一种提高N-乙酰神经氨酸产量的重组大肠杆菌

一种提高n-乙酰神经氨酸产量的重组大肠杆菌
技术领域
1.本发明涉及一种提高n-乙酰神经氨酸产量的重组大肠杆菌，属于代谢工程和基因工程技术领域。


背景技术：

2.n-乙酰神经氨酸(n-acetylneuraminic acid)广泛存在于自然界中，它具有非常重要的应用价值，在医用和保健方面n-乙酰神经氨酸可用于抗菌排毒，并且它作为抗流感病毒药物扎那米韦的前体可用于研发唾液酸酶抑制剂类抗流感药物，在食品方面，n-乙酰神经氨酸是婴幼儿大脑生长发育的条件性必须营养因子，可促进记忆力和智力发育，添加到食品中也可提高肠道的抗菌能力。
3.大肠杆菌(escherichia coli)是一种被大规模应用于代谢工程改造生产化学品的模式工业微生物，其在医药、化工、农业等方面都具有非常广泛的应用。近年来随着合成生物学的研究发展，大肠杆菌的基因编辑工具多样、操作简单且发展成熟。此外，大肠杆菌具有易于培养、遗传背景清晰、生长迅速、表达量高且遗传操作简便易于代谢工程改造等优点。
4.在底盘细胞的开发与改造中，质粒游离表达外源基因稳定性较差，易增加细胞的代谢负担从而降低目标产物产量与生产效率，难以满足大规模工业化生产，通过将外源基因整合到大肠杆菌基因组中可以实现稳定表达。目前在n-乙酰神经氨酸高产菌株中代谢途径主要是以葡萄糖为底物，以n-乙酰氨基葡萄糖为前体外源表达age酶，易导致代谢流强度不够，因此解除限速步骤中的反馈抑制作用，强化n-乙酰神经氨酸合成途径的代谢流，寻找适合大肠杆菌中n-乙酰神经氨酸生产的外源酶、发酵碳源以及高效的合成途径十分重要。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是提供一种提高n-乙酰神经氨酸产量的重组大肠杆菌菌株及其构建方法。
6.本发明提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌敲除了基因组中的葡萄糖胺转运相关的磷酸转移酶系统相关的基因n-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶naga(gene id:945289)、氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶nagb(gene id:945290)、n-乙酰氨基葡萄糖特异性eiicba组分nage(gene id:945292)、n-乙酰神经氨酸转运载体相关基因n-乙酰神经氨酸裂解酶nana(gene id:947742)、唾液酸转运蛋白nant(gene id:947740)、n-乙酰甘露糖胺-6-磷酸2-差向异构酶nane(gene id:947745)、n-乙酰甘露糖胺激酶nank(gene id:947757)、甘露糖特异性eiiab组分相关基因manxyz((gene id:946334,946332))丙酮酸氧化酶poxb基因(gene id:946132)，并且表达由低等强度组成型启动子调控的内源酶glmm(gene id:947692)、由中等强度组成型启动子调控的glmu(gene id:948246)和葡萄糖胺合酶突变体glmsa，并引入(neisseria meningitidis)来源的n-乙酰神经氨酸合酶nemneub和脑膜炎奈瑟菌(neisseria meningitidis)来源的udp-n-乙酰氨基葡糖-2-差向异构酶neuc。
7.在一种实施方式中，所述组成型启动子调控的内源酶glmm，glmu和葡萄糖胺合酶突变体glmsa和n-乙酰神经氨酸合酶nemneub均在基因组上整合表达。
8.在一种实施方式中，glmm，glmu和葡萄糖胺合酶突变体glmsa的整合位点为大肠杆菌mota基因(gene id:947564)所在位置。
9.在一种实施方式中，所述nemneub整合在δpoxb基因所在位置。
10.在一种实施方式中，所述低等强度组成型启动子为p
grpe
，所述中等强度组成型启动子为p
ssra
。
11.在一种实施方式中，所述n-乙酰神经氨酸合酶nemneub通过启动子p
trc
