黄芩素作为GLP-1R蛋白激动剂对认知功能障碍治疗的应用

黄芩素作为glp-1r蛋白激动剂对认知功能障碍治疗的应用
技术领域
1.本发明属于认知功能障碍药物的制备技术领域，具体涉及黄芩素作为glp
‑ꢀ
1r蛋白激动剂对认知功能障碍的治疗。


背景技术：

2.认知功能障碍是一种由于大脑学习记忆以及思维判断功能出现异常，从而 引发的一系列病理现象，是衰老和多种病理疾病进程中常见的疾病状态。随着 疾病的进展，以阿尔兹海默症为代表的认知功能障碍严重损害人类的记忆功能， 降低人们的生活技能，损害人类的生活质量。
3.心脑血管疾病、癌症、慢性呼吸系统疾病、内分泌疾病是严重威胁人类健 康的四大公共问题。其中，糖尿病以其发病缓慢、病程长、并发症多成为不容 忽视的疾病问题，ii型糖尿病(t2dm)占糖尿病总人数的90％以上，其主要的 发病机制为胰岛素抵抗导致的胰岛素分泌相对不足，而当疾病进展到终末期时 出现胰岛β细胞受损，胰岛素分泌绝对不足。糖尿病作为一种代谢综合征，其 对机体的损害体现在多种层面，其并发症包括糖尿病脑病、糖尿病足、糖尿病 肾病、糖尿病眼病、非酒精性脂肪肝等。近年来已有研究报道t2dm可以显著 增加阿尔兹海默症的患病风险，而与t2dm认知功能障碍相关的危险因子包括 代谢、炎症、激素、环境、遗传等。认知功能障碍由于其病因复杂、病程隐匿， 患者就诊是往往已处于疾病的中后期，因而尽早发现、诊断及治疗原发病，是 一项重要的治疗策略。
4.胰高血糖素样肽-1(glucagon like peptide-1,glp-1)是一种由肠道l细胞 分泌的肽类激素，其通过与机体内广泛分布的glp-1受体(glucagon like peptide
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1receptor,glp-1r)结合发挥广泛的生物学效应。其效应包括保护胰岛β细胞， 促进其增殖分化，抑制凋亡；减轻体重；抑制胃肠蠕动和胃液分泌，延缓胃排 空；增加葡萄糖依赖的胰岛素分泌；改善肝脏胰岛素抵抗等。现有的肽类glp
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1r激动剂通过对内源性glp-1的结构修饰，在保持生物活性的同时降低水解， 延长半衰期。而肽类glp-1r激动剂的价格昂贵，除索马鲁肽外都通过注射给 药，使用局限，且胃肠道不良反应重，大大限制了其临床应用。
5.研究表明，glp-1r的激活是引发其下游信号通路的有效途径。小分子glp
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1r激动药以其分子量小、可口服给药、可穿越血脑屏障的特性，具备极大的开 发潜能和临床价值。目前，对glp-1r的小分子激动药的研究多为人工合成的 化学成分，其研发成本高昂且安全性未知，因而药品研发周期较长。
6.黄芩(scutellaria baicalensis georgi)是唇形科黄芩属多年生草本植物，主 要产于我国北方地区，其根部入药、味苦、性寒，具有止血、泻火解毒、清热 燥湿的功能。在治疗上呼吸道感染、热病、湿热黄疸、肺炎等病症中发挥重要 作用。此外，黄芩具有保肝、抗病毒、抗菌、心血管保护、抗肿瘤、抗氧化等 作用。从黄芩中提取的中药活性成分黄芩素具有降低脑血管阻力，改善脑血循 环、增加脑血流量及抗血小板凝集的作用。
7.然而，黄芩素作为一种glp-1r激动药改善认知功能的研究仍为空白。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供黄芩素作为glp-1r蛋白激动剂改善认知功能，明 确黄芩素可以通过与glp-1r蛋白特异性结合而发挥改善认知功能的作用。
9.为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
10.本发明公开了黄芩素作为glp-1r蛋白激动剂在制备认知功能障碍的药物 的应用，所述的药物能够与glp-1r蛋白特异性结合。
11.优选地，所述的药物为能够与glp-1r蛋白的ala375位点特异性结合的 药物。
12.优选地，所述的药物为能够与glp-1r蛋白的asn300位点特异性结合的 药物。
