预测肺癌免疫检查点抑制剂疗效的标志物及其应用

1.本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及预测肺癌免疫检查点抑制剂疗效的标志物及其应用，更具体地，涉及预测基因集在作为预测对象肺癌免疫检查点抑制剂治疗疗效中的用途、计算机可读存储介质、用于预测对象肺癌免疫检查点抑制剂疗效的电子设备、一种预测对象肺癌免疫检查点抑制剂疗效的方法、一种预测对象肺癌免疫检查点抑制剂疗效的系统、一种用于预测对象肺癌免疫检查点抑制剂疗效的试剂盒。


背景技术：

2.临床试验和研究表明程序性死亡受体1(pd-1)/程序性死亡配体1(pd-l1)抑制剂显著提高了晚期非小细胞肺癌(nsclc)患者的生存率。最近，新辅助免疫检查点抑制剂(ici)治疗的临床试验已经建立，为该方法在可切除肺癌中的应用提供了更加深入的见解。纳武利尤单抗(nivolumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)或信迪利单抗(sintilimab)单药或联合其他药物治疗的主要病理缓解率(mpr) 可达到18％-83％。
3.尽管新辅助免疫治疗临床试验的结果令人鼓舞，但并非所有患者都有良好的反应，如mpr或病理完全缓解(pcr)。一个有效的预测性生物标志物将显著改善临床结局，提高免疫检查点抑制剂的响应率。虽然已经确定了转移性疾病的免疫治疗生物标志物，但肿瘤突变负荷(tmb)或pd-l1表达与新辅助免疫治疗反应之间的关系仍有争议。因此，利用新的潜在生物标志物来进一步明确新辅助免疫治疗患者的选择，还需要进一步的研究，以筛选获益人群。


技术实现要素：

4.本技术是基于发明人对以下问题的发现和认识作出的：
5.本技术中，发明人经过大量的实验探索，发现预定基因的拷贝数扩增负荷可以用来预测对象肿瘤免疫检查点抑制剂的治疗疗效，当所述基因的拷贝数扩增负荷达到特定阈值时，可以认为对所述对象可以获得较好的免疫检查点抑制剂治疗，进一步可显著提高肺癌免疫检查点抑制剂治疗的响应率。
6.因此，在本发明的第一方面，本发明提出了基因集在作为预测对象肺癌免疫检查点抑制剂疗效的标志物的用途，所述基因集包含表1中所示基因中的至少之一。根据本发明实施例的标志物组合可以有效预测所述对象肿瘤免疫检查点抑制剂的治疗疗效，从而提高肺癌免疫检查点抑制剂治疗的响应率。
7.表1:
8.abl1akt1akt2akt3alkalox12bapcarid1aarid1barid2asxl1atmatraurkaaurkbaxin1axlbap1bard1bcl2l1blmbrafbrca1brca2brd4brip1calrcard11casp8cbfbcblccnd1ccnd2ccnd3ccne1cd274cd79acd79bcdc73cdh1cdk12cdk4cdk6cdk8cdkn2achek1chek2ciccrebbpcsf1rcsf3rctcfctnnb1cul3cylddaxxddr2dicer1dis3dnmt3a
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9.根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
10.根据本发明的实施例，所述肺癌为非小细胞肺癌。利用所述基因集对患有非小细胞肺癌的患者进行免疫检查点抑制剂治疗效果预测时的准确性较高。
11.根据本发明的实施例，所述免疫检查点抑制剂为pd-1/pd-l1抑制剂。根据本发明的具体实施例，当所述免疫检查点抑制剂为pd-1/pd-l1抑制剂，所述标志物可以精准预测所述对象肺癌免疫检查点抑制剂的治疗疗效。
12.根据本发明的实施例，依据所述基因集的基因拷贝数扩增负荷判断所述对象免疫检查点抑制剂治疗是否有效。
13.根据本发明的实施例，所述基因拷贝数扩增负荷小于8.5是所述对象接受免疫检查点抑制剂治疗临床获益的指示。
14.根据本发明的实施例，所述基因拷贝数扩增负荷为基因拷贝数＞3的基因的总数。
15.在本发明的第二方面，本发明提出了一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，所述程序用于预测对象肺癌免疫检查点抑制剂疗效。根据本发明的实施例，该程序被处理器执行时获得基因集的基因拷贝数突变负荷。根据本发明实施例的计算机可读存储介质可以准确获得所述基因集的基因拷贝数突变负荷，所述基因集的基因拷贝数突变负荷可以有效预测所述对象是否适于肺癌免疫检查点抑制剂治疗。
