急性期的视神经脊髓炎的预防或治疗剂的制作方法

1.本发明涉及一种包含rgma抑制物质的急性期的视神经脊髓炎的预防或治疗剂、以及该视神经脊髓炎的疼痛症状的预防或治疗剂。


背景技术：

2.视神经脊髓炎(neuromyelitis optica：nmo)也称为devic病，是以重度的视神经炎和达到3个椎体以上的横贯性脊髓炎为特征的炎症性中枢神经疾病。在2004年，发现对视神经脊髓炎为特异性的igg(nmo-igg)(非专利文献1)，进而，有报导称在星形胶质细胞的足部突起高密度地表达的水通道蛋白、即水通道蛋白4(aquaporin-4：aqp4)为其靶抗原，即nmo-igg为抗aqp4抗体(非专利文献2)。
3.因此，与作为脱髓鞘疾病的多发性硬化症不同，视神经脊髓炎是因抗aqp4抗体破坏星形胶质细胞的星形胶质细胞病变。对于视神经脊髓炎的病征，认为是细胞性免疫的活化所引起的中枢炎症或血液脊髓屏障(blood spinal cord barrier(bscb)，在大脑是因血脑屏障(blood brain barrier(bbb)))的通透性亢进，使抗aqp4抗体流入大脑/脊髓内并产生补体活化，而广泛发生aqp4的缺失、星形胶质细胞的破坏、脱落。认为因星形胶质细胞的细胞损伤(补体依赖性、抗体依赖性细胞损伤)和星形胶质细胞脱落所致的血脑屏障的破坏或谷氨酸代谢异常之类的功能性损伤，而二次性地发生炎症性细胞浸润、脱髓鞘/轴突损伤、巨噬细胞/小神经胶质细胞所致的吞噬、组织软化，其结果，引起神经组织的坏死(非专利文献3、4)。
4.作为典型的视神经脊髓炎的诊断基准，已广泛采用wingerchuk等在2006年所发表的基准(非专利文献5)；在2007年，作为视神经脊髓炎相关疾病(nmosd)，除典型的视神经脊髓炎外，仅有视神经炎(复发性或两眼性)或3个椎体以上的长脊髓炎的病例被视为相同范畴的疾病(非专利文献6)。因此，近年来，视神经脊髓炎被认为是比以往认为的单纯的视神经脊髓炎更广的疾病概念。如此，仅根据脊髓病变的长度等临床和图像观察，也有时难以进行视神经脊髓炎的诊断，抗aqp4抗体对视神经脊髓炎的诊断和治疗方针的决定是极为重要的检查。
5.急性期的视神经脊髓炎的症状与多发性硬化症相比，多为重症，在看1次复发时，对于视神经炎，也有时会失明，对于脊髓炎，也有时被迫过上轮椅生活，因此，迅速开始治疗是至关重要的。另外，视神经脊髓炎发病时，无论急性期和慢性期，均会伴有剧烈的疼痛，因此，一并进行缓和该疼痛的治疗也很重要。
6.急性期的视神经脊髓炎治疗的第一选择为类固醇脉冲疗法(非专利文献7)，在临床上广泛认识到其有效性。对于多发性硬化症，已证明该疗法促进由急性期的临床症状恶化恢复的效果，因此，认为对于视神经脊髓炎也可得到同样的效果(非专利文献8～10)。类固醇脉冲疗法与针对多发性硬化症的治疗法同样，其标准为以1000mg/天连续3天点滴给予甲泼尼龙，症状改善不充分时，进一步追加1～2个疗程。类固醇脉冲疗法缺乏治疗效果时，作为第二选择的治疗，积极地考虑血浆交换疗法(非专利文献11、12)，在重症病例中，期望
从早期进行血浆交换疗法。
7.如上所述，在急性期的治疗中，目前对于在多发性硬化症或视神经脊髓炎显示有用性的治疗法，仅累积了基于其可能性的病例报告。另外，现状是与急性期的视神经脊髓炎有关的有效治疗药尚未上市。
8.rgm(repulsive guidance molecule)是最初被鉴定为视觉系统的轴突诱导分子的膜蛋白(非专利文献13)。已知rgm家族中包含称为rgma、rgmb和rgmc的3种成员(非专利文献14)，且至少rgma和rgmb以相同的信号转导机制发挥作用(非专利文献15)。rgmc在铁代谢中发挥重要的作用。
9.根据其后的研究，明确了rgm具有诱导爪蟾(xenopus)和鸡胚胎的轴突和形成板层，以及控制小鼠胚胎的头部神经管的闭合等功能(非专利文献16)。在专利文献1中公开了含有抗rgm中和抗体作为有效成分的轴突再生促进剂。
10.除发育阶段的功能之外，还由于在成年人类和大鼠的中枢神经系统损伤后再表达，以及在大鼠中，rgma抑制会使脊髓损伤后的轴突生长亢进、促进功能恢复(非专利文献17)，因此，认为rgma是中枢神经系统损伤后的轴突再生抑制物质。作为中和rgma的具体的抗体，记载于例如专利文献2(例如5f9、8d1)、专利文献3(例如ae12-1、ae12-1y)以及专利文献4(例如r116a3、r70e4、r116a3c、rh116a3)。
11.另外，已知抗rgma中和抗体对抑制视神经脊髓炎发病具有效果(非专利文献18)。
12.如此，对于中枢神经系统损伤，已明确rgma的作用，且已知对抑制视神经脊髓炎发病的效果，特别是尚未鉴定出rgma参与急性期的视神经脊髓炎的治疗，且尚未知晓该治疗药。
13.现有技术文献
14.专利文献
15.专利文献1：国际公开wo2005/087268号
16.专利文献2：国际公开wo2009/106356号
17.专利文献3：国际公开wo2013/112922号
18.专利文献4：国际公开wo2016/175236号
19.非专利文献
20.非专利文献1：lancet 364:2106-2112,2004
21.非专利文献2：j exp med 202:473-477,2005
22.非专利文献3：j.clin.immunol.3582,129-135(2012)
23.非专利文献4：journal of the neurological sciences 306(2011)183-187
24.非专利文献5：neurology 66:1485-1489,2006
25.非专利文献6：lancet neurol 6:805-815,2007
26.非专利文献7：curr treat options neurol 12:244-255,2010
27.非专利文献8：neurology 53:1107-1114,1999
28.非专利文献9：magn reson med sci 7:55-58,2008
29.非专利文献10：tohoku j exp med 215:55-59,2008
30.非专利文献11：neurology 63:1081-1083,2004
31.非专利文献12：mult sclr 13:128-132,2007
32.非专利文献13：neuron 5,735-743(1990)
33.非专利文献14：philos.trans.r.soc.lond.b biol.sci.,361:1513-29,2006
