基于NY-ESO-1肿瘤抗原的疫苗及制备方法与流程

基于ny-eso-1肿瘤抗原的疫苗及制备方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及基于ny-eso-1肿瘤抗原的疫苗及制备方法。


背景技术：

2.肿瘤抗原是肿瘤发生发展过程中新出现或过度表达的抗原物质，肿瘤抗原包括肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原。机体产生肿瘤抗原的可能机制主要有：基因突变；胚胎时期抗原或分化抗原的异常、异位表达；细胞原本不表达的基因被激活；外源性基因如病毒基因表达等。纽约食管鳞状上皮癌抗原1(ny-eso-1)是肿瘤-睾丸抗原(cta)亚家族之一，ny-eso-1在细胞内经加工产生抗原肽，与白细胞抗原(hla)分子结合形成复合物，经cd4 t淋巴细胞及细胞毒性t淋巴细胞(ctl)识别，可诱导机体产生针对相应肿瘤细胞的较强的特异性免疫应答(国际检验医学杂志.36(21),3138-3141,2015)。
3.内含肽是其宿主蛋白质自切除并催化侧翼序列通过肽键连接的内部蛋白质元件。断裂内含肽在蛋白质内含子中间特定位点发生断裂形成n端片段和c端片段，分别由两个相距较远的两个基因编码，两个片段通过非共价键相互识别，重建催化活性中心，介导蛋白质反式剪接(中国生物化学与分子生物学报.24(6),512-521,2008)。断裂内含肽gp41-1是文献报导中剪接最稳定和最快速的(j biol chem.287,28686-28696,2012)。wang han等利用断裂内含肽gp41-1成功将一个低温酵母株的dna结合域(dbd)与合成vp64激活域偶联，构建成基于gal4的双向表达系统(pnas.115(15),3900-3905,2018)。yao zhong等利用断裂内含肽gp41-1开发了断裂内含肽介导的蛋白质连接(sinpl)的活细胞方法，可应用于哺乳动物细胞系(nature communications.11:2440,2020)。
4.1g11是由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司自研发的pd-l1抗体。pd-l1抗体近年来广泛应用于多种肿瘤免疫治疗，已在众多临床试验中被证实是一种广谱、有效、作用持久且相对安全的抗肿瘤治疗方式。通过阻断pd-1通路能够增强t细胞介导的免疫反应，同时恢复肿瘤微环境中发生“功能耗竭“的效应t细胞及降低调节t细胞的数目和功能(中国临床医学.25(4),625-631,2018)。
5.随着免疫治疗领域的发展，ny-eso-1过继性t细胞疗法、联合检查点抑制剂治疗等方法的局限性突显，我们需要改进方法，探索新策略以解决这些问题。


技术实现要素：

6.为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供基于ny-eso-1肿瘤抗原的疫苗及制备方法。
7.为实现上述目的，达到上述技术效果，本发明采用的技术方案为：
8.基于ny-eso-1肿瘤抗原的疫苗，所述疫苗通过断裂内含肽反式剪接将抗原与抗体结合得到。
9.进一步的，所述疫苗为抗体偶联蛋白1g11-ny-eso-1，重链氨基酸序列如seq id no:10所示。
10.进一步的，所述疫苗的抗原为ny-eso-1，所述疫苗的抗体为pd-l1抗体1g11。
11.进一步的，所述断裂内含肽为gp41-1。
12.基于ny-eso-1肿瘤抗原的疫苗的制备方法，包括以下步骤：
13.步骤1)、将抗体1g11与gp41-1-inteinn融合表达制备融合蛋白1g11-intn；
14.步骤2)、将抗原ny-eso-1与gb1-gp41-1-inteinc融合表达制备融合蛋白gb1-intc-ny-eso-1；
15.步骤3)将融合蛋白1g11-intn与融合蛋白gb1-intc-ny-eso-1混合，通过断裂内含肽反式剪接反应，生成抗体偶联蛋白1g11-ny-eso-1，蛋白重链氨基酸序列如seq id no:10所示，轻链氨基酸序列如seq id no:6所示，轻链不参与反应；
16.步骤1)与步骤2)无先后顺序。
17.进一步的，步骤1)中，制备融合蛋白1g11-intn的步骤包括：
18.步骤11)、融合蛋白1g11-intn重链表达载体构建
19.以puc57-kan-gp41in为模板，设计碱基序列如seq id no:3所示的fc-intn-f引物和碱基序列如seq id no:4所示的fc-intn-r引物，通过pcr扩增fc-intn基因片段，然后凝胶回收相应片段，克隆至phigg1-1g11载体上的多克隆位点bamh i与hindⅲ之间，构建成可表达融合蛋白1g11-intn的重链表达载体phigg1-1g11-intn；