16.根据本发明的实施例，所述基因集包含表1中所示基因中的至少之一。
17.在本发明的第三方面，本发明提出了一种用于预测对象肺癌免疫检查点抑制剂疗效的电子设备。根据本发明的实施例，包括：第二方面所述的计算机可读存储介质；以及一个或者多个处理器，用于执行所述计算机可读存储介质中的程序。根据本发明实施例的电子设备能够利用所述处理器执行所述计算机可读存储介质中的程序，从而准确获得前面所述基因集的基因拷贝数突变负荷，所述基因集的基因拷贝数突变负荷可以有效预测所述对
象是否适于胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂治疗。因此，所述电子设备可准确预测所述对象肺癌免疫检查点抑制剂疗效。
18.在本发明的第四方面，本发明提出了基因集的基因拷贝数扩增负荷在预测对象肺癌免疫检查点抑制剂治疗疗效中的用途，所述基因集包含表1所示基因中的至少之一。根据本发明实施例的所述基因集的基因拷贝数扩增负荷可以准确预测对象肺癌免疫检查点抑制剂治疗疗效，可显著提高肺癌免疫检查点抑制剂的响应率。
19.根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
20.根据本发明的实施例，依据所述基因集的基因拷贝数扩增负荷判断所述对象免疫检查点抑制剂治疗是否有效。
21.根据本发明的实施例，所述基因拷贝数扩增负荷小于8.5是所述对象接受免疫检查点抑制剂治疗临床获益的指示。
22.根据本发明的实施例，所述基因拷贝数扩增负荷为基因拷贝数＞3的基因的总数。
23.根据本发明的实施例，所述基因集的基因拷贝数扩增负荷是通过以下方式获得的：1)基于白细胞中所述基因集的测序数据，获得来源于白细胞的基因集的基因捕获区域的覆盖深度基线；2)基于肿瘤组织中所述基因集的测序数据，获得来源于肿瘤组织的基因集的基因捕获区域的覆盖深度；3)基于所述来源于肿瘤组织基因集的基因捕获区域的覆盖深度和来源于白细胞基因集的基因捕获区域的覆盖深度基线的比值的log2值，获得所述基因集的基因捕获区域的拷贝数；4)基于所述基因集的基因捕获区域的拷贝数，及其所占权重，获得基因集的基因拷贝数；5)基于所述基因集的基因拷贝数获得所述基因集的基因拷贝数扩增负荷。根据本发明的具体实施例，所述权重并不受特别限制，本领域技术人员可根据实验目的及实验方法的不同，对所述基因集的基因各捕获区域的拷贝数所占的权重进行调整。
24.根据本发明的实施例，所述白细胞中所述基因集的测序数据是通过利用所述对象的dna文库1进行高通量测序获得；
25.根据本发明的实施例，所述对象的dna文库1是基于所述对象的核酸样品1构建的。
26.根据本发明的实施例，所述核酸样品1来源于所述对象的白细胞。
27.根据本发明的实施例，所述肿瘤组织中所述基因集的测序数据是通过利用所述对象的dna文库2 进行高通量测序获得。
28.根据本发明的实施例，所述对象的dna文库2是基于所述对象的核酸样品2构建的。
29.根据本发明的实施例，所述核酸样品2来源于所述对象的肿瘤组织。
30.在本发明的第五方面，本发明提出了一种预测对象肺癌免疫检查点抑制剂治疗疗效的方法。根据本发明的实施例，包括：基于待测对象基因集的基因拷贝数扩增负荷判断所述对象免疫检查点抑制剂治疗是否有效。根据本发明实施例的方法依据所述待测对象基因集的基因拷贝数扩增负荷，可以准确预测所述对象免疫检查点抑制剂治疗是否有效，从而提高肺癌免疫检查点抑制剂治疗的响应率。
31.根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
32.根据本发明的实施例，所述肺癌为非小细胞肺癌。
33.根据本发明的实施例，所述基因拷贝数扩增负荷小于8.5是所述对象接受免疫检查点抑制剂治疗临床获益的指示。
34.根据本发明的实施例，所述基因集包含表1中所示基因中的至少之一。
35.根据本发明的实施例，所述基因拷贝数扩增负荷为基因拷贝数＞3的基因的总数。
36.根据本发明的实施例，所述基因集的基因拷贝数扩增负荷是通过以下方式获得的：1)基于白细胞中所述基因集的测序数据，获得来源于白细胞的基因集的基因捕获区域的覆盖深度基线；2)基于肿瘤组织中所述基因集的测序数据，获得来源于肿瘤组织的基因集的基因捕获区域的覆盖深度；3)基于所述来源于肿瘤组织基因集的基因捕获区域的覆盖深度和白细胞基因集的基因捕获区域的覆盖深度基线的比值的log2值，获得所述基因集的基因捕获区域的拷贝数；4)基于所述基因集的基因捕获区域的拷贝数，及其所占权重，获得基因集的基因拷贝数；5)基于所述基因集的基因拷贝数获得所述基因集的基因拷贝数扩增负荷。根据本发明的具体实施例，所述权重的设置不受特别限制，本领域技术人员可根据实验目的及实验方法的不同，对所述基因集的基因各捕获区域的拷贝数所占的权重进行调整。
