例如多酚分子的复杂 混合物。氘代水(d2o)中的gns/alg-ngs-270在1.0ppm至3.0ppm处显示出sp3 c h质子。在8.4ppm处还有一个清晰的谱带，在6.5ppm到9.0ppm处有一个 多峰的宽带，表示在gns/alg-ngs-270上的酚基团参与了在298k下分子间/分子 内
–
oh和
–
oh和
–
cooh基团之间的质子交换(图13a至图13c)。gns/alg-ngs-270 的ft-ir光谱和1h nmr光谱显示，海藻酸钠(多糖)的干式加热过程中形成酚基。
[0147]
实施例4：gns/alg-ngs的抗凝血和抗氧化活性
[0148]
海藻酸钠、alg-ngs和gns/alg-ngs的抗凝血活性透过凝血酶凝血时间(tct) 分析进行测试。如图14a和图14b所示，海藻酸钠显示的抗凝血活性可忽略不计， 而gns/alg-ngs-270显示活性最强。alg-ngs-150、alg-ngs-180、gns/alg-ngs-210、 gns/alg-ngs-240、gns/alg-ngs-270和gns/alg-ngs-300的tct延迟时间((t
‑ꢀ
t0)/t0，其中t0和t分别是不存在抑制剂和存在抑制剂的时间)比海藻酸钠分别长 约8.7、约8.0、约37.7、约208.7、约526.2和约152.7倍。
[0149]
进一步进行凝血酶原时间(pt)和活化的部分凝血活酶时间(aptt)测定，以 评估alg-ngs和gns/alg-ngs在人血浆样品中的抗凝血功效(图14c和图14d)。 pt测定法用于评估外部凝血途径的抗凝剂以及常见途径中凝血酶原、凝血因子v、 vii和x的抑制。aptt测定法用于评估纤维蛋白原和凝血因子viii、ix、xi、xii、 ii、v和x的活性。在被测材料中，alg-ngs-150、alg-ngs-180、gns/alg-ngs-210、 gns/alg-ngs-240、gns/alg-ngs-270和gns/alg-ngs-300的pt/aptt值延长((t
‑ꢀ
t0)/t0,其中t0和t分别是存在或不存在抑制剂时的pt或aptt)分别比未处理的 海藻酸钠高约1.0/7.1、约2.0/11.4、约23.0/41.1、约355.0/147.7、约 777.0/163.6和约200.0/118.9倍。因此，pt和aptt结果显示gns/alg-ngs-270 具有优异的抗凝血特性，因为它们与凝血酶以外的几种凝血因子相互作用。
[0150]
此外，透过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)验证了gns/alg-ngs-270与凝 血酶之间的相互作用，结果显示于图15。可发现在存在gns/alg-ngs-270的情况 下，由于其强结合，凝血酶带显着移动。实际上，在受控制的碳化过程中，在 gns/alg-ngs-270上形成的带负电荷的酚/酚酸和酯基团介导其与凝血酶的强协同 作用(解离常数(kd)＝2.1
×
10-10
m)(图16)，因此，抑制活性非常高。相比 之下，普通抗凝剂肝素的凝血酶kd为1.0
×
10-7
m；比gns/alg-ngs-270对凝血酶 的亲和力低约200倍。
[0151]
为了证实其他多糖的抗凝血活性，透过tct分析法测试在270℃干式加热后的 纤维素、琼脂、右旋糖酐和例如κ-卡拉胶、海带中的岩藻聚醣和硫酸软骨素钠盐 等硫酸化多糖。然而，在1.0mg/ml的浓度下，这些多糖都没有显示出显着的抗 凝血活性(数据未显示)。另外，透过tct分析进一步比较多酚类gns/alg-ngs-270 相对于天然(多)酚类化合物(例如槲皮素、儿茶素、柚皮素、咖啡酸和阿魏酸) 的凝血酶抑制活性。如图17所示，与浓度为0.5mg/ml的被测苯酚和酚酸化合物 相比，gns/alg-ngs-270的tct延迟大约长13倍。