34.非专利文献15：biochem.biophys.res.commun.382,795-800(2009)
35.非专利文献16：curr.opin.neurobiol.17,29-34(2007)
36.非专利文献17：j.cell biol.173,47-58(2006)
37.非专利文献18：scientific reports 8:34 1-9(2018)


技术实现要素：

38.对于抗rgma中和抗体对视神经脊髓炎的发病抑制效果，记载于非专利文献18。在该文献中，通过对健康动物的脊髓直接给予来自抗aqp4抗体阳性nmo患者的igg，并同时给药抗rgma中和抗体，从而显示抑制视神经脊髓炎的发病的效果。然而，不仅未记载抗rgma中和抗体对反映人类的病征的急性期的视神经脊髓炎模型的效果，而且，仅由该文献的记载也不清楚抗rgma中和抗体对于急性期的视神经脊髓炎是否显示预防或治疗效果。
39.另外，在视神经脊髓炎的发病时，由于会伴有剧烈的痛楚，因此，迫切期望一种能够一并进行伴随该疾病的疼痛症状的缓和或治疗的对视神经脊髓炎的预防或治疗药。
40.本发明的课题在于提供一种对急性期的视神经脊髓炎和视神经脊髓炎的症状有效的药剂。
41.本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现，rgma抑制物质、尤其是抗rgma中和抗体对于急性期的视神经脊髓炎具有对临床急性恶化的恢复作用、早期修复因脊髓炎所致的血液脊髓屏障的破坏的作用以及抑制急性期的视神经脊髓炎的病征中可见的粒细胞的浸润的作用，由此，发现对急性期的视神经脊髓炎的预防或治疗具有优异的效果。另外，发现rgma抑制物质、尤其是抗rgma中和抗体能够治疗、减轻或缓和视神经脊髓炎的疼痛症状，以至完成了本发明。
42.即，本发明如下所述。
43.1.一种急性期的视神经脊髓炎的预防或治疗剂，包含rgma抑制物质。
44.2.根据项1所述的预防或治疗剂，其中，rgma抑制物质为抗rgma中和抗体。
45.3.根据项2所述的预防或治疗剂，其中，抗rgma中和抗体为人源化抗体。
46.4.根据项2或3所述的预防或治疗剂，其中，抗rgma中和抗体为识别选自序列号16、序列号36、序列号37、序列号38和序列号39中的氨基酸序列的抗体。
47.5.根据项2～4中任一项所述的预防或治疗剂，其中，抗rgma中和抗体为选自下述(a)～(l)中的抗体：
48.(a)包含轻链可变区以及重链可变区的抗rgma中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号5中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号6中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含序列号7中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号8中记载的氨基酸序列的hcdr1、包含序列号9中记载的氨基酸序列的hcdr2和包含序列号10中记载的氨基酸序列的hcdr3，
49.(b)包含轻链可变区以及重链可变区的抗rgma中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号11中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号12中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含序列号13中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号14中记载的氨基酸
序列的hcdr1、包含序列号15中记载的氨基酸序列的hcdr2和在氨基酸序列中包含sfg的hcdr3，
50.(c)包含轻链可变区以及重链可变区的抗rgma中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号17中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号18中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含序列号19中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号20中记载的氨基酸序列的hcdr1、包含序列号21中记载的氨基酸序列的hcdr2和包含序列号22中记载的氨基酸序列的hcdr3，
51.(d)包含轻链可变区以及重链可变区的抗rgma中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号23中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号24中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含序列号25中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号26中记载的氨基酸序列的hcdr1、包含序列号27中记载的氨基酸序列的hcdr2和包含序列号28中记载的氨基酸序列的hcdr3，
52.(e)包含轻链可变区以及重链可变区的抗rgma中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含序列号31中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的hcdr1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的hcdr2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的hcdr3，
53.(f)包含轻链可变区以及重链可变区的抗rgma中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含序列号35中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的hcdr1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的hcdr2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的hcdr3，