37.根据本发明的实施例，所述白细胞中所述基因集的测序数据是通过利用所述对象的dna文库1进行高通量测序获得；
38.根据本发明的实施例，所述对象的dna文库1是基于所述对象的核酸样品1构建的。
39.根据本发明的实施例，所述核酸样品1来源于所述对象的白细胞。
40.根据本发明的实施例，所述肿瘤组织中所述基因集的测序数据是通过利用所述对象的dna文库2 进行高通量测序获得。
41.根据本发明的实施例，所述对象的dna文库2是基于所述对象的核酸样品2构建的。
42.根据本发明的实施例，所述核酸样品2来源于所述对象的肿瘤组织。
43.在本发明的第六方面，本发明提出了一种对人群进行划分的方法。根据本发明的实施例，包括：基于所述人群中个体基因集的基因拷贝数扩增负荷，对人群中适于或不适于肺癌免疫检查点抑制剂治疗的个体进行划分。根据本发明实施例的方法依据所述待测个体基因集的基因拷贝数扩增负荷的大小，可以准确预测所述对象免疫检查点抑制剂治疗是否有效，根据所述预测结果可以将所述人群划分为适于肺癌免疫检查点抑制剂治疗和不适于肺癌免疫检查点抑制剂治疗。
44.根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
45.根据本发明的实施例，所述基因集包含表1中所示基因中的至少之一。
46.根据本发明的实施例，所述肺癌为非小细胞肺癌。
47.根据本发明的实施例，所述基因拷贝数扩增负荷小于8.5是所述对象接受免疫检查点抑制剂治疗临床获益的指示。
48.根据本发明的实施例，所述基因集包含表1中所示基因中的至少之一。
49.根据本发明的实施例，所述基因拷贝数扩增负荷为基因拷贝数＞3的基因的总数。
50.根据本发明的实施例，所述基因集的基因拷贝数扩增负荷是通过以下方式获得的：1)基于白细胞中所述基因集的测序数据，获得来源于白细胞的基因集的基因捕获区域的覆盖深度基线；2)基于肿瘤组织中所述基因集的测序数据，获得来源于肿瘤组织的基因集的基因捕获区域的覆盖深度；3)基于所述来源于肿瘤组织基因集的基因捕获区域的覆盖深度和来源于白细胞基因集的基因捕获区域的覆盖深度基线的比值的log2值，获得所述基因集的基因捕获区域的拷贝数；4)基于所述基因集的基因捕获区域的拷贝数，及其所占权
重，获得基因集的基因拷贝数；5)基于所述基因集的基因拷贝数获得所述基因集的基因拷贝数扩增负荷。根据本发明的具体实施例，所述权重的设置不受特别限制，本领域技术人员可根据实验目的及实验方法的不同，对所述基因集的基因各捕获区域的拷贝数所占的权重进行调整。
51.根据本发明的实施例，所述白细胞中所述基因集的测序数据是通过利用所述对象的dna文库1进行高通量测序获得；
52.根据本发明的实施例，所述对象的dna文库1是基于所述对象的核酸样品1构建的。
53.根据本发明的实施例，所述核酸样品1来源于所述对象的白细胞。
54.根据本发明的实施例，所述肿瘤组织中所述基因集的测序数据是通过利用所述对象的dna文库2 进行高通量测序获得。
55.根据本发明的实施例，所述对象的dna文库2是基于所述对象的核酸样品2构建的。
56.根据本发明的实施例，所述核酸样品2来源于所述对象的肿瘤组织。
57.在本发明的第七方面，本发明提出了一种预测对象肺癌免疫检查点抑制剂疗效的系统。根据本发明的实施例，包括：确定肺癌免疫检查点抑制剂疗效装置，所述确定肺癌免疫检查点抑制治疗疗效装置用于基于待测对象基因集的基因拷贝数扩增负荷，判断所述对象免疫检查点抑制剂治疗是否有效。根据本发明实施例的系统可以有效获得所述待测对象基因集的基因拷贝数扩增负荷的大小，从而判断所述对象免疫检查点抑制剂治疗是否有效，针对免疫检查点抑制剂治疗有效的对象施药，可以提高肺癌免疫检查点抑制剂治疗的响应率。
58.根据本发明的实施例，上述系统还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
59.根据本发明的实施例，所述待测对象基因拷贝数扩增负荷小于8.5，是所述对象免疫检查点抑制剂治疗有效的指示。
60.根据本发明的实施例，所述基因集包含表1中所示基因中的至少之一。