13.优选地，所述的药物是以glp-1r蛋白为靶标的药物。
14.优选地，所述的药物为降糖、改善胰岛素抵抗、增强胰岛素敏感性以及改 善认知功能的药物。
15.本发明公开了黄芩素作为glp-1r蛋白激动剂在制备改善认知功能障碍的 药物中的应用，黄芩素能够改善高脂联合stz腹腔注射的t2dm小鼠认知功 能。
16.优选地，所述的药物为保护神经细胞免受高糖损伤的药物。
17.本发明还公开了一种改善认知功能的药物，所述药物是由黄芩素以及药学 上可接受的辅料制成的制剂。
18.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
19.本发明公开了黄芩素在制备认知功能改善药物中的功效，通过sio
2-glp
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1r/cmc模型分析，确定了黄芩素与glp-1r的结合特异性；利用分子对接技 术，明确了黄芩素与glp-1r的结合位点；测定黄芩素对高糖损伤的小鼠海马 神经元细胞的保护作用，证实黄芩素对神经细胞损伤的保护作用；采用morrior 水迷宫实验，明确了黄芩素灌胃处理可显著改善高脂联合stz腹腔注射的雄性 c57小鼠的认知功能，可明显缩短小鼠在空间探索实验中的逃避潜伏期和增加 在定位航行实验中的穿越平台次数。以上研究充分明确了黄芩素具备改善认知 功能的功效，能够用于认知功能障碍的药物治疗。
附图说明
20.图1为黄芩素与glp-1r蛋白分子结合的对接结果；其中，(a)、(b)分别 为用cartoon模式显示的分子对接结果的整体和局部结果，(c)、(d)分别为用 surface模式显示的整体和局部对接结果；
21.图2为小鼠的空间探索实验和定位航行实验结果；其中，(a)为空间探索 实验结果；(b)为定位航行实验结果；(c)为各组小鼠的定位航行实验的典型 轨迹图。
具体实施方式
22.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施 例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所 描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发 明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所 有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
23.需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、
ꢀ“
第
二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应 该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施 例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和
ꢀ“
具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系 列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步 骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备 固有的其它步骤或单元。
24.下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
25.本发明涉及的实验材料如下：
26.黄芩素分子为c
15h10
o5，cas号为491-67-8，购买自成都普菲德生物技术 有限公司；结构式如下：
[0027][0028]
glp-1r高表达细胞是将含人全长基因序列的慢病毒质粒载体转染 hek293细胞，并通过嘌呤霉素进行为期14天的抗性筛选，最终获得。
[0029]
ht22细胞购买自atcc上海细胞库；
[0030]
雄性c57小鼠购于西安交通大学实验动物中心。
[0031]
实施例1、黄芩素与glp-1r蛋白特异性结合