54.(g)包含轻链可变区以及重链可变区的抗rgma中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含序列号40中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的hcdr1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的hcdr2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的hcdr3，
55.(h)包含轻链可变区以及重链可变区的抗rgma中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含序列号41中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的hcdr1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的hcdr2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的hcdr3，
56.(i)包含轻链可变区以及重链可变区的抗rgma中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含序列号42中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的hcdr1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的hcdr2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的hcdr3，
57.(j)包含轻链可变区以及重链可变区的抗rgma中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含
序列号43中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的hcdr1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的hcdr2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的hcdr3，
58.(k)包含轻链可变区以及重链可变区的抗rgma中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含序列号44中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的hcdr1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的hcdr2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的hcdr3，以及
59.(l)包含轻链可变区以及重链可变区的抗rgma中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含序列号45中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的hcdr1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的hcdr2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的hcdr3。
60.6.一种视神经脊髓炎的疼痛症状的预防或治疗剂，包含rgma抑制物质。
61.7.根据项6所述的预防或治疗剂，其中，rgma抑制物质为抗rgma中和抗体。
62.8.根据项7所述的预防或治疗剂，其中，抗rgma中和抗体为人源化抗体。
63.9.根据项7或8所述的预防或治疗剂，其中，抗rgma中和抗体为识别选自序列号16、序列号36、序列号37、序列号38和序列号39中的氨基酸序列的抗体。
64.10.根据项7～9中任一项所述的预防或治疗剂，其中，抗rgma中和抗体为选自下述(a)～(l)中的抗体：
65.(a)包含轻链可变区以及重链可变区的抗rgma中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号5中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号6中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含序列号7中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号8中记载的氨基酸序列的hcdr1、包含序列号9中记载的氨基酸序列的hcdr2和包含序列号10中记载的氨基酸序列的hcdr3，
66.(b)包含轻链可变区以及重链可变区的抗rgma中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号11中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号12中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含序列号13中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号14中记载的氨基酸序列的hcdr1、包含序列号15中记载的氨基酸序列的hcdr2和在氨基酸序列中包含sfg的hcdr3，