61.根据本发明的实施例，所述系统进一步包括：白细胞基因集覆盖深度基线获得装置，用于基于白细胞中所述基因集的测序数据，获得来源于白细胞基因集的基因捕获区域的覆盖深度基线；肿瘤组织基因集的覆盖深度获得装置，用于基于肿瘤组织中所述基因集的测序数据，获得来源于肿瘤组织基因集的基因捕获区域的覆盖深度；基因集基因捕获区域拷贝数获得装置，所述基因集基因捕获区域拷贝数获得装置与所述白细胞基因集覆盖深度基线获得装置、肿瘤组织基因集的覆盖深度获得装置相连，用于基于所述来源于肿瘤组织基因集的基因捕获区域的覆盖深度和来源于白细胞基因集的基因捕获区域的覆盖深度基线的比值的log2值，获得基因集的基因捕获区域的拷贝数；基因集基因拷贝数获得装置，所述基因集基因拷贝数获得装置与所述基因集基因捕获区域拷贝数获得装置相连，用于基于所述基因集的基因各捕获区域的拷贝数，及其所占权重，获得基因集的基因拷贝数；基因集基因拷贝数扩增负荷获得装置，所述基因集的基因拷贝数扩增负荷获得装置与所述基因集基因拷贝数获得装置、确定肺癌免疫检查点抑制剂疗效装置相连，并且用于基于所述基因集的基因拷贝数获得所述基因集的基因拷贝数扩增负荷。
62.根据本发明的实施例，所述系统进一步包括：dna文库构建装置1，用于基于所述对象的核酸样品 1构建所述对象的dna文库1；dna文库构建装置2，用于基于所述对象的核酸样品2构建所述对象的dna文库2；测序数据获取装置1，所述测序数据获取装置1与所述dna
文库构建装置1和所述白细胞基因集覆盖深度基线获得装置相连，并用于利用所述对象的dna文库1进行高通量测序，以便获得所述白细胞中所述基因集的测序数据；测序数据获取装置2，所述测序数据获取装置2与所述dna 文库构建装置2和所述肿瘤组织基因集的覆盖深度获得装置相连，并用于利用所述对象的dna文库2 进行高通量测序，以便获得所述白细胞中所述基因集的测序数据。
63.在本发明的第八方面，本发明提出了一种预测对象肺癌免疫检查点抑制剂治疗疗效的试剂盒。根据本发明的实施例，包括用于检测基因集中任一基因的试剂。根据本发明实施例的试剂盒可以有效检测从所述对象体内分离的样本，并基于所述检测基因集中任一基因的试剂，检测样本是所述基因集中任一基因的拷贝数，从而准确预测所述对象肺癌免疫检查点抑制剂治疗疗效，针对免疫检查点抑制剂治疗有效的对象施药，从而提高肺癌免疫检查点抑制剂治疗的响应率，所述试剂盒同时具有灵敏度高、检测成本低等优点。
64.根据本发明的实施例，上述试剂盒还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
65.根据本发明的实施例，所述基因集包含表1中所示基因中的至少之一。
66.根据本发明的实施例，所述肺癌为非小细胞肺癌。
67.根据本发明的实施例，包括以下中的至少之一：dna提取试剂、建库试剂或高通量测序试剂。
68.根据本发明的实施例，所述试剂盒进一步包括：参考数据集，用来作为基因集的参考。
69.根据本发明的实施例，所述试剂盒还包括第一计算机程序产品，所述第一计算机程序产品用来执行第五方面所述的预测对象肺癌免疫检查点抑制剂疗效的方法。
70.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
71.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
72.图1是根据本发明实施例的系统装置图，所述系统包含确定肺癌免疫检查点抑制剂疗效装置；
73.图2是根据本发明实施例的系统装置图，所述系统包含确定肺癌免疫检查点抑制剂疗效装置、白细胞基因集覆盖深度基线获得装置、肿瘤组织基因集覆盖深度获得装置、基因集基因捕获区域拷贝数获得装置、基因集基因拷贝数获得装置、基因集的基因拷贝数扩增负荷获得装置；
74.图3是根据本发明实施例的系统装置图，所述系统包含确定肺癌免疫检查点抑制剂疗效装置、白细胞基因集覆盖深度基线获得装置、肿瘤组织基因集的覆盖深度获得装置、基因集基因捕获区域拷贝数获得装置、基因集基因拷贝数获得装置、基因集的基因拷贝数扩增负荷获得装置、dna文库构建装置1、 dna文库构建装置2、测序数据获取装置1、测序数据获取装置2；
75.图4是根据本发明实施例的实验流程图；
76.图5是根据本发明实施例的22例接受pd-1抑制剂新辅助治疗的非小细胞肺癌患者计算得到的拷贝数扩增负荷结果分析图；其中，
77.图a为拷贝数扩增负荷与新辅助免疫治疗后病理缓解率的相关性分析结果图，