调控表达；所述udp-n-乙酰氨基葡糖-2-差向异构酶neuc通过启动子p
grpe
调控表达。
12.在一种实施方式中，以大肠杆菌e.coli.bl21(de3)δnanatek,δnagabe,δmanxyz,δpoxb为出发菌株，在δmanxyz处整合p
grpe
调控的内源酶neuc基因，并在δpoxb处整合p
grpe
调控的nemneub。
13.在一种实施方式中，所述udp-n-乙酰氨基葡糖-2-差向异构酶neuc的氨基酸序列如seq id no.1所示；编码neuc基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
14.在一种实施方式中，所述n-乙酰神经氨酸合酶neub的氨基酸序列如seq id no.3、seq id no.16或seq id no.18所示；编码neub基因的核苷酸序列分别如seq id no.4、seq id no.17或seq id no.19所示。
15.在一种实施方式中，所述葡萄糖胺合酶突变体glmsa的氨基酸序列如seq id no.5所示；编码glmsa基因的核苷酸序列如seq id no.6所示。
16.在一种实施方式中，利用不同强度的启动子组合表达所述glmm,glmu-glmsa；所述不同强度的启动子选自p
ssra
、p
grpe
、p
224
。
17.在一种实施方式中，采用seq id no.10所示的启动子p
grpe
强化表达所述glmm,采用seq id no.8所示启动子p
ssra
强化表达所述glmu和突变体glmsa。
18.在一种实施方式中，采用seq id no.10所示的启动子p
grpe
强化表达所述n-乙酰神经氨酸合酶nemneub。
19.本发明还提供了一种提高重组大肠杆菌n-乙酰神经氨酸合成能力的方法，所述方法是以所述重组大肠杆菌e.coli.bl21(de3)δnanatek,δnagabe,δmanxyz::p
gpre-neuc,δpoxb为出发菌株，以不同强度的组成型启动子组合强化glmm,glmu和glms突变体glmsa，并以不同强度的启动子优化脑膜炎奈瑟菌(neisseria meningitidis)来源的neub在基因组上的表达水平，所述启动子选自seq id no.7～15任一所示的启动子。
20.在一种实施方式中，用启动子p
grpe
调控glmm基因，并用p
ssra
调控的glmu和glms突变体glmsa的表达，
21.在一种实施方式中，用启动子p
grpe
调控n-乙酰神经氨酸合酶nemneub、neuc的表达。
22.本发明还提供了所述重组大肠杆菌在发酵生产n-乙酰神经氨酸中的应用。
23.在一种实施方式中，所述发酵以甘油为碳源，甘油的浓度可选自20～40g/l。
24.在一种实施方式中，所述发酵是在含30g/l甘油，6g/l尿素，3.8mg/l七水硫酸锌，0.33g/l一水硫酸锰，5g/l七水硫酸铁，0.1g/l五水硫酸铜，0.1g/l六水氯化钴，4.8g/l酵母粉，2.4g/l胰蛋白胨，5.336g/l磷酸二氢钾，3.284g/l三水合磷酸氢二钾，2.84g/l一水柠檬
酸，2g/l七水硫酸镁，4g/l硫酸铵，ph调至7的培养基中进行的。
25.在一种实施方式中，所述方法将基因改造后的重组大肠杆菌接种于lb培养基中，37℃培养12～14h获得种子液，再以1～2％的接种量转接至发酵培养基中发酵。
26.在一种实施方式中，所述发酵在35～37℃发酵至少24h。
27.本发明提供了所述大肠杆菌在生产含n-乙酰神经氨酸的产品中的应用。
28.在一种实施方式中，所述产品包括但不限于药物或保健品
29.有益效果：本发明提供的重组大肠杆菌可以实现n-乙酰神经氨酸在胞外积累，通过采用不同强度的组成型大肠杆菌启动子强化glmm,glmu和glmsa提高n-乙酰神经氨酸合成途径的代谢通量，并以不同强度的组成型启动子优化不同来源的n-乙酰神经氨酸合酶neub在基因组上的表达水平，使构建的重组大肠杆菌发酵至48h时n-乙酰神经氨酸产量提高至11.28g/l以上。
附图说明
30.图1为n-乙酰神经氨酸的代谢流程图。
具体实施方式