67.(c)包含轻链可变区以及重链可变区的抗rgma中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号17中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号18中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含序列号19中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号20中记载的氨基酸序列的hcdr1、包含序列号21中记载的氨基酸序列的hcdr2和包含序列号22中记载的氨基酸序列的hcdr3，
68.(d)包含轻链可变区以及重链可变区的抗rgma中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号23中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号24中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含序列号25中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号26中记载的氨基酸序列的hcdr1、包含序列号27中记载的氨基酸序列的hcdr2和包含序列号28中记载的氨基酸
序列的hcdr3，
69.(e)包含轻链可变区以及重链可变区的抗rgma中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含序列号31中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的hcdr1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的hcdr2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的hcdr3，
70.(f)包含轻链可变区以及重链可变区的抗rgma中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含序列号35中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的hcdr1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的hcdr2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的hcdr3，
71.(g)包含轻链可变区以及重链可变区的抗rgma中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含序列号40中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的hcdr1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的hcdr2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的hcdr3，
72.(h)包含轻链可变区以及重链可变区的抗rgma中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含序列号41中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的hcdr1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的hcdr2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的hcdr3，
73.(i)包含轻链可变区以及重链可变区的抗rgma中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含序列号42中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的hcdr1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的hcdr2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的hcdr3，
74.(j)包含轻链可变区以及重链可变区的抗rgma中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含序列号43中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的hcdr1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的hcdr2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的hcdr3，
75.(k)包含轻链可变区以及重链可变区的抗rgma中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含序列号44中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的hcdr1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的hcdr2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的hcdr3，以及
76.(l)包含轻链可变区以及重链可变区的抗rgma中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含序列号45中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸
序列的hcdr1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的hcdr2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的hcdr3。
77.11.一种急性期的视神经脊髓炎或视神经脊髓炎的疼痛症状的预防或治疗方法，包括对需要治疗的哺乳动物给予有效量的rgma抑制物质。
78.12.根据项11所述的预防或治疗方法，其中，rgma抑制物质为抗rgma中和抗体。