20.步骤12)、融合蛋白1g11-intn制备
21.将步骤11)中构建的融合蛋白1g11-intn重链表达载体与1g11轻链表达载体phigk-1g11以一定的质量比共同转染293t细胞，表达1g11-intn蛋白，蛋白重链氨基酸序列如seq id no:5所示，轻链氨基酸序列如seq id no:6所示。
22.进一步的，步骤11)中，pcr扩增程序为：98℃10min，98℃40s，56℃30s，72℃1min，72℃10min，10℃10min，pcr产物跑1％琼脂糖凝胶电泳。
23.进一步的，步骤2)中，制备融合蛋白gb1-intc-ny-eso-1的步骤包括：
24.步骤21)、融合蛋白gb1-intc-ny-eso-1表达载体构建
25.通过使用bamh i和ndei双酶切质粒puc57-kan-gb1-gp41ic和pet-30a( )-ny-eso-1，分别得到gb1-intc片段和线性化载体pet-30a( )-ny-eso-1，然后使用t4连接酶构建成融合蛋白gb1-intc-ny-eso-1表达载体pet-30a( )-gb1-intc-ny-eso-1；
26.步骤22)、融合蛋白gb1-intc-ny-eso-1制备
27.将步骤21)中构建的融合蛋白gb1-intc-ny-eso-1表达载体pet-30a( )-gb1-intc-ny-eso-1转化至bl21(de3)感受态细胞，根据pet系统手册制备融合蛋白gb1-intc-ny-eso-1，蛋白氨基酸序列如seq id no:9所示；使用histrap
tm hp纯化目的蛋白。
28.进一步的，步骤3)中，将融合蛋白1g11-intn和融合蛋白gb1-intc-ny-eso-1以不同摩尔比混合，加入dtt，诱导催化断裂内含肽gp41-1反式剪接反应，剪接反应后，intn剩余trsgy五个氨基酸残基与intc的五个氨基酸残基sssdv以肽键连接，制备得到所需肿瘤疫苗1g11-ny-eso-1蛋白。
29.进一步的，所述融合蛋白1g11-intn和融合蛋白gb1-intc-ny-eso-1的摩尔比为1:0.3-3。
30.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
31.本发明公开了基于ny-eso-1肿瘤抗原的疫苗及制备方法，该疫苗通过断裂内含肽
反式剪接将抗原与抗体结合得到。本发明中，肿瘤抗原为ny-eso-1，具有较强的免疫原性，可广泛应用于肿瘤疫苗及肿瘤免疫治疗，ny-eso-1抗原通过断裂内含肽gp41-1反式剪接，与pd-l1抗体1g11结合，形成抗体偶联蛋白1g11-ny-eso-1，能够作为一种新型的肿瘤疫苗，区别于现有化学偶联结合方法，克服了利用化学偶联方法等实现抗原抗体连接时需要加入化学试剂、有一定毒性、偶联键易断裂、化学偶联不稳定等技术问题，本发明利用断裂内含肽gp41-1反式剪接方法的连接是通过肽键连接，其稳定性更高，特异性结合更强，反应条件温和，效率高，工艺简单，且未加入有毒有害物质，也不会产生副产物等，安全性高，为新型肿瘤疫苗的研发提供技术支撑和新思路。
附图说明
32.图1为本发明的融合蛋白1g11-intn的重链表达载体phigg1-1g11-intn的质粒图谱；
33.图2为本发明的融合蛋白1g11-intn的sds-page考染鉴定图；
34.图3为本发明的融合蛋白gb1-intc-ny-eso-1的表达载体pet-30a( )-gb1-intc-ny-eso-1的质粒图谱；
35.图4为本发明的融合蛋白gb1-intc-ny-eso-1的sds-page考染鉴定图；
36.图5为本发明的断裂内含肽反式剪接制备抗体偶联蛋白1g11-ny-eso-1的sds-page考染鉴定图。
具体实施方式
37.下面对本发明进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
38.以下给出一个或多个方面的简要概述以提供对这些方面的基本理解。此概述不是所有构想到的方面的详尽综览，并且既非旨在指认出所有方面的关键性或决定性要素亦非试图界定任何或所有方面的范围。其唯一的目的是要以简化形式给出一个或多个方面的一些概念以为稍后给出的更加详细的描述之序。