78.图b为获得主要病理缓解(major pathological regression，mpr，定义为手术中残余存活肿瘤≤ 10％)与未获得主要病理缓解(non-mpr)非小细胞肺癌患者拷贝数扩增负荷比较分析结果图，
79.图c和图d为mpr和non-mpr患者在拷贝数扩增负荷高或拷贝数扩增负荷低组的分布结果图；以及
80.图6是根据本发明实施例的使用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic，roc) 计算22例接受pd-1抑制剂新辅助治疗的非小细胞肺癌患者的肿瘤突变负荷(tmb)、pd-l1(采用 22c3抗体检测表达水平，tumor proportion score即tps≥50％视为高表达)及拷贝数扩增负荷3个指标的roc曲线下面积(area under roc curve，auc)，以评估拷贝数扩增负荷、tmb及pd-l1指标各自预测pd-1抑制剂新辅助免疫治疗疗效的能力的结果图。
具体实施方式
81.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
82.此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
83.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
84.本文中，术语“约”用于提供与给定术语、度量或值相关联的灵活性和不精确性。本领域技术人员可以容易地确定具体变量的灵活性程度。
85.浓度、量和其他数值数据可以在本文中以范围格式呈现。应当理解，这样的范围格式仅是为了方便和简洁而使用，并且应当灵活地解释为不仅包括明确叙述为范围极限的数值，而且还包括涵盖在所述范围内的所有单独的数值或子范围，就如同每个数值和子范围都被明确叙述一样。此外，无论所描述的范围或特征的广度如何，都应当适用这种解释。
86.任何方法或过程权利要求中所述的任何步骤可以以任何顺序执行，并且不限于权利要求中提出的顺序。
87.本文中，术语“组织样本”、“肿瘤组织样本”含义相同，互换使用，都是指患者新辅助免疫治疗前基线肿瘤组织样本。
88.本文中，术语“肿瘤组织dna”、“组织dna”、“ffpe-dna”含义相同，互换使用，都是指患者新辅助治疗前基线肿瘤组织样本dna。
89.本文中，dna片段的拷贝数变异(copy number variation,cnv)是由基因组发生重排而导致的,包括大于1kb长度dna片段的扩增与缺失。cnv是基因组结构变异的重要组成部
分,是人类疾病的重要致病因素之一。异常的dna拷贝数变化是肿瘤发生发展以预后的临床指标，并且被认为具有指导肿瘤患者用药的潜力。高通量测序cnv可以检测全基因组水平上的大片段cnv或目标基因区间探测dna 片段的cnv。
90.本文中，拷贝数扩增(cn gain)是指基因拷贝数》3，拷贝数缺失(cn loss)是指基因拷贝数《1.5。
91.本文中，术语“免疫检查点抑制剂新辅助治疗”是指在手术前所进行的通过抑制免疫检查点功能，恢复集体抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤的治疗方式。
92.本文中，术语“单端模式测序”是指仅对文库dna分子一条单链进行测序；术语“双端模式测序”是指对同一文库dna分子互补的两条单链分别进行测序。
93.本文中，术语“覆盖深度”是通过与基因组匹配的所有短读的碱基数目除以该基因组的长度来计算的。它通常表示为1x、2x、3x、...(1、2或3倍覆盖)，通常被称为测序深度(sequencing depth)或者覆盖深度(depth of coverage)。
94.本文中，术语“中位数(median)”又称中值，统计学中的专有名词，是按顺序排列的一组数据中居于中间位置的数，代表一个样本、种群或概率分布中的一个数值，其可将数值集合划分为相等的上下两部分。对于有限的数集，可以通过把所有观察值高低排序后找出正中间的一个作为中位数。如果观察值有偶数个，取最中间的两个数值的平均数作为中位数。
95.本文中，术语“权重”是一个相对的概念。某一指标的权重是指该指标在整体评价中的相对重要程度，可表示为某一因素或指标所占的百分比，如，基因1的a、b、c捕获区域的拷贝数分别为4、5、 6，a、b、c捕获区域的拷贝数所占的权重为10％、20％、70％，则该基因1的拷贝数为4
×
10％ 5
ꢀ×
20％ 6
×
70％。