79.13.一种rgma抑制物质的、用于制造急性期的视神经脊髓炎的预防或治疗剂的用途。
80.根据本发明，rgma抑制物质、尤其是抗rgma中和抗体显示例如早期修复急性期的视神经脊髓炎中可见的血液脊髓屏障(在大脑中为血脑屏障)的破坏的作用等，作为急性期的视神经脊髓炎的预防或治疗剂是有用的。
81.另外，根据本发明，rgma抑制物质、尤其是抗rgma中和抗体显示例如抑制急性期的视神经脊髓炎中可见的粒细胞向脊髓的浸润的作用，作为急性期的视神经脊髓炎的预防或治疗剂是有用的。
82.进而，根据本发明，rgma抑制物质、尤其是抗rgma中和抗体能够治疗、减轻或缓和视神经脊髓炎中可见的疼痛症状，作为这样的疼痛症状的预防或治疗剂是有用的。
附图说明
83.图1为表示抗rgma中和抗体(也有时简称为抗rgma抗体)对急性期重症型nmo大鼠模型的临床急性恶化的治疗效果的图。各数据表示mean
±
s.e.m.。在图表图例的括号内表示各组例数。
84.图2为表示抗rgma中和抗体对teae小鼠急性期的血液脊髓屏障破坏和神经症状的恢复效果的图。图2的a表示抗rgma中和抗体对teae小鼠急性期的bscb破坏时的钆向脊髓漏出的水平变化的恢复效果。各数据表示mean
±
s.e.m.，在图表图例的括号内表示各组例数。在注入细胞因子7天后的时间点，没有确认到钆向脊髓漏出的个体和无法取得注入细胞因子14天后的mri图像的个体从解析数据中排除，统计解析使用bonferroni多重比较检验进行(***p＜0.001)。箭头表示抗体给药日。图2的b表示抗rgma中和抗体对神经症状的恢复效果。各数据表示mean
±
s.e.m.，在图表图例的括号内表示各组例数。箭头表示抗体给药日。统计解析是在各时间点通过mann-whitney u检验进行解析(*p＜0.05、**p＜0.01)。
85.图3为表示teae小鼠急性期的钆脊髓内漏出强度与神经症状严重程度的相关性的图。按每个个体对各数据作图，统计解析采用spearman的顺位相关分析。在图表图例的括号内表示各组例数。有注入细胞因子14天后在mri图像取得上发生缺失的1例(抗rgma中和抗体给药组)。
86.图4为表示抗rgma中和抗体对急性期重症型nmo大鼠模型的血液脊髓屏障破坏的治疗效果的免疫组织化学染色图像和图。定量解析的各数据表示mean
±
s.e.m.，使用turkey的多重比较检验进行统计解析(*p＜0.05)。
87.图5为表示抗rgma中和抗体对急性期重症型nmo大鼠模型的疼痛相关行动的效果的图。各数据表示mean
±
s.e.m.，使用turkey的多重比较检验进行统计解析(***p＜0.001、**p＜0.01、*p＜0.05vs健康无处置组；##p＜0.01、#p＜0.05vs nmo_同型对照抗体处置组)。箭头表示抗rgma中和抗体或同型对照抗体的给药日。
88.图6为表示抗rgma中和抗体对急性期重症型nmo大鼠模型的脊髓的粒细胞浸润的抑制效果的免疫组织化学染色图像和图。定量解析的各数据表示mean
±
s.e.m.，使用turkey的多重比较检验进行统计解析(**p＜0.01、*p＜0.05)。
89.图7为表示急性期重症型nmo大鼠模型的脊髓的aqp4脱落部位的rgma表达的免疫组织化学染色图像。
具体实施方式
90.以下，对本发明中使用的用语进行说明。
91.[中和]
[0092]
在本技术中，中和是指与目标靶结合且能够阻碍该靶的任一功能的作用。例如，rgma抑制物质是指结合于rgma，结果显示抑制rgma的生物活性的作用的物质。
[0093]
[表位]
[0094]
在本技术中，表位包含能够与免疫球蛋白或t细胞受体特异性结合的多肽决定基。在某个实施方式中，表位包含分子化学活性表面基团(例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基)，在某个实施方式中，可以具有特定的3维结构特性和/或特定的电荷特性。表位是通过抗体而结合的抗原区域。
[0095]
[经分离的]
[0096]
在本技术中，经分离的rgma抑制物质(例如抗体等)等的“经分离的”是经鉴定且分离的、和/或从自然状态下的成分中回收的含义。自然状态下的杂质是可能干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可举出酶、激素和其它蛋白质性或非蛋白质性的溶质。一般而言，对rgma抑制物质等进行分离时，只要通过至少1个纯化工序进行纯化即可，可以将通过至少1个纯化工序而纯化的rgma抑制物质称为“经分离的rgma抑制物质”。
[0097]
[抗体]
[0098]
在本技术中，抗体在广义上是指保持免疫球蛋白(ig)分子的实质上与表位结合的特征的由2条重链(h链)和2条轻链(l链)这4条多肽链构成的ig分子。
[0099]
[人类抗体]
[0100]
在本技术中，人类抗体是指轻链、重链均来自人免疫球蛋白的抗体。人类抗体根据重链的恒定区的不同，包含具有γ链的重链的igg(包含igg1、igg2、igg3和igg4)、具有μ链的重链的igm、具有α链的重链的iga(包含iga1、iga2)、具有δ链的重链的igd或具有ε链的重链的ige。另外，原则上轻链包含κ链和λ链中的任一者。
[0101]
[人源化抗体]
[0102]
在本技术中，人源化抗体是指由可变区和来自人类抗体的恒定区构成的抗体，该可变区由来自非人类动物的抗体的互补决定区和来自人类抗体的构架区构成。
[0103]
[嵌合抗体]
[0104]
在本技术中，嵌合抗体是指轻链、重链或这两者由来自非人类的可变区和来自人类的恒定区构成的抗体。
[0105]
[单特异性抗体]
[0106]
在本技术中，单特异性抗体是指具有单一抗原特异性并同时具有单一的独立的抗原识别部位的抗体。在本说明书中，例如将识别rgma的单特异性抗体称为rgma单特异性抗
体。
[0107]
[多特异性抗体]
[0108]
在本技术中，多特异性抗体是指具有2个以上不同的抗原特异性并同时具有2个以上的独立的抗原识别部位的抗体，可举出具有2个抗原特异性的双特异性抗体、具有3个抗原特异性的三特异性抗体等。
[0109]
[互补决定区(cdr)]
[0110]
