一种液相色谱同时测定芝麻油中四种香精的方法与流程

1.本发明涉及食品检测技术领域，特别是涉及一种液相色谱同时测定芝麻油中四种香精的方法。


背景技术：

2.食用香精是一种能够赋予食品香味的混合物，增香和提味的作用，它可以弥补食品本身的香味缺陷，赋予部分食品生动的原滋味，加强食品的香味，掩盖食物的不良气息，食用香精在使用时还具有“自我设限”特性，当超过一定量时，其香味会令人难以接受。食品香精已经成为现代食品工业不可缺少的重要组成部分。
3.香兰素、乙基香兰素、甲基香兰素是gb2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》允许使用的食品用合成香料，根据实际酌情添加，同时香兰素和乙基香兰素允许在较大婴儿和幼儿配方食品中使用，香兰素允许在婴幼儿谷类辅助使用中使用，均规定了使用限量。
4.香豆素具有新鲜干草香和香豆香，一般不作食用，允许烟用和外用，虽然近年来有很多研究表明香豆素类化合物具有抗hiv、抗癌、降压、抗心律失常、抗骨质疏松、镇痛、平喘及抗菌等多方面生物学活性，但其并不在gb2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》范围中。
5.2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，香豆素在3类致癌物(对人类致癌可疑但尚无充分的人体或动物数据的一类化合物)清单中。
6.食用植物油是每个家庭或每个人每日必吃的食物。随着经济的发展，国民生活水平的提高，人们更倾向于高品质油。gb2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》明确规定植物油脂中不得添加食品用香料、香精。然而有些不法企业在食用植物油产品中违规添加香料，例如当前火锅用芝麻调和油以定型包装的形式或火锅店自配的方式在火锅行业普遍使用。近年来，一些不法商家利用芝麻油香精价格低廉、用量少的特点，在调和油脂中掺入调香、调色违规添加物，以次充好，这是一种欺骗消费者的违法行为。因此，作为风靡全国的川渝麻辣火锅必备佐餐油碟产品，一类含芝麻油的调和油产品，建立简便、快捷的食用植物油中香兰素类香精物质的检测方法来甄别真假芝麻油，对维护人民群众的健康和权益具有极其重要的意义。然而目前我国还没有专门测定食用植物油中香兰素类物质的方法。
7.《gb 5009.284-2021食品安全国家标准食品中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的测定》中，只适用于婴幼儿配方食品、婴幼儿辅助食品、糕点、糖果、乳及乳制品、饮料、小麦粉中的测定，并不适用植物油脂，包括芝麻油在内。
8.国家食品药品监督管理总局批准发布的补充检验方法《食品中香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的测定》(bjs 201705)中，采用高效液相色谱-串联质谱的测定方法可以测定植物油脂等食品中香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的测定。
9.查阅近年文献，宁霄等人曾发表文章，采用超高液相色谱-串联质谱法同时测定食品中麦芽酚、乙基麦芽酚、香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素；孙雪梅等人曾采用高效液相色谱法同时测定奶味饮料中的香兰素和乙基香兰素；陈静等人曾采用高效液相色谱法快速测定乳与乳制品中4种香兰素类化合物；贾璇等人曾采用高效液相色谱法测定了邻位香兰素工业原料中的邻位香兰素、香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素。
10.由此可见现有的通用检测标准、文献中均没有适用于芝麻油中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的高效液相色谱测定方法。


技术实现要素：

11.有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是，怎样提供一种能够适用于芝麻油中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的高效液相色谱测定方法。
12.为实现上述目的，本发明提供了一种液相色谱同时测定芝麻油中四种香精的方法，其特征在于，包括以下步骤，a、配制香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的混合标准工作溶液；b、芝麻油样品用乙腈提取，经正己烷去脂，旋转蒸发浓缩样品，使用80％甲醇溶液复溶并得到样品溶液；c、采用液相色谱仪依次对a步骤中得到的混合标准工作溶液进行测定，并绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程；再采用液相色谱仪对b步骤中得到的样品溶液进行检测,并根据生成的标准曲线得到样品溶液被测组分的溶液浓度值c；d、根据公式计算得到样品溶液中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的含量，式中，x为样品中被测组分的含量，单位为mg/kg；c为溶液浓度,单位为mg/l，v为乙腈体积，单位为ml，m为样品质量，单位为g；10为样品浓缩倍数。