[0032]
cmc是一种亲和色谱，通过将特定受体过表达细胞膜制备成固定相，在仿 生条件下实现高通量筛选与膜受体特异性结合的组分，是筛选复杂成分中的有 效成分的可靠手段。构建glp-1r高表达细胞，制备细胞膜，与活化的硅胶吸 附制备细胞膜色谱固定相，采用湿法装柱后得到sio
2-glp-1r/cmc色谱柱，进 行hplc检测。sio
2-nc-hek293/cmc为蛋白特异性结合的cmc对照。结果 如下表1所示：
[0033]
表1黄芩素在glp-1r蛋白高表达细胞膜色谱上的保留时间
[0034][0035]
可以看出，黄芩素在glp-1r高表达细胞膜色谱柱上有保留，在空白对照 的色谱柱上无保留。上述结果表明，黄芩素与glp-1r蛋白有良好的特异性结 合作用。
[0036]
实施例2、黄芩素与glp-1r的蛋白结合位点考察
[0037]
分子对接研究使用autodock vina软件进行。输入蛋白质x射线晶体结构 (pdb代码：5vai)。蛋白结构去除水分子并添加氢原子，并利用tripos力场 和pullman电荷进行能量最低处理。采用chemdraw 19.0版本绘制黄芩素结构， 并用chemdraw 3d软件对结构进行优化。用autodock软件对配体结构进行优 化，将配体残基中的电荷进行分散，判定配体的root并对其中可扭转的键进行 选择。在linux终端下运行autodock软件，依次加载优化后
的蛋白和能量优化 后的黄芩素，通过autogrid计算格点能量，采用拉马克遗传算法，通过自由能 方法评价配体与受体的接合情况，用pymol对分子对接的结果进行可视化处理， 用不同模式展示分子对接的结果。
[0038]
结果如下表2所示：
[0039]
表2黄芩素与glp-1r蛋白分子对接结果
[0040][0041]
可以看出，黄芩素与glp-1r蛋白有2个氢键结合位点，分别为ala375 和asn300。用pymol打开分子对接结果，对其进行可视化处理，图1为黄芩 素与glp-1r的对接结果。结果显示，黄芩素能够与glp-1r蛋白分子的活性 位点形成两个分子间氢键，且其结合部位位于glp-1r蛋白的细胞外结构域， 结合能较大。(a)、(b)为用cartoon模式显示的分子对接结果的整体和局部结 果，(c)、(d)为用surface模式显示的整体和局部对接结果。可以看出，(a)图 提示黄芩素通过与glp-1r的细胞外结构域结合，(b)图提示黄芩素可与glp
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1r蛋白形成两个分子间氢键，结合力较强；(c)、(d)图提示黄芩素与glp-1r 蛋白结合位点在蛋白的内部，结合能量较大。
[0042]
实施例3、黄芩素对高糖及h2o2损伤的小鼠海马神经元细胞的保护作用 ht22细胞以3
×
103密度接种于96孔板，每孔补齐培养基至100μl。37℃， 5％co2培养箱中培养24小时贴壁。吸弃培养基，每孔加入含125mm葡萄糖 的无血清培养基90μl，实验孔分别加入用培养基配制的不同浓度的黄芩素 10μl，对照孔加入10μl培养基，在37℃继续培养48h。48h后向培养基中加 入5mg/ml的mtt溶液10μl，在37℃条件下孵育4h，吸弃培养基，向其中 加入100μl dmso溶液，置于摇床上震荡15min，置于酶标仪490nm波长处 测定溶液的吸光度，并计算黄芩素对细胞存活率的影响。或吸弃各培养组细胞 的培养基，用预热的有糖ereas液清洗细胞两次，换上终浓度为10μmol/l的 dcfh-da探针37℃孵育30min，孵育结束后，用有糖ereas液清洗细胞两次， 用fluostation在504nm激发波长和529nm发射波长下测定各组的荧光强度。
[0043][0044]
结果如表3所示：
[0045]
表3黄芩素对高糖损伤ht22细胞存活率的影响
[0046][0047]
可以看出，黄芩素对高糖损伤ht22细胞具有保护作用且呈现剂量依赖性， 此外其
保护作用与其降低细胞内活性氧水平相关。
[0048]
实施例4、黄芩素对t2dm小鼠基础指标的影响
[0049]
雄性c57小鼠购于西安交通大学动物实验中心，适应性喂养一周，待体重 达到20
±