96.为方便理解，发明人对本发明进行简单描述，本发明中，发明人基于非小细胞肺癌患者肿瘤组织 dna中基因拷贝数变异计算得到的拷贝数扩增负荷，利用拷贝数扩增负荷预测非小细胞肺癌患者免疫检查点抑制剂新辅助治疗疗效。具体步骤如下：s1，采集非小细胞肺癌患者新辅助治疗前肿瘤组织和配对的白细胞样本，提取肿瘤组织dna和白细胞dna；s2，采用肿瘤组织dna和白细胞dna构建基因文库；s3，利用靶向序列捕获探针与目标区域特异性杂交，从基因文库中捕获并富集靶向目标基因，获得肿瘤组织dna和白细胞dna靶向测序数据；s4，使用配对的白细胞dna作为对照，计算肿瘤组织dna样本靶向基因拷贝数数值；s5，计算肿瘤组织的基因拷贝数扩增负荷；s6，根据拷贝数扩增负荷预测非小细胞肺癌患者免疫检查点抑制剂新辅助治疗疗效。其中，步骤s4中获得的拷贝数变异后，进行以下步骤：a)计算患者肿瘤组织样本拷贝数扩增负荷值：拷贝数扩增负荷＝每个样本中发生拷贝数扩增的基因总数；其中，拷贝数扩增代表基因拷贝数》3；b)根据拷贝数扩增负荷预测非小细胞肺癌患者免疫检查点抑制剂新辅助治疗疗效。所述治疗疗效包括非小细胞肺癌免疫检查点抑制剂新辅助治疗疗效，所述免疫检查点为pd-1。步骤b)选取阈值为x，≥x的肿瘤患者为高风险患者，《x的肿瘤患者为低风险患者。其中，在非小细胞肺癌患者中，得出的拷贝数扩增负荷根据阈值x分为低组的肿瘤患者，更有可能从免疫检查点抑制剂新辅助治疗中获益。较优选地，当所述阈值为8.5时，所述方法预测免疫检查点抑制剂疗效更加准确，其中≥8.5的肿瘤患者为高风险患者，《8.5的肿瘤患者为低风险患者，其中，所述阈值不受特别限制，本领域技术人员可根据不同的实验或筛选目的，选取不同的阈值。
97.在本发明的一些具体实施方案中，本发明提出了一种预测对象肺癌免疫检查点抑制剂疗效的系统，如图1所示，包括：确定肺癌免疫检查点抑制剂疗效装置s1000，所述确定肺癌免疫检查点抑制治疗疗效装置s1000用于基于待测对象基因集的基因拷贝数扩增负荷，判断所述对象免疫检查点抑制剂治疗是否有效。根据本发明实施例的系统可以有效获得所述待测对象基因集的基因拷贝数扩增负荷的大小，从而判断所述对象免疫检查点抑制剂治疗是否有效，针对免疫检查点抑制剂治疗有效的对象施药，可以提高肺癌免疫检查点抑制剂治疗的响应率。
98.根据本发明的一些具体实施方案，上述系统还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
99.根据本发明的一些具体实施方案，所述待测对象基因拷贝数扩增负荷小于8.5，是所述对象免疫检查点抑制剂治疗有效的指示。
100.根据本发明的一些具体实施方案，所述基因集包含表1中所示基因中的至少之一。
101.根据本发明的一些具体实施方案，如图2所示，所述系统进一步包括：白细胞基因集覆盖深度基线获得装置s300，用于基于白细胞中所述基因集的测序数据，获得来源于白细胞基因集的基因捕获区域的覆盖深度基线；肿瘤组织基因集覆盖深度获得装置s600，用于基于肿瘤组织中所述基因集的测序数据，获得来源于肿瘤组织基因集的基因捕获区域的覆盖深度；基因集基因捕获区域拷贝数获得装置 s700，所述基因集基因捕获区域拷贝数获得装置s700与所述白细胞基因集覆盖深度基线获得装置 s300、肿瘤组织基因集的覆盖深度获得装置s600相连，用于基于所述来源于肿瘤组织基因集中基因捕获区域的覆盖深度与来源于白细胞的基因集中基因捕获区域的覆盖深度基线的比值的log2值，获得所述基因集的基因捕获区的域拷贝数；基因集基因拷贝数获得装置s800，所述基因集基因拷贝数获得装置s800与所述基因集基因捕获区域拷贝数获得装置s700相连，用于基于所述基因集的基因各捕获区域的拷贝数，及其所占权重，获得基因集的基因拷贝数；基因集的基因拷贝数扩增负荷获得装置s900，所述基因集的基因拷贝数扩增负荷获得装置s900与所述基因集基因拷贝数获得装置s800、确定肺癌免疫检查点抑制剂疗效装置s1000相连，并且用于基于所述基因集的基因拷贝数获得所述基因集的基因拷贝数扩增负荷。
102.根据本发明的一些具体实施方案，如图3所示，所述系统进一步包括：dna文库构建装置1s100，用于基于所述对象的核酸样品1构建所述对象的dna文库1；dna文库构建装置2s400，用于基于所述对象的核酸样品2构建所述对象的dna文库2；测序数据获取装置1s200，所述测序数据获取装置 1s200与所述dna文库构建装置1s100和所述白细胞基因集覆盖深度基线获得装置s300相连，并用于利用所述对象的dna文库1进行高通量测序，以便获得来源于所述白细胞中所述基因集的测序数据；测序数据获取装置2s500，所述测序数据获取装置2s500与所述dna文库构建装置2s400和所述肿瘤组织基因集的覆盖深度获得装置s600相连，并用于利用所述对象的dna文库2进行高通量测序，以便获得所述白细胞中所述基因集的测序数据。