13.这样，上述的液相色谱同时测定芝麻油中四种香精的方法中，通过配制香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的混合标准工作溶液，并采用液相色谱仪依次对配制得到的香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的混合标准工作溶液进行测定，根据测定得到信息绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程。并且配制得到样品溶液时，芝麻油样品用乙腈提取，经正己烷去脂，旋转蒸发浓缩样品，使用80％甲醇溶液复溶并得到样品溶液；再采用液相色谱仪对样品溶液进行检测,并根据生成的标准曲线得到样品溶液被测组分的溶液浓度值c。最后再通过公式各自计算得到样品溶液中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的含量。上述方法中，相对于国家食品药品监督管理总局的补充检验方法(bjs 201705)中，采用高效液相色谱-串联质谱仪只可以同时检测植物油脂中的香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素三种物质，并且仪器采用高效液相色谱-串联质谱仪，一套设备需要投入数百万元，投入过高，一般企业很难具备检测条件，不利于企业作为自我风险防控的方法手段。本方法的优势在于采用常规高效液相色谱仪同时检测芝麻油中的四种香兰素类物质，设备投入低，并且可同步检测，检测效率高，能够降低检测成本，因而便于推广应用。
14.作为优化，步骤a中，包括以下步骤：获取0.1％甲酸甲醇溶液、80％甲醇溶液和磷酸二氢钠溶液备用；
15.准确称取0.02g(精确至0.1mg)香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的标准物质，分别用0.1％甲酸甲醇溶液溶于10ml棕色容量瓶中，定容至刻度,配置成浓度为
2000mg/l的标准系列储备液，0℃～4℃避光保存，得到标准物质储备液；
16.分别准确移取1ml的浓度为2000mg/l的4种标准储备液于10ml容量瓶中，使用0.1％甲酸甲醇溶液定容，配置成浓度为200mg/l的混合标准中间液；
17.分别准确吸取一定体积的混合标准中间液，使用80％甲醇溶液定容，稀释至浓度为0.2mg/l、1.0mg/l、5.0mg/l、20mg/l、50mg/l的混合标准工作液。
18.这样，通过上述的步骤制备得到混合标准工作液，得到的混合标准工作液能够更好的被应用与后续步骤的检测，使得采用液相色谱仪进行检测时，绘制得到的标准曲线更加准确，得到的标准曲线回归方程更加的准确。
19.作为优化，步骤a中，取0.1ml甲酸于100ml容量瓶中，用甲醇定容制备得到0.1％甲酸甲醇溶液；
20.取取0.1ml甲酸于100ml容量瓶中，加入80ml甲醇，用水定容制备得到80％甲醇溶液；
21.称取3.90g磷酸二氢钠，加水溶解并稀释至近1000ml，经磷酸调节ph至3.0
±
0.1，定容至1000ml，经微孔滤膜过滤得到磷酸二氢钠溶液。
22.这样，通过上述步骤方法各自制备得到0.1％甲酸甲醇溶液、80％甲醇溶液和磷酸二氢钠溶液，更加方便操作。
23.作为优化，步骤b中，称取1g(精确至0.01g)芝麻油作为样品，将样品置于50ml离心管中，涡旋30s，再加入20ml乙腈，涡旋1min，超声提取40min，加入1g氯化钠，涡旋1min，8000r/min4℃冷冻离心10min，吸取上层乙腈溶液于50ml离心管中，加入10ml正己烷去脂，8000r/min4℃离心5min，去除上层正己烷溶液，取10ml下层乙腈溶液，36℃下旋转蒸发至干，加1ml80％甲醇溶液复溶，过0.45μm有机系滤膜得到样品溶液，供液相测定。
24.这样，通过上述的步骤配制得到样品溶液，能够更好的配制得到样品溶液，且使得样品溶液中的香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素能够更好的一并被提取，能够使得后续更好的各自对样品溶液中的香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素完成检测。进一步的，步骤b中还包括同时做空白试验。
25.作为优化，步骤c中，液相色谱条件为，
26.流动相：a相：磷酸二氢钠溶液，b相：甲醇；
27.梯度洗脱：35％b(0min～26min)，100％b(26.1min～30.0min)，后运行三分钟；
28.色谱柱：c18柱，柱长250mm，内径4.6mm，填料粒径5.0μm；
29.流速：1.0ml/min；
30.柱温：30℃；
31.进样体积：10μl；
32.检测波长：279nm。
33.这样，液相色谱条件设置更加的合理，在上述的液相色谱条件下，能够更好的同时满足对香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的检测。
34.作为优化，步骤c中，标准曲线的制作，系列浓度的混合标准工作溶液由低到高浓度依次注入液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以峰面积为纵坐标，以系列混合标准工作液浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程。