2g，对照组小鼠给予普通饲料喂养，实验组给予高脂饲料(60％脂肪、 20％蛋白质、20％碳水化合物)喂养，喂养8周后，开始造模。对所有组小鼠禁 食不禁水12h后，对照组采用腹腔注射柠檬酸钠缓冲液，实验组小鼠腹腔注射 小剂量stz(60mg/kg/day)，连续注射3天。注射完3天后，对所有组小鼠禁食 不禁水6h，尾静脉采血测定各组小鼠的空腹血糖(fbg),血糖值大于 16.7mmol/l视为造模成功。将造模成功的小鼠随机分为4组，模型组、黄芩素 低、中、高剂量组，各组小鼠数量均为8只，对照组小鼠为20只。给黄芩素处 理组小鼠每天同一时间灌胃不同剂量的黄芩素，剂量分别为50、100和200 mg/kg/day，对照组和模型组小鼠灌胃等剂量的0.5％cmc-na，灌胃第5周，开 展葡萄糖耐量实验，第6周末测定各组小鼠的fbg和体重，将小鼠眼眶取血后 处死，测定血清胰岛素含量。结果如下表4所示：
[0050]
表4黄芩素对t2dm小鼠基础代谢指标的影响
[0051][0052]
从表中可以看出，黄芩素对高脂联合stz腹腔注射的t2dm模型小鼠的体 重无明显影响，但其给药处理可以改善小鼠的空腹血糖，此外黄芩素给药可增 加t2dm小鼠的血清胰岛素。结果表明，黄芩素可从整体水平上改善代谢综合 征的症状。
[0053]
实施例5、黄芩素对t2dm小鼠空间学习和记忆能力的影响
[0054]
黄芩素灌胃第5周，开展morris水迷宫实验，morris水迷宫是行为神经学 研究中常用脑学习记忆机制常用的实验手段。水迷宫分析系统由硬件和软件两 部分组成，其硬件系统包含一个圆形恒温水池，水池直径为2.14m，高为0.4m， 此外还包含一个直径为10cm的圆形平台，位于水池中间，水池中水温恒定在 21-22℃，对各组小鼠开展定位航行实验和空间探索实验。
[0055]
定位航行实验耗时6天，第一天为适应期。将圆形平台置于水面下2cm。 每天每只小鼠分别在四个象限各游一次，每次测试的时间为90s，测试时均将 小鼠面朝池壁放入水池中，在平台上停留超过3s视为成功找到平台，并将小 鼠放入水中至成功上台的时间记为小鼠在该象限的逃避潜伏期；若小鼠在90s 期限内未能找到平台，手动将小鼠引导至平台上停留10s，并将其逃避潜伏期 记为90s。实验间断进行，保证每只小鼠每次游泳至少有30min的间隔时间。
[0056]
空间探索实验历时1天，测试一次，正式实验时移走实验平台。在平台所 在的象限，面朝池壁放入小鼠，自由游泳90s，由水迷宫软件记录小鼠的穿越 平台次数和在有效区域内停留的时间。结果参见图2，图2中(a)图的结果显 示，模型组小鼠穿越平台次数明显低于对照组小鼠，而黄芩素灌胃处理可以显 著增加模型组小鼠的穿越平台次数。图2中(b)图
结果显示，随着游泳时间的 延长，对照组小鼠的逃避潜伏期逐渐缩短，而模型组小鼠的逃避潜伏期未见明 显的缩短，黄芩素各剂量处理组相比于模型组小鼠的逃避潜伏期显著缩短。图 2中(c)为各组小鼠的定位航行实验的典型轨迹图。以上结果表明，t2dm小 鼠表现出空间记忆障碍和学习记忆缺陷，而黄芩素给药处理显著改善小鼠的认 知功能障碍。
[0057]
综上所述，本发明公开了黄芩素在改善认知功能障碍中的应用。通过细胞 膜色谱法考察黄芩素在glp-1r蛋白高表达细胞膜色谱上的保留行为，明确了 黄芩素与glp-1r蛋白的特异亲和作用。通过检测黄芩素对高糖损伤ht22细 胞的保护作用，确定黄芩素对神经系统损伤有明确的保护作用。通过测定黄芩 素对t2dm小鼠的代谢相关指标的影响，确定了黄芩素在机体整体水平上改善 代谢的作用。通过morris水迷宫实验，开展定位航行和空间探索实验，明确了 黄芩素对t2dm认知功能障碍的小鼠认知功能的保护作用。研究结果确定了黄 芩素具有神经系统保护作用，能够用于认知功能障碍治疗药物的制备。
[0058]
综上所述，黄芩素能够与glp-1r蛋白特异性结合，具有良好的改善认知 功能障碍的作用，可用于制备认知功能障碍的药物。
[0059]
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围， 凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入 本发明权利要求书的保护范围之内。