103.下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
104.实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常
规产品。
105.实施例1拷贝数扩增负荷值对非小细胞肺癌患者免疫检查点抑制剂治疗疗效的影响
106.本实施例基于22例非小细胞肺癌接受pd-1抑制剂新辅助治疗的患者建立拷贝数扩增负荷值预测治疗疗效，通过评估所述患者拷贝数扩增负荷的大小对其免疫治疗疗效进行预测，本实验的操作流程如图4所示。具体实验内容如下：
107.1.1实验操作
108.1)采集22例非小细胞肺癌患者的新辅助治疗前基线肿瘤组织和配对的白细胞样本。
109.2)提取肿瘤组织和白细胞dna：
110.肿瘤组织提取：采用磁珠法石蜡dna预分装提取试剂盒和48位核酸提取仪提取22例非小细胞肺癌患者肿瘤组织dna(ffpe-dna)；
111.白细胞样本提取：采用tguides32磁珠法血液基因组提取试剂盒-t5c和tguides32全自动核酸提取纯化仪提取白细胞dna；
112.使用equalbit1
×
dsdnahsassaykit和qubit4.0荧光计定量dna浓度；
113.利用covarism220超声破碎仪将提取得到的ffpe-dna和白细胞dna进行片段化，将dna打断为150-200bp的片段。
114.3)建库杂交捕获富集
115.ffpe-dna样本建库：使用kapahyperprepkit试剂盒构建dna文库；
116.白细胞dna样本建库：用tianseq快速dna片段化/末端修复/da添加模块进行gdna的片段化和末端修复加a，然后用tianseq快速连接模块进行接头连接。接头连接后用agencourtampurexp纯化接头连接产物，然后用kapalibraryamplificationkits完成文库扩增，扩增后的文库用agencourtampurexp磁珠纯化；
117.文库质控：用equalbit1
×
dsdnahsassaykit和qubit4.0荧光计定量文库浓度；
118.文库杂交捕获：ffpe-dna和白细胞dna文库pooling一起后，用真空浓缩仪进行蒸干，加入idt杂交捕获试剂和panel探针进行目的片段杂交捕获反应。
119.捕获富集文库质控：用equalbit1
×
dsdnahsassaykit和qubit4.0荧光计定量dna浓度，用agilent2100核酸片段分析仪检测文库片段分布。
120.4)上机测序
121.使用novaseq6000(因美纳)测序仪，以双端模式进行高通量测序。
122.1.2拷贝数扩增负荷分析：
123.1)对测序得到的肿瘤组织dnapanel测序数据，根据标准分析流程，可采用bwa软件(v0.7.17)按照人类基因组(hg19)进行序列比对，采用picardtoolkit(v2.1.0)和gatk分析工具(v3.7)对bam文件进行去重和组装。
124.2)以配对的白细胞dna作为对照，使用cnvkit(v0.9.2)分析肿瘤样本中每个基因的拷贝数变异情况，认为基因拷贝数》3为拷贝数扩增。
125.3)根据22例患者的拷贝数扩增情况计算每个样本的拷贝数扩增负荷：
126.拷贝数扩增负荷＝每个样本中发生拷贝数扩增的基因总数；其中，拷贝数扩增即
基因拷贝数》3。
127.4)根据阈值(所述阈值为22个患者基因拷贝数扩增负荷的中位数)将患者分为拷贝数扩增负荷高组和拷贝数扩增负荷低组，对拷贝数扩增负荷和患者接受新辅助免疫治疗的疗效进行相关性分析。
128.三、结果部分：
129.共检测了22例非小细胞肺癌患者的免疫检查点抑制剂新辅助治疗前基线样本进行分析。计算患者肿瘤组织样本的拷贝数扩增负荷值。如附图5的a图中的相关性分析曲线显示，患者治疗前基线肿瘤组织样本的拷贝数扩增负荷值与主要病理缓解率呈显著负相关性；附图5的b图显示，获得主要病理缓解(mpr)的患者拷贝数扩增负荷值显著低于non-mpr的患者。
130.利用阈值(拷贝数扩增负荷值＝8.5)对患者进行分组，具体的实验结果如附图5中的c图和d图所示，拷贝数扩增负荷低组的患者更有从pd-1抑制剂新辅助免疫治疗中获益的可能，拷贝数扩增负荷低组的患者更高比例获得mpr。