35.这样，标准曲线的制作，系列浓度的混合标准工作溶液由低到高浓度依次注入液
相色谱仪中，能够更加有利于液相色谱仪的测定，并且有利于提高测定的准确性。测定相应的峰面积，以峰面积为纵坐标，以系列混合标准工作液浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程。
36.作为优化，根据液相色谱仪图谱信噪比s/n 3：1时，评价液相色谱仪的检出限，香兰素为0.10mg/kg；甲基香兰素为0.60mg/kg；乙基香兰素为0.20mg/kg；香豆素为0.25mg/kg。
37.这样，得到的检出限更加合理，能够更好的降低误差和偶然性。
38.综上所述，上述方法中，相对于国家食品药品监督管理总局的补充检验方法(bjs 201705)中，采用高效液相色谱-串联质谱仪只可以同时检测植物油脂中的香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素三种物质，并且仪器采用高效液相色谱-串联质谱仪，一套设备需要投入数百万元，投入过高，一般企业很难具备检测条件，不利于企业作为自我风险防控的方法手段。本方法的优势在于采用常规高效液相色谱仪同时检测芝麻油中的四种香兰素类物质，设备投入低，并且可同步检测，检测效率高，能够降低检测成本，因而便于推广应用。
附图说明
39.图1是本发明具体实施方式中的香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素浓度为20mg/l混标色谱图。
40.图2是本发明具体实施方式中的香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的样品加标色谱图。
具体实施方式
41.下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
42.如图1和图2所示，一种液相色谱同时测定芝麻油中四种香精的方法，其特征在于，包括以下步骤，a、配制香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的混合标准工作溶液；b、芝麻油样品用乙腈提取，经正己烷去脂，旋转蒸发浓缩样品，使用80％甲醇溶液复溶并得到样品溶液；c、采用液相色谱仪依次对a步骤中得到的混合标准工作溶液进行测定，并绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程；再采用液相色谱仪对b步骤中得到的样品溶液进行检测,并根据生成的标准曲线得到样品溶液被测组分的溶液浓度值c；d、根据公式计算得到样品溶液中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的含量，式中，x为样品中被测组分的含量，单位为mg/kg；c为溶液浓度,单位为mg/l，v为乙腈体积，单位为ml，m为样品质量，单位为g；10为样品浓缩倍数。
43.这样，上述的液相色谱同时测定芝麻油中四种香精的方法中，通过配制香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的混合标准工作溶液，并采用液相色谱仪依次对配制得到的香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的混合标准工作溶液进行测定，根据测定得到信息绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程。并且配制得到样品溶液时，芝麻油样品用乙腈提取，经正己烷去脂，旋转蒸发浓缩样品，使用80％甲醇溶液复溶并得到样品溶液；再采用液相色谱仪对样品溶液进行检测,并根据生成的标准曲线得到样品溶液被测组分的溶液浓
度值c。最后再通过公式各自计算得到样品溶液中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的含量。上述方法中，相对于国家食品药品监督管理总局的补充检验方法(bjs 201705)中，采用高效液相色谱-串联质谱仪只可以同时检测植物油脂中的香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素三种物质，并且仪器采用高效液相色谱-串联质谱仪，一套设备需要投入数百万元，投入过高，一般企业很难具备检测条件，不利于企业作为自我风险防控的方法手段。本方法的优势在于采用常规高效液相色谱仪同时检测芝麻油中的四种香兰素类物质，设备投入低，并且可同步检测，检测效率高，能够降低检测成本，因而便于推广应用。
44.本具体实施方式中，步骤a中，包括以下步骤：获取0.1％甲酸甲醇溶液、80％甲醇溶液和磷酸二氢钠溶液备用；
45.准确称取0.02g(精确至0.1mg)香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的标准物质，分别用0.1％甲酸甲醇溶液溶于10ml棕色容量瓶中，定容至刻度,配置成浓度为2000mg/l的标准系列储备液，0℃～4℃避光保存得到标准物质储备液；
46.分别准确移取1ml的浓度为2000mg/l的4种标准储备液于10ml容量瓶中，使用0.1％甲酸甲醇溶液定容，配置成浓度为200mg/l的混合标准中间液；