[0152]
由上可知，gns/alg-ngs-270与其他ngs相比，对凝血酶表现出更强的抑制活 性，此现象可归因于其较高的酚或酚酸基团含量。另外，dpph和folin-ciocalteu 分析的结果显示，gns/alg-ngs-240和gns/alg-ngs-270比其他ngs具有更强的抗 氧化能力，呼应在270℃的加热海藻酸钠期间形成更多的多酚和酚酸结构(图18a 和图18b)。ngs上的多酚和多羧酸基团促进与凝血酶的多价类酚酸相互作用，从 而介导了它们的强抑制能力。
[0153]
为了进一步确认对凝血酶的主要抗凝血活性是否由酚基驱动，使用过氧化氢 (h2o2)作为氧化剂消除gns/alg-ngs-270的酚基。发现h2o2处理显着降低了 gns/alg-ngs-270的抗凝血活性(图19)。与此一致，h2o2处理的gns/alg-ngs-270 的dpph清除活性下降至20％(数据未显示)，支持h2o2处理可氧化酚基。此外， 对于由海藻酸钠在150℃至300℃下透过水热合成3小时制得的产品，这是制备衍 生自多种前体的功能性碳纳米材料的常用方法，在1.0mg/ml的浓度下均未显示 出明显的抗凝血特性(数据未显示)。因此，由此可见，干
式加热碳化海藻酸钠 以形成特定的类多酚结构，其涉及抗凝血特性。
[0154]
另外，为了进一步了解哪些凝血因子参与了gns/alg-ngs-270的抗凝血作用， 对因子ii、v、vii、x、xi和xii的抑制活性进行研究。发现因子ii、v、xi和 xii在2.0mg/ml的浓度下受gns/alg-ngs-270所抑制(图20)。被凝血因子xa 激活的凝血因子ii在凝血过程中经历了蛋白水解裂解，并形成凝血酶，此可解释 为什么gns/alg-ngs-270对凝血因子ii表现出类似的抑制作用。因子v和vii与 pt途径有关，而因子xi和xii与aptt途径有关。总体而言，这些结果显示， gns/alg-ngs-270透过不同的途径抑制凝血酶和其他凝血因子，从而有助于抑制不 同的凝血途径。
[0155]
gns/alg-ngs-270在人全血中的抗凝血活性透过血栓弹力图(teg)进一步确 定。在使用gns/alg-ngs-270、海藻酸钠、岩藻聚醣和其他知名的商业抗凝血剂处 理后，记录全血样品的teg，并使用凝血酶或高岭土作为活化剂。
[0156]
透过监测血凝块形成来确定抗凝血效率。teg可以确定各种参数，包括初始血 块形成的滞后时间(r时间)、从血块形成开始到强度振幅为20mm的经过时间(k 时间)、血块形成速率(α角)、以及血块的机械强度(ma)的最大振幅。
[0157]
海藻酸钠、gns/alg-ngs-270和岩藻聚醣对凝血酶活化的teg的剂量依赖性 (0.10至0.50mg/ml)反应如图21a所示。gns/alg-ngs-270导致最大的r时间， 此意味着最长的血凝块形成时间。在gns/alg-ngs-270的存在下形成的凝块小于 20mm，因此不能确定k值。相较于海藻酸钠和岩藻聚醣，gns/alg-ngs-270还产 生最小的α角和ma值，表示最低的血凝块形成速率和血凝块强度。此外，还记录 了对高岭土活化的teg的剂量依赖性抗凝血作用(图21b)。与海藻酸钠和岩藻聚 醣相比，观察到gns/alg-ngs-270具有最大的r时间和k值(图21b)。此外，α 角和ma值显示出与凝血酶激活结果相似的趋势。
[0158]
实施例5：gns/alg-ngs的细胞毒性和生物兼容性
[0159]