31.葡萄糖胺合酶突变体glmsa的基因的核苷酸序列如seq id no.6所示。neisseria meningitidis来源的n-乙酰神经氨酸合酶nemneub的核苷酸序列如seq id no.17所示。moritella viscosa来源的n-乙酰神经氨酸合酶编码基因movneub的核苷酸序列如seq id no.4所示。ecoli来源的n-乙酰神经氨酸合酶编码基因econeub的核苷酸序列如seq id no.19所示。
32.启动子p
trc
、p
ssra
、p
dnakj
、p
grpe
、p
566
、p
224
、p
333
、p
tac
、p
alsar
的核苷酸序列分别为seq id no.7～15；
33.重组大肠杆菌种子培养及发酵：
34.种子液培养基：10g/l胰蛋白胨，10g/l氯化钠，5g/l酵母粉。
35.发酵培养基配方为：6g/l尿素，3.8mg/l七水硫酸锌，0.33g/l一水硫酸锰，5g/l七水硫酸铁，0.1g/l五水硫酸铜，0.1g/l六水氯化钴，4.8g/l酵母粉，2.4g/l胰蛋白胨，5.336g/l磷酸二氢钾，3.284g/l三水合磷酸氢二钾，2.84g/l一水柠檬酸，2g/l七水硫酸镁，4g/l硫酸铵，ph调至7
36.培养条件：将重组大肠杆菌接种于lb培养基中，37℃220rpm培养12～14h获得种子液，再以1～2％的接种量转接至发酵培养基中发酵，在37℃220rpm条件下反应48h。
37.样品检测方法：n-乙酰神经氨酸的检测采用agilent液相色谱进行检测，色谱柱为aminex hpx-87h column(300
×
7.8mm)，紫外210nm检测吸收峰，流动相为10mm硫酸，流速为0.5ml/min，n-乙酰神经氨酸的出峰时间约为9.8分钟。
38.实施例1重组菌株ecoli.bl21(de3)δnanatek,δnagabe,δmanxyz::p
gpre-neuc,δpoxb::p
trc-movneub的构建
39.(1)nagabe、nanatek、manxyz和poxb敲除菌株的构建
40.通过crisper/cas9基因编辑技术实现在大肠杆菌基因组上葡萄糖胺转运相关的磷酸转移酶系统相关的基因n-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶naga(gene id:945289)、氨基
葡萄糖-6-磷酸脱氨酶nagb(gene id:945290)、pts系统n-乙酰氨基葡萄糖特异性eiicba组分nage(gene id:945292)、n-乙酰神经氨酸转运载体相关基因n-乙酰神经氨酸裂解酶nana(gene id:947742)、唾液酸转运蛋白nant(gene id:947740)、n-乙酰甘露糖胺-6-磷酸2-差向异构酶nane(gene id:947745)、n-乙酰甘露糖胺激酶nank(gene id:947757)、pts系统甘露糖特异性eiiab组分相关基因manxyz(gene id:946334,946332)丙酮酸氧化酶poxb基因(gene id:946132)的敲除。其中nagabe的n20序列为attgccctgagcaaggagcc，nanatek的n20序列为gctttggtatgaaaattgta，manxyz的n20序列为acgaagccgaggtagaagaa，poxb的n20序列为ggtgaaaatagcgtcatcgg。首先将含有cas9切割蛋白的pcas9质粒用化学转化法转化到大肠杆菌宿主菌中，以大肠杆菌bl21(de3)为模板，pcr扩增敲除位点的上游、下游片段各1000bp左右，通过pcr扩增获得片段后，再经过gibson组装试剂盒与crisper/cas9系统中的靶向切割质粒ptarget载体连接。质粒构建好测序后，制作含有pcas9的大肠杆菌感受态细胞，实现目的基因的敲除。转化后将转化子涂布于抗性平板上，挑取单菌落进行菌落pcr验证阳性转化子并测序，依次构建在基因组上敲除nagabe、nanatek、manxyz和poxb的重组大肠杆菌，将该菌株命名为nbc-1。
41.(2)构建基因组重组整合neuc片段