39.一方面，本发明公开了基于ny-eso-1肿瘤抗原的疫苗，通过断裂内含肽gp41-1反式剪接将抗原与抗体结合，生成抗体偶联蛋白1g11-ny-eso-1，作为一种新型的肿瘤疫苗，其抗原是ny-eso-1，其抗体为苏州工业园区唯可达生物科技有限公司自主研发的pd-l1抗体1g11，pd-l1配体与受体pd-1结合会阻止t细胞杀灭肿瘤细胞，造成肿瘤细胞免疫逃逸，当pd-l1配体被其抗体1g11拮抗后，t细胞被重新激活，有助于杀伤肿瘤细胞，pd-l1抗体1g11有利于将肿瘤抗原靶向肿瘤细胞，t细胞识别肿瘤抗原后杀伤肿瘤细胞，提高肿瘤疫苗的药效。
40.另一方面，本发明还公开了基于ny-eso-1肿瘤抗原的疫苗的制备方法，将抗体1g11与gp41-1-inteinn(c端外显肽)融合表达制备融合蛋白1g11-intn，将抗原ny-eso-1与gb1-gp41-1-inteinc(c端外显肽)融合表达制备融合蛋白gb1-intc-ny-eso-1，gb1是常见蛋白助溶标签，完成剪接反应后会与intc一起被切掉；随后，将融合蛋白gb1-intc-ny-eso-1与融合蛋白1g11-intn混合，通过断裂内含肽gp41-1反式剪接反应，生成抗体偶联蛋白1g11-ny-eso-1(蛋白重链氨基酸序列如seq id no:10所示，轻链氨基酸序列如seq id no:
intn蛋白加20微升5
×
sds-page上样缓冲液(由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供)，沸水浴10min制样，sds-page，考染，鉴定蛋白。sds-page的方法为本领域技术人员人员熟知，简述如下：按照蛋白标记(thermo，货号26616)、1g11-intn蛋白的顺序依次点样，电泳80v、30min后再调电压至120v至指示剂到底，用考马斯亮蓝染色液(由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供)室温染色1h后，沸水浴30min脱色，结果如图2所示。
55.实施例3
56.融合蛋白gb1-intc-ny-eso-1表达载体构建
57.gb1-gp41-1-inteinc多肽段的氨基酸序列(seq id no:7)的大肠杆菌密码子优化碱基序列(seq id no:8)从质粒puc57-kan-gb1-gp41ic(由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供)上获得。通过使用bamh i(宝生物工程(大连)有限公司，货号1010a)和ndei(宝生物工程(大连)有限公司，货号1161a)双酶切质粒puc57-kan-gb1-gp41ic和pet-30a( )-ny-eso-1(由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供)，分别得到gb1-intc片段和线性化载体pet-30a( )-ny-eso-1，然后使用t4连接酶(宝生物工程(大连)有限公司，货号2050a)，用本领域熟知的t4连接方法构建成融合蛋白gb1-intc-ny-eso-1表达载体pet-30a( )-gb1-intc-ny-eso-1，其质粒图谱如图3所示，经测序鉴定正确后入库。
58.实施例4
59.融合蛋白gb1-intc-ny-eso-1制备
60.将实施例3中构建的融合蛋白gb1-intc-ny-eso-1表达载体pet-30a( )-gb1-intc-ny-eso-1转化至bl21(de3)感受态细胞(康为世纪，cw0809s)中，转化方法可参见感受态细胞说明书。根据《pet系统手册》(tb055 8th edition02/99，novagen)制备融合蛋白gb1-intc-ny-eso-1(蛋白氨基酸序列如seq id no:9所示)。
61.具体方法如下：
62.转化bl21(de3)感受态细胞后，涂卡那霉素抗性板，挑单克隆至1毫升lb液体培养基(由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供)中，37℃，200rpm，培养8h，保甘油菌。取10微升甘油菌接至5毫升lb液体培养基中，37℃，200rpm，过夜培养。再将5毫升菌液扩大培养至500毫升lb液体培养基中，37℃，200rpm，培养2-3h，菌液od600到0.8h左右，加终浓度1毫摩每升的iptg(solarbio，货号i8070)诱导表达，诱导条件：25℃，180rpm，诱导20h。诱导后10000g离心5min收集菌体，使用60毫升包涵体洗涤缓冲液(由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供)重悬，加终浓度100微克每毫升的溶菌酶(sigma-aldrich，货号l6876)30℃孵育15min，然后在冰上用超声波细胞粉粹机超声，超声条件为：400瓦，5秒超声/5秒间隔，共30min，超声结果为菌液不粘稠。