131.实施例2拷贝数扩增负荷值、tmb、pd-l1方法预测肺癌患者免疫检查点抑制剂治疗疗效
132.本实施例基于22例非小细胞肺癌接受pd-1抑制剂新辅助治疗的患者比较拷贝数扩增负荷、tmb及pd-l1预测新辅助免疫治疗疗效的能力。具体实验内容如下：
133.2.1实验步骤
134.1)采集22例非小细胞肺癌患者的新辅助治疗前基线肿瘤组织和配对的白细胞样本。
135.2)提取肿瘤组织和白细胞dna：
136.肿瘤组织提取：采用磁珠法石蜡dna预分装提取试剂盒和48位核酸提取仪提取22例非小细胞肺癌患者肿瘤组织dna(ffpe-dna)；
137.白细胞样本提取：采用tguides32磁珠法血液基因组提取试剂盒-t5c和tguides32全自动核酸提取纯化仪提取白细胞dna；
138.使用equalbit1
×
dsdnahsassaykit和qubit4.0荧光计定量dna浓度；
139.利用covarism220超声破碎仪将提取得到的ffpe-dna和白细胞dna进行片段化，将dna打断为150-200bp的片段。
140.3)建库杂交捕获富集
141.ffpe-dna样本建库：使用kapahyperprepkit试剂盒构建dna文库；
142.白细胞dna样本建库：用tianseq快速dna片段化/末端修复/da添加模块进行gdna的片段化和末端修复加a，然后用tianseq快速连接模块进行接头连接。接头连接后用agencourtampurexp纯化接头连接产物，然后用kapalibraryamplificationkits完成文库扩增，扩增后的文库用agencourtampurexp磁珠纯化；
143.文库质控：用equalbit1
×
dsdnahsassaykit和qubit4.0荧光计定量文库浓度；
144.文库杂交捕获：ffpe-dna和白细胞dna文库pooling一起后，用真空浓缩仪进行蒸干，加入idt杂交捕获试剂和panel探针进行目的片段杂交捕获反应；
145.捕获富集文库质控：用equalbit1
×
dsdnahsassaykit和qubit4.0荧光计定
量dna浓度，用agilent 2100核酸片段分析仪检测文库片段分布。
146.4)上机测序
147.使用novaseq 6000(因美纳)测序仪，以双端模式进行高通量测序。
148.5)利用免疫组化的方法，采用22c3抗体检测肿瘤组织的pd-l1阳性肿瘤细胞占比。
149.2.2数据分析
150.1)对测序得到的肿瘤组织dna panel测序数据，根据标准分析流程，可采用bwa软件(v0.7.17) 按照人类基因组(hg19)进行序列比对，采用picard toolkit(v2.1.0)和gatk分析工具(v 3.7)对bam 文件进行去重和组装。
151.2)以配对的白细胞dna作为对照，使用cnvkit(v0.9.2)分析肿瘤样本中每个基因的拷贝数变异情况，认为基因拷贝数》3为拷贝数扩增，基因拷贝数《1.5为拷贝数缺失。
152.3)根据22例患者的拷贝数扩增情况计算每个样本的拷贝数扩增负荷：
153.拷贝数扩增负荷＝每个样本中发生拷贝数扩增的基因总数；其中，拷贝数扩增代表基因拷贝数》3。
154.4)以配对的白细胞dna作为对照，计算22例患者的肿瘤组织样本tmb值。
155.5)根据免疫组化结果，获得22例患者的肿瘤组织样本pd-l1阳性肿瘤细胞占比(tps)。
156.6)使用roc曲线计算曲线下面积(auc)，评估拷贝数扩增负荷、tmb及pd-l1共3个指标对pd-1 抑制剂新辅助免疫治疗疗效的预测能力。
157.2.3结果分析
158.对检测的22例非小细胞肺癌患者的免疫检查点抑制剂新辅助治疗前基线样本进行分析，计算患者肿瘤组织样本的拷贝数扩增负荷值、tmb值及pd-l1 tps。
159.具体实验结果如图6所示，与tmb和pd-l1 tps预测pd-1抑制新辅助治疗的非小细胞肺癌患者获得的主要病理缓解率相比，拷贝数扩增负荷的roc曲线下面积(auc)更高(auc＝0.8143)。显示拷贝数扩增负荷预测pd-1抑制剂新辅助治疗的非小细胞肺癌患者主要病理缓解率的能力优于tmb和pd-l1 tps。
160.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
161.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。