互补决定区(cdr)是指免疫球蛋白分子的可变区中形成抗原结合位点的区域，也称为超可变区，是每个免疫球蛋白分子中氨基酸序列的变化特别大的部分。对于cdr，在轻链和重链中分别具有3个cdr。有时将轻链中所含的3个cdr分别称为lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且将重链中所含的3个cdr分别称为hcdr1、hcdr2和hcdr3。例如，免疫球蛋白分子的cdr可以按照卡巴特(kabat)的编号系统(kabat等，1987、sequences of proteins of immunological interest、us department of health and human services、nih、usa)来决定。
[0111]
[有效量]
[0112]
有效量是指足以减轻或改善障碍或其1个以上的症状的严重程度和/或期间，预防障碍恶化，减缓障碍，预防与障碍相关的1个以上的症状的复发、发生、发病或恶化，检测出障碍，或者强化或提高其它治疗(例如预防药或治疗药)的1个以上的预防或治疗效果的预防或治疗剂的量。
[0113]
[氨基酸序列的百分比(％)同源性]
[0114]
可变区等的候补多肽序列的氨基酸序列与参考多肽序列的氨基酸序列相关的“百分比(％)同源性”定义为使序列对齐，为了得到最大的％同源性，根据需要导入间隙，且任何的保守取代均不认为是序列同源性的一部分后的与特定的参考多肽序列中的氨基酸残基相同的候补序列中的氨基酸残基的百分比。用于测定％同源性的目的的比对(alignment)可以通过使用本领域技术人员能力范围内的各种方法、例如使用blast、blast-2、align或megalign(dnastar)软件这样的可公开获得的计算机软件来实现。只要是本领域技术人员，则能够决定包含为了对比较的序列的全长实现最大比对所必需的任意算法的用于比对序列的适当的参数。但是，为了这里的目的，％同源性值通过在成对比对中使用序列比较计算机程序blast而得到。
[0115]
在氨基酸序列比较中使用blast的状况下，所提供的氨基酸序列a与所提供的氨基酸序列b的％同源性如下计算：
[0116]
分数x/y的100倍
[0117]
这里，x为通过序列比对程序blast的a和b的程序比对而为相同时则为一致的评分的氨基酸残基数，y为b的总氨基酸残基数。在氨基酸序列a的长度与氨基酸序列b的长度不同的情况下，可以理解为a相对于b的％同源性与b相对于a的％同源性不同。只要没有特别说明，则这里所有的％同源性值如上一段所示使用blast计算机程序而得到。
[0118]
[保守取代]
[0119]
保守取代是指以实质上未改变肽的活性的方式将氨基酸残基以其它化学上类似的氨基酸残基取代。例如，可举出将某一疏水性残基由其它疏水性残基取代的情况、将某一极性残基由具有相同电荷的其它极性残基取代的情况等。作为能够进行这样的取代的功能
上类似的氨基酸的例子，作为非极性(疏水性)氨基酸，可举出丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸等。作为极性(中性)氨基酸，可举出甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。作为带正电荷的(碱性)氨基酸，可举出精氨酸、组氨酸、赖氨酸等。另外，作为带负电荷的(酸性)氨基酸，可举出天冬氨酸、谷氨酸等。
[0120]
以下，对本发明的实施方式进行详细说明。
[0121]
本发明提供一种rgma抑制物质的新颖用途、即、急性期的视神经脊髓炎的预防或治疗剂。
[0122]
另外，本发明提供一种急性期的视神经脊髓炎的预防或治疗方法，包括对需要治疗的哺乳动物给予包含有效量的rgma抑制物质的预防或治疗剂。
[0123]
＜rgma抑制物质＞
[0124]
本发明的rgma抑制物质只要是作用于rgma本身而抑制或减弱rgma的活性(以下，在本说明书中有时简称为“rgma活性”)的物质即可，例如，将具有结合于rgma而直接抑制(减弱)rgma活性的活性、或者抑制rgma与受体的结合而间接地抑制(减弱)rgma活性的活性的物质(例如后述的化合物或抗体等)称为本发明的rgma抑制物质。
[0125]
另外，本发明的rgma抑制物质也可以为抑制rgma的表达的物质，例如，抑制rgma的表达而抑制(减弱)rgma活性的物质(例如后述的核酸分子等)也包含在本发明的rgma抑制物质中。
[0126]
rgma被鉴定为中枢神经系统中的神经突生长抑制蛋白质，人rgma蛋白质如序列号1所示，以由450个氨基酸构成的前体蛋白质的形式被生合成。除去存在于n末端的信号肽met1～pro47(是指从n端侧起第1号蛋氨酸残基到第47号脯氨酸残基的肽，以后同样地记载)，切断asp168与pro169之间的肽键，生成n末端结构域，进一步从pro169除去c末侧的片段的c末端肽ala425～cys450，并且在成为c末端的ala424的c末端羧基附加gpi锚定物，生成c末侧结构域。人rgma蛋白质以通过二硫键将上述n末侧结构域(cys48～asp168)与c末侧结构域(pro169～ala424)连接而成的成熟蛋白质的形式经由gpi锚定物在细胞膜上表达。
[0127]
在本发明中，rgma可以来自任一种动物，但优选为人rgma。人的rgma的前体蛋白质由序列表的序列号1所示的氨基酸序列构成。虽然小鼠的rgma的前体蛋白质由序列表的序列号2所示的氨基酸序列构成，大鼠的rgma的前体蛋白质由序列表的序列号3所示的氨基酸序列构成，但由于c末端肽被除去，因此作为成熟蛋白质成为相同的氨基酸序列。
[0128]
作为rgma基因，可举出例如由序列号4所示的碱基序列构成的人rgma基因等，但不限于此。来自各种生物的rgm基因的碱基序列可以从公知的数据库(genbank等)容易地取得。
[0129]
作为本发明的rgma抑制物质，具体而言，可举出低分子化合物、抗rgma中和抗体、其功能改变抗体、其偶联抗体或它们的抗原结合片段等，另外，可举出作为rgma的核酸分子的sirna(short interfering rna)、shrna(short hairpin rna)或反义寡核苷酸等。这些rgma抑制物质中，优选为抗rgma中和抗体、其功能改变抗体、其偶联抗体和它们的抗原结合片段，更优选为抗rgma中和抗体或其抗原结合片段，特别优选为抗rgma中和抗体。
[0130]
＜抗rgma中和抗体＞
[0131]
在本发明中，抗rgma中和抗体只要是结合于rgma而中和rgma活性的抗体即可，可
以为多克隆抗体或单克隆抗体。在本发明中，优选为单克隆抗体。另外，本发明的抗rgma中和抗体可以为rgma单特异性抗体，也可以为识别多种rgma和其它抗原的多特异性抗体，优选为rgma单特异性抗体。