如上述tct、aptt、pt、teg、dpph和folin-ciocalteu分析所证实， gns/alg-ngs-270显示出良好的抗凝血和抗氧化活性。在所述实施例中，进一步确 定了细胞毒性和生物兼容性。
[0160]
在体外评估gns/alg-ngs-270对五种哺乳动物细胞株和红血球细胞(rbc)的 细胞毒性和溶血作用。具体而言，透过prestoblue细胞生存力分析评估 gns/alg-ngs-270对不同哺乳动物细胞的细胞毒性。将huvec(人脐静脉内皮细胞 株)、hek-293t(人胚肾293细胞株)、rd(人横纹肌肉瘤细胞株)、hepg2(人 肝癌细胞株)或a549(人肺腺癌上皮细胞株)等细胞与gns/alg-ngs-270(0.1mg/ml 至1.0mg/ml)一起培育72小时。图22a的结果显示所有细胞的细胞活力均高于 90％，表示gns/alg-ngs-270对哺乳动物细胞的细胞毒性可忽略不计。活/死细胞 存活力染色(calcein-am/ethd-1)分析进一步证明gns/alg-ngs-270的低细胞毒 性，证实是绿色荧光细胞在群中占主导地位(图22b和图22c)。此外，体外溶血 测定结果(图22d)显示在与gns/alg-ngs-270(0.1mg/ml至1.0mg/ml)培育 后，在rbc中没有明显的溶血，表明gns/alg-ngs-270为安全的可注射抗凝血剂。
[0161]
实施例6：gns/alg-ngs在尾巴出血分析的动物模型中的作用
[0162]
在此实施例中，透过在0.50mg/kg的投予剂量下测量尾部出血时间，在大鼠 体内评估gns/alg-ngs-270的抗止血作用。在相同条件下，使用pbs(作为对照组) 和依诺肝素处理的大鼠的出血时间分别为422
±
27秒(s)和1392
±
164s(n＝20)， 而在gns/alg-ngs-270
ngs-270(0.1mg/ml至2.0mg/ml)培育后，在rbc中没有明显的溶血， 表明gns/alg-ngs-270为安全的抗肿瘤转移药剂。
[0169]
实施例8：gns/alg-ngs的抑制癌细胞转移活性
[0170]
如图26a所示，先利用伤口愈合试验来评估癌细胞迁移能力，在开始实验时(0 小时)，中间黑色间隙为无细胞区域。经过12小时培养后，在rpmi培养液控制组， 癌细胞爬满间隙。然而，使用gns/alg-ngs-240、gns/alg-ngs-270及 gns/alg-ngs-300培养的组别，仍留下明显的间隙。如图26b所示，gns/alg-ngs-240、gns/alg-ngs-270及gns/alg-ngs-300三组的癌细胞迁移率分 别为37％、26％、33％，有显着的下降，代表能抑制癌细胞爬行能力，有非常好的抑 制癌细胞转移活性。特别是gns/alg-ngs-270有绝佳的抑制癌细胞迁移率，推测 与其在抗氧化能力上的优异表现有相关。
[0171]
接着，利用癌细胞侵袭试验来评估癌症转移能力。在含有一层matrigel的上 腔室中的4t1细胞，因下腔室的高浓度fbs而具有分解matrigel的能力，使4t1 细胞侵袭到下腔室，下腔室的细胞可以用赫斯特染剂染色并用荧光显微镜观察。 如图27a所示，当下腔室培养液含0％fbs(负控制组)时，4t1细胞不会有能力往薄 膜下方侵袭。当下腔室培养液含10％fbs((正)控制组)时，4t1细胞会往下侵袭， 并因染色被荧光显微镜观察到。
[0172]
另外，可以同时参考图27b，上腔室分别加入海藻酸盐、alg-ngs-150、 alg-ngs-180、gns/alg-ngs-210、gns/alg-ngs-240、gns/alg-ngs-270或 gns/alg-ngs-300的组别，可以在下腔室的侵袭细胞染色发现，gns/alg-ngs-240、 gns/alg-ngs-270或gns/alg-ngs-300分别仅有35％、8％及22％的细胞侵袭至下腔 室，因此没有观察到明显的蓝荧光。相较于控制组的侵袭细胞数有显着的减少， 代表有抑制细胞侵袭的能力，特别是gns/alg-ngs-270有较高的抑制细胞侵袭活 性。