42.根据neisseria meningitidis来源的udp-n-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶neuc(氨基酸序列如seq id no.1所示)，合成其编码基因neuc的核苷酸序列(如seq id no.2所示)；将neuc的整合位点选择在pts系统甘露糖特异性eiiab组分相关基因manxyz的所在位置进行敲入。
43.以大肠杆菌bl21(de3)为模板，设计引物neuc-l-f1和neuc-l-r1，扩增重组整合neuc左臂基因片段；
44.neuc-l-f1：5
’‑
catcaataccgtttccggcaaaggc-3’,
45.neuc-l-r1：5
’‑
ctcccggaccaaaacgaaaaaagacgcttttcagcgtctttttttttttttttggtaccgaggaatctgttagaggcgcaatagtgacag-3’,
46.合成核苷酸序列如seq id no.10所示的p
grpe
启动子片段；
47.以大肠杆菌bl21(de3)为模板，设计引物neuc-r-f1和neuc-r-r1，扩增重组整合neuc右臂基因片段；
48.neuc-r-f1:5
’‑
cgggggctttctcatgcgtttcccaggtggaagccctatttcttttatg-3’；
49.neuc-r-r1:5
’‑
gtagagttcactcctgccgatccg-3’50.将扩增得到的neuc左臂基因片段、p
grpe
启动子片段、neuc基因片段和neuc右臂片段通过融合pcr技术构建成重组整合neuc基因片段p
grpe-neuc。
51.(3)构建基因组重组整合neub片段
52.根据moritella viscosa来源的n-乙酰神经氨酸合酶编码基因neub(氨基酸序列如seq id no.3所示)，合成其编码基因neub的核苷酸序列(如seq id no.4所示)；neub的整合位点选择在丙酮酸氧化酶poxb基因(gene id:946132)所在位置进行敲入整合。
53.以大肠杆菌bl21(de3)为模板，设计引物neub-l-f1和neub-l-r1，扩增重组整合neub左臂基因片段；
54.neub-l-f1：5
’‑
gaggcgttaatcagcacgtttctcgct-3’,
55.neub-l-r1：5
’‑
cacaattccacacattatacgagccggatgattaattgtcaaaaagggtggcatt
tcccgtcataataaggacat-3’56.合成核苷酸序列如seq id no.14所示的p
trc
启动子片段；
57.以大肠杆菌bl21(de3)为模板，设计引物neub-r-f1和neub-r-r1，扩增重组整合neub右臂基因片段；
58.neub-r-f1：5
’‑
gccgaagcgggtttttacgtaaaacaggtgaaactgacggttctccatctcctgaatgtgataacggtaacaagtt-3’,
59.neub-r-r1：5
’‑
aatatgcactggtcagcgtgcgtaactc-3’60.将扩增得到的neub左臂基因片段、p
trc
启动子片段、neub基因片段和neub右臂片段通过融合pcr技术构建成重组整合neub基因片段p
trc-neub。
61.(4)基因的整合
62.将步骤(2)构建的融合片段p
grpe-neuc经过gibson组装试剂盒与crisper/cas9系统中的含有n20识别序列(agccctttctttttatagtt)的靶向切割质粒ptarget载体连接后，采用化学转化法，将构建好的质粒转化到含有cas9质粒的步骤(1)构建的大肠杆菌nbc-1感受态细胞中，获得将p
gpre-neuc整合在δmanxyz处的重组菌株，验证正确后命名为nbc-2。
63.将步骤(3)构建的融合片段融合片段p
trc-neub经过gibson组装试剂盒与crisper/cas9系统中的含有n20识别序列(ggtgaaaatagcgtcatcgg)的靶向切割质粒ptarget载体连接后，采用化学转化法，将构建好的质粒转化到大肠杆菌nbc-2感受态细胞中，获得将p