[0132]
另外，作为具体的表位，对于人rgma，优选为序列号16(序列号1的氨基酸序号47-69)、序列号36(序列号1的氨基酸序号298-311)、序列号37(序列号1的氨基酸序号322-335)、序列号38(序列号1的氨基酸序号349-359)、序列号39(序列号1的氨基酸序号367-377)中的1种以上，更优选为序列号36和37的组合，特别优选为序列号36、37和39的组合。
[0133]
本发明的抗rgma中和抗体包含以rgma蛋白质或其部分片段(例如上述的表位片段)作为抗原，并将该抗原对小鼠等哺乳动物进行免疫而得到的多克隆抗体和单克隆抗体，使用基因重组技术制造的嵌合抗体和人源化抗体，以及使用产生人类抗体的转基因动物制造的人类抗体等。在将本发明的抗体作为药物对人类进行给药的情况下，从副作用的观点出发，优选人源化抗体或人类抗体。
[0134]
作为本发明的抗rgma中和抗体，具体而言，可举出下述(a)～(l)的抗体，各自的制造方法可以使用专利文献2-4中记载的方法。
[0135]
可举出选自(a)～(l)中的抗体：(a)抗rgma中和抗体(该抗rgma中和抗体还进一步包含将序列号36、37和39作为表位的抗体)，包含轻链可变区以及重链可变区，该轻链可变区含有包含序列号5中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号6中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含序列号7中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号8中记载的氨基酸序列的hcdr1、包含序列号9中记载的氨基酸序列的hcdr2和包含序列号10中记载的氨基酸序列的hcdr3，
[0136]
(b)抗rgma中和抗体(该抗rgma中和抗体还进一步包含将序列号36、37和38作为表位的抗体)，包含轻链可变区以及重链可变区，该轻链可变区含有包含序列号11中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号12中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含序列号13中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号14中记载的氨基酸序列的hcdr1、包含序列号15中记载的氨基酸序列的hcdr2和在氨基酸序列中包含sfg的hcdr3，
[0137]
(c)包含轻链可变区以及重链可变区的抗rgma中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号17中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号18中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含序列号19中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号20中记载的氨基酸序列的hcdr1、包含序列号21中记载的氨基酸序列的hcdr2和包含序列号22中记载的氨基酸序列的hcdr3，
[0138]
(d)包含轻链可变区以及重链可变区的抗rgma中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号23中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号24中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含序列号25中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号26中记载的氨基酸序列的hcdr1、包含序列号27中记载的氨基酸序列的hcdr2和包含序列号28中记载的氨基酸序列的hcdr3，
[0139]
(e)抗rgma中和抗体(该抗rgma中和抗体还进一步包含将序列号16作为表位的抗体)，包含轻链可变区以及重链可变区，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含序列号31中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的hcdr1、包含序列号33
中记载的氨基酸序列的hcdr2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的hcdr3，
[0140]
(f)抗rgma中和抗体(该抗rgma中和抗体还进一步包含将序列号16作为表位的抗体)，包含轻链可变区以及重链可变区，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含序列号35中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的hcdr1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的hcdr2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的hcdr3，
[0141]
(g)抗rgma中和抗体(该抗rgma中和抗体还进一步包含将序列号16作为表位的抗体)，包含轻链可变区以及重链可变区，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含序列号40中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的hcdr1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的hcdr2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的hcdr3，
[0142]