[0173]
另外，图28a(a)及图28b(a)可以了解抑制细胞迁移活性的剂量倚赖性，测 试gns/alg-ngs-270在含浓度10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、400μg/ml的培 养液培养12小时后，可以观察到浓度越高的gns/alg-ngs-270抑制了癌细胞的爬 行，留下明显的间隙，也使癌细胞迁移率显着低于其他组别。图28a(b)及图28b (b)同样可以观察到gns/alg-ngs-270在含浓度10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、 400μg/ml的培养液培养12小时后，浓度越高的gns/alg-ngs-270抑制了癌细胞侵 袭，越无法观察到明显的蓝荧光，侵袭细胞数也有显着下降。
[0174]
实施例9：gns/alg-ngs的抗肿瘤动物实验
[0175]
依照图29a的方法测试gns/alg-ngs-270的抗肿瘤活性。如图29b所示，高剂 量组别相较于控制组，肿瘤体积成长约有0.23倍的减少，显示肿瘤成长显着受到 抑制。如图29c所示，牺牲后的肿瘤重量也呼应了越高剂量的gns/alg-ngs-270 可以越明显抑制肿瘤的成长。如图29d所示，小鼠的重量没有太多变动，显示药 物是有极高的生物兼容性。图29e为牺牲小鼠的照片示意图，由于乳癌细胞最容 易转移到肺脏，因此将肺脏表面可见的结节都圈选起来，计算数目并量测大小， 接着用表a的参数计算小鼠癌化指数。如图29f及图29g所示，施打越高剂量的 gns/alg-ngs-270的小鼠相比于仅施打pbs的小鼠，明显降低了肺脏结节数目及小 鼠癌化指数，动物实验证明gns/alg-ngs-270有效抑制肿瘤细胞转移。
[0176]
对于透过简单的合成方法制备的纳米药物存在未满足的需求。本技术公开的 gns/alg-ngs透过一步合成、具成本效益的材料、易于放大和高再现性满足了所述 需求。此外，特别是与最近报导的基于金属的抗凝血剂纳米材料相比，gns/alg-ngs 不含金属且为
基于碳，故具有高度的生物兼容性。几项研究还揭示cvds的成功治 疗与抗氧化剂和抗凝血疗法之间的密切关系。由于本技术公开的gns/alg-ngs显 示出良好的抗凝血活性、低细胞毒性、高生物兼容性和潜在的抗氧化活性，因此 gns/alg-ngs可以被开发为用于预防cvds的抗凝血剂或饮食补充剂。从上述实施 例可以得知多糖碳纳米胶具有类石墨烯结构，其上的多酚官能基有良好的抗氧化 能力，也证明具有优异的抗癌/抗肿瘤转移活性，能抑制癌细胞爬行与抑制癌细胞 侵袭，且有剂量倚赖性。与常见带有多酚官能基的材料相比，本发明的多糖碳纳 米胶具有更佳的水溶性、生物兼容性、稳定性与产率，能作为理想的抗癌/抗肿瘤 移转的药学成分。
[0177]
本发明内容包括实施例，其中恰好该些实施例之一存在于、用于给定的产品或 过程中或与给定的产品或过程有关。本发明另包括其中一个或多个存在于给定产 品或过程中、在其中采用或与给定产品或过程相关的实施例。
[0178]
透过使用常规实验，所属技术领域中具有通知识者将意识到或判断本技术所述 的本发明的实施方式的许多等同形式。本发明的范围不旨在限于所公开的实施例， 而是包括落入所附申请专利范围内的所有实施例。另外，须理解的是，在未脱离 本发明的范围的情况下，可针对用于本发明的特定的仪器、情况或材料进行修改。