trc-neub整合在δpoxb处的重组菌株。取转化子进行菌落pcr验证，整合成功后的菌株命名为nbc-3。
64.实施例2构建由不同强度组成型启动子组合调控的glmm,glmu和glmsa重组片段
65.以大肠杆菌bl21(de3)基因组为模板，设计引物glm-l-f2和glm-l
–
r2，扩增重组p
第一启动子-glmm-p
第二启动子-glmu-glmsa整合位点的左侧同源臂基因片段；
66.glm-l-f2:5
’‑
acttagttagcttggccgtaacgcccgcagtttcggatc-3’；
67.glm-l-r2:5
’‑
cctcggcattttattggcttacgg-3’；
68.以大肠杆菌bl21(de3)基因组为模板，设计引物glm-r-f2和glm-r-r2，扩增重组p
第一启动子-glmm-p
第二启动子-glmu-glmsa整合位点的右侧同源臂基因片段；
69.glm-r-f2：5
’‑
ggtaccgaggatttcgccatcaaccgataaagcagagc-3’；
70.glm-r-r2：5
’‑
taaccttgaacagtgcccacaagcag-3’；
71.合成如seq id no.6的核苷酸序列所示的glmsa片段；
72.合成核苷酸序列如seq id no.8、9、12所示的启动子片段；
73.以大肠杆菌bl21(de3)基因组为模板，设计引物glmm-f2和glmm r2，扩增重组整合glmm的基因片段；
74.glmm-f2:5
’‑
ccctgaaactgatccccataataagcgaagttagcgagatgaatgcgaaaaaaacggttcacacaggaaacctataatgatgagtaatcg-3’；
75.glmm-r2:5
’‑
agatcccggtgcctaatgagtgag-3’；
76.以大肠杆菌bl21(de3)基因组为模板，设计引物glmu-f2和glmu r2，扩增重组整合glmu的基因片段；
77.glmu-f2:5
’‑
cattgaggctggtcatggcgctcataaatctggtatacttacctttacacattgttcacacaggaaacctataatgatgttgaataatgc-3’；
sa1，即p
grpe-glmm-p
ssra-glmu-glmsa)命名为nbc-5。
85.实施例4构建基因组整合的neub重组片段
86.根据不同来源的n-乙酰神经氨酸合酶编码基因neub，合成其编码基因neub的核苷酸序列(如seq id no.4、18、20所示)；
87.以脑膜炎奈瑟菌(neisseria meningitidis)来源的nemneub(氨基酸序列如seq id no.17所示)为例：以大肠杆菌bl21(de3)为模板，设计引物nemneub-l-f1和nemneub-l-r1，扩增重组整合nemneub左臂基因片段；
88.nemneub-l-f1：5
’‑
gaggcgttaatcagcacgtttctcgct-3’；
89.nemneub-l-r1：5
’‑
aaagggtggcatttcccgtcataataaggacat-3’；
90.合成如seq id no.9～13和seq id no.15的核苷酸序列所示的启动子片段；
91.以大肠杆菌bl21(de3)为模板，设计引物nemneub-r-f1和nemneub-r-r1，扩增重组整合nemneub右臂基因片段；
92.nemneub-r-f1:5
’‑
gccgaagcgggtttttacgtaaaacaggtgaaactgacggttctccatctcctgaatgtgataacggtaacaagtt-3’；
93.nemneub-r-r1:5
’‑
aatatgcactggtcagcgtgcgtaactc-3’；
94.将扩增得到的nemneub左臂基因片段、启动子片段(分别如seq id no.8～12和seq id no.15所示)、nemneub基因片段(核苷酸序列如seq id no.17)和nemneub右臂片段通过融合pcr技术构建成重组整合nemneub基因片段，根据启动子的不同将其分别命名为nemneub1～nemneub6；其中，nemneub1对应含有seq id no.8所示的p