细胞裂解后10000g离心10min，收集包涵体。去上清，用100毫升包涵体洗涤缓冲液重悬洗涤包涵体沉淀，重复洗涤包涵体至少3次，直至包涵体清洗干净。加50毫升包涵体溶解缓冲液(由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供)溶解包涵体，在磁力搅拌器上室温溶解2-3h，包涵体基本完全溶解。20000g，4℃离心30min，弃沉淀，上清用0.22微米过滤后使用脱盐柱(ge healthcare，17-5087-01)脱盐，脱盐方法可参见脱盐柱说明书。置换为脱盐缓冲液(由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供)后，使用histrap
tm hp(ge healthcare，17-5248-01)纯化目的蛋白，纯化方法可参见纯化柱说明书。经bca法(碧云天生物技术研究所，货号p0009)检测所制备的重组蛋白浓度，检测方法参看检测试剂盒说明书。所制蛋白分装后，-80℃保存。取80微升gb1-intc-ny-eso-1蛋白
加20微升5
×
sds-page上样缓冲液(由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供)，沸水浴10min制样，sds-page，考染，鉴定蛋白。sds-page的方法为本领域技术人员熟知，简述如下：按照蛋白标记(thermo，货号26616)、gb1-intc-ny-eso-1蛋白的顺序依次点样，电泳80v、30min后再调电压至120v至指示剂到底，用考马斯亮蓝染色液(由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供)室温染色1h后，沸水浴30min脱色，结果如图4所示。
63.包涵体洗涤缓冲液：20mm tris-hcl ph 7.5，10mm edta，1％triton x-100。
64.包涵体溶解缓冲液：20mm tris-hcl ph 8.5，6m盐酸胍。
65.脱盐缓冲液：20mm tris-hcl ph 8.5，150mm氯化钠。
66.实施例5
67.肿瘤疫苗1g11-ny-eso-1制备
68.将实施例2中制备的融合蛋白1g11-intn和实施例3中制备的融合蛋白gb1-intc-ny-eso-1以不同摩尔比(1g11-intn：gb1-intc-ny-eso-1的摩尔比分别是3:1、1.5:1、1:1、1:1.5和1:3)混合，加终浓度10微摩每升的dtt(solarbio，d8220-25g)诱导催化断裂内含肽gp41-1反式剪接反应，剪接反应后，intn剩余trsgy五个氨基酸残基与intc的五个氨基酸残基sssdv以肽键连接，制备得到肿瘤疫苗1g11-ny-eso-1蛋白(蛋白重链氨基酸序列见seq id no:10和轻链氨基酸序列见seq id no:6，轻链不参与反应)。
69.反应缓冲液：ph值8.5，20毫摩每升tris盐酸，含150毫摩每升氯化钠(由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供)；反应条件：37℃反应2h。取80微升反应后产物加20微升5
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sds-page上样缓冲液(由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供)，沸水浴10min制样，sds-page，考染，鉴定蛋白。sds-page的方法为本领域人员熟知，简述如下：按照蛋白标记(thermo，货号26616)、1g11-intn蛋白、gb1-intc-ny-eso-1蛋白、1g11-intn：gb1-intc-ny-eso-1的摩尔比分别是3:1、1.5:1、1:1、1:1.5和1:3的顺序依次点样，电泳80v、30min后再调电压至120v至指示剂到底，用考马斯亮蓝染色液(由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供)室温染色1h后，沸水浴30min脱色，结果如图5所示，确定1g11-intn：gb1-intc-ny-eso-1的最佳摩尔比为1:1.5。
70.本发明未具体描述的部分或结构采用现有技术或现有产品即可，在此不做赘述。
71.以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。