47.分别准确吸取一定体积的混合标准中间液，使用80％甲醇溶液定容，稀释至浓度为0.2mg/l、1.0mg/l、5.0mg/l、20mg/l、50mg/l的混合标准工作液。
48.这样，通过上述的步骤制备得到混合标准工作液，得到的混合标准工作液能够更好的被应用与后续步骤的检测，使得采用液相色谱仪进行检测时，绘制得到的标准曲线更加准确，得到的标准曲线回归方程更加的准确。
49.本具体实施方式中，步骤a中，取0.1ml甲酸于100ml容量瓶中，用甲醇定容制备得到0.1％甲酸甲醇溶液；
50.取取0.1ml甲酸于100ml容量瓶中，加入80ml甲醇，用水定容制备得到80％甲醇溶液；
51.称取3.90g磷酸二氢钠，加水溶解并稀释至近1000ml，经磷酸调节ph至3.0
±
0.1，定容至1000ml，经微孔滤膜过滤得到磷酸二氢钠溶液。
52.这样，通过上述步骤方法各自制备得到0.1％甲酸甲醇溶液、80％甲醇溶液和磷酸二氢钠溶液，更加方便操作。
53.本具体实施方式中，步骤b中，称取1g(精确至0.01g)芝麻油作为样品，将样品置于50ml离心管中，涡旋30s，再加入20ml乙腈，涡旋1min，超声提取40min，加入1g氯化钠，涡旋1min，8000r/min4℃冷冻离心10min，吸取上层乙腈溶液于50ml离心管中，加入10ml正己烷去脂，8000r/min4℃离心5min，去除上层正己烷溶液，取10ml下层乙腈溶液，36℃下旋转蒸发至干，加1ml80％甲醇溶液复溶，过0.45μm有机系滤膜得到样品溶液，供液相测定。
54.这样，通过上述的步骤配制得到样品溶液，能够更好的配制得到样品溶液，且使得样品溶液中的香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素能够更好的一并被提取，能够使得后续更好的各自对样品溶液中的香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素完成检测。进一步的，步骤b中还包括同时做空白试验。
55.本具体实施方式中，步骤c中，液相色谱条件为，
56.流动相：a相：磷酸二氢钠溶液，b相：甲醇；
57.梯度洗脱：35％b(0min～26min)，100％b(26.1min～30.0min)，后运行三分钟；
58.色谱柱：c18柱，柱长250mm，内径4.6mm，填料粒径5.0μm；
59.流速：1.0ml/min；
60.柱温：30℃；
61.进样体积：10μl；
62.检测波长：279nm。
63.这样，液相色谱条件设置更加的合理，在上述的液相色谱条件下，能够更好的同时满足对香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的检测。
64.本具体实施方式中，步骤c中，标准曲线的制作，系列浓度的混合标准工作溶液由低到高浓度依次注入液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以峰面积为纵坐标，以系列混合标准工作液浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程。
65.这样，标准曲线的制作，系列浓度的混合标准工作溶液由低到高浓度依次注入液相色谱仪中，能够更加有利于液相色谱仪的测定，并且有利于提高测定的准确性。测定相应的峰面积，以峰面积为纵坐标，以系列混合标准工作液浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程。
66.本具体实施方式中，根据液相色谱仪图谱信噪比s/n 3：1时，评价液相色谱仪的检出限，香兰素为0.10mg/kg；甲基香兰素为0.60mg/kg；乙基香兰素为0.20mg/kg；香豆素为0.25mg/kg。
67.这样，得到的检出限更加合理，能够更好的降低误差和偶然性。
68.综上所述，上述方法中，相对于国家食品药品监督管理总局的补充检验方法(bjs 201705)中，采用高效液相色谱-串联质谱仪只可以同时检测植物油脂中的香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素三种物质，并且仪器采用高效液相色谱-串联质谱仪，一套设备需要投入数百万元，投入过高，一般企业很难具备检测条件，不利于企业作为自我风险防控的方法手段。本方法的优势在于采用常规高效液相色谱仪同时检测芝麻油中的四种香兰素类物质，设备投入低，并且可同步检测，检测效率高，能够降低检测成本，因而便于推广应用。
69.上述的方法验证如下：
70.准确度，选取芝麻油样品进行1.0mg/kg、5.0mg/kg、20.0mg/kg三个浓度的加标测定回收率，添加浓度的回收率90.0％-103.1％，具体结果见下表：
[0071][0072]
精密度，选取芝麻油样品进行1.0mg/kg、5.0mg/kg、20.0mg/kg三个浓度水平的加标回收试验，平行测定7次(自由度n＝6)，测定结果的相对标准偏差rsd％，结果见下表：
[0073][0074]
检出限，根据液相色谱仪图谱信噪比s/n 3：1时，评价检出限，见下表：
[0075]
化合物名称检出限mg/kg香兰素0.10甲基香兰素0.60乙基香兰素0.20香豆素0.25
[0076]
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。