ssra
启动子的nemneub融合片段，nemneub2对应含有seq id no.10所示的p
grpe
启动子的nemneub融合片段，nemneub3对应含有seq id no.12所示的p
224
启动子的nemneub融合片段，nemneub4对应含有seq id no.9所示的p
dnakj
启动子的nemneub融合片段，nemneub5对应含有seq id no.11所示的p
566
启动子的nemneub融合片段,nemneub6对应含有seq id no.15所示的p
alsar
启动子的nemneub融合片段。
95.按照上述相同策略，构建moritella viscosa来源的movneub(核苷酸序列如seq id no.4所示)和e.coli来源的econeub(核苷酸序列如seq id no.19所示)的重组整合片段，根据启动子的不同分别将重组片段命名为movneub1～movneub5，econeub1～econeub6。其中movneub1～movneub5分别对应含有seq id no.13～seq id no.15、seq id no.7所示启动子以及movneub的融合片段；econeub1～econeub6分别对应含有seq id no.7～10、13、15、所示启动子的econeub融合片段。
96.表2各启动子序列
[0097][0098][0099]
实施例5重组整合nemneub基因的大肠杆菌的构建
[0100]
将实施例4中得到的由不同强度启动子调控的nemneub片段(nemneub1～nemneub6)分别经过gibson组装试剂盒与crisper/cas9系统中的含有n20识别序列的靶向切割质粒ptarget载体连接后，采用化学转化法，将构建好的质粒转化到含有cas9质粒的nbc-5大肠工程菌感受态细胞中，使不同启动子-nemneub片段替换原ptrc-movneub。取测序正确的含有不同强度启动子调控的nemneub的dna片段的阳性转化子分别命名为nbc8-1～nbc8-6。
[0101]
消除基因编辑系统中的工具质粒后于发酵培养基中37℃，220rpm培养48h后利用高效液相色谱测定上清液中产物的浓度，nbc8-1～nbc8-6中检测到的n-乙酰神经氨酸(neuac)产量分别为11.28g/l，8.76g/l，5.2g/l，0.945g/l，9.87g/l，2.575g/l。结果显示在脑膜炎奈瑟菌(neisseria meningitidis)来源的nemneub受到低强度启动子p
grpe
调控的菌株中n-乙酰神经氨酸(neuac)产量相对最高，为11.28g/l，将该菌株命名为nbc-8。
[0102]
对比例1
[0103]
将实施例5的大肠重组菌株中脑膜炎奈瑟菌(neisseria meningitidis)来源的nemneub序列(seq id no.17)分别替换成moritella viscosa来源的movneub(seq id no.4)和ecoli来源的econeub(seq id no.19)序列，取测序正确的含有不同强度启动子调控的econeub，movneub的dna片段的阳性转化子分别命名为nbc6-1～nbc6-6(分别融合了p
tac
、p
ssra
、p
dnakj
、p
grpe
、p
alsar
、p
333
启动子)，nbc7-1～nbc7-5(分别融合了p
tac
、p
ssra
、p
dnakj
、
p
566
、p
333
、p
trc
启动子)。检测发酵上清液发现nbc6-1～nbc6-6检测到的n-乙酰神经氨酸(neuac)产量分别为4.1g/l，3.5g/l，0.76g/l，2.81g/l，8.2g/l，6.85g/l。nbc7-1～nbc7-5中检测到的n-乙酰神经氨酸(neuac)产量分别为0.87g/l，0.765g/l，0.785g/l，0.905g/l，0.8g/l。
[0104]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。