(h)抗rgma中和抗体(该抗rgma中和抗体还进一步包含将序列号16作为表位的抗体)，包含轻链可变区以及重链可变区，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含序列号41中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的hcdr1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的hcdr2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的hcdr3，
[0143]
(i)抗rgma中和抗体(该抗rgma中和抗体还进一步包含将序列号16作为表位的抗体)，包含轻链可变区以及重链可变区，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含序列号42中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的hcdr1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的hcdr2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的hcdr3，
[0144]
(j)抗rgma中和抗体(该抗rgma中和抗体还进一步包含将序列号16作为表位的抗体)，包含轻链可变区以及重链可变区，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含序列号43中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的hcdr1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的hcdr2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的hcdr3，
[0145]
(k)抗rgma中和抗体(该抗rgma中和抗体还进一步包含将序列号16作为表位的抗体)，包含轻链可变区以及重链可变区，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含序列号44中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的hcdr1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的hcdr2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的hcdr3，以及
[0146]
(l)抗rgma中和抗体(该抗rgma中和抗体还进一步包含将序列号16作为表位的抗体)，包含轻链可变区以及重链可变区，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的lcdr1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的lcdr2和包含序列号45中记载的氨基酸序列的lcdr3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的hcdr1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的hcdr2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的hcdr3。
[0147]
这些之中，特别优选可举出(a)记载的抗体。
[0148]
本发明的抗rgma中和抗体的制造方法可以使用现有的一般使用的制造方法。抗原可以直接用于免疫，也可以制成与载体蛋白的复合物而使用。抗原与载体蛋白的复合物的
制备可以使用戊二醛、碳二亚胺、马来酰亚胺活性酯等缩合剂。载体蛋白可例示牛血清白蛋白、甲状腺球蛋白、血蓝蛋白、klh等。
[0149]
作为进行免疫的哺乳动物，可举出小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔子、猫、狗、猪、山羊、马或牛等，接种方法可举出皮下给药、肌肉给药或腹腔内给药。在给药时，可以与完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂混合而给药，给药通常每2～5周各进行1次。由免疫后的动物的脾脏或淋巴结得到的抗体产生细胞与骨髓瘤(myeloma)细胞进行细胞融合，以杂交瘤的形式被分离。作为骨髓瘤细胞，可以使用来自哺乳动物、例如来自小鼠、大鼠、人类等的骨髓瘤细胞。
[0150]
＜多克隆抗体＞
[0151]
多克隆抗体例如可以通过将如上所述的抗原与根据需要的弗氏佐剂(freund's adjuvant)一起对如上所述的哺乳动物进行免疫，从而从由该免疫敏化动物得到的血清取得。
[0152]
＜单克隆抗体＞
[0153]
具体而言，单克隆抗体可以按照下述方式取得。即，将如上所述的抗原作为免疫原，将该免疫原与根据需要的弗氏佐剂(freund's adjuvant)一起对如上所述的哺乳动物的皮下、肌肉内、静脉内、足垫内或腹腔内注射1～多次或者进行移植，从而施加免疫敏化。通常，从初次免疫开始每约1～14天进行1～4次免疫，从最终免疫起约1～5天后，从经免疫敏化的该哺乳动物取得抗体产生细胞。
[0154]
单克隆抗体可以使用本领域技术人员周知的方法得到(例如“current protocols in molecular biology”(john wiley&sons(1987))、antibodies:alaboratory manual,ed.harlow and david lane,cold spring harbor laboratory(1988))。
[0155]
分泌单克隆抗体的“杂交瘤”的制备可按照和milstein等人的方法(自然(nature),256,495,1975)和依据其的修饰方法来进行。即，通过使由经免疫敏化的哺乳动物取得的脾脏等中所含的抗体产生细胞与来自哺乳动物、优选小鼠、大鼠或人类的没有自身抗体产生能力的骨髓瘤细胞进行细胞融合来制备。
[0156]
作为细胞融合中所使用的骨髓瘤细胞，可以使用例如来自小鼠的myeloma p3/x63-ag8.653(653)、p3/nsi/1-ag4-1(ns-1)、p3/x63-ag8.u1(p3u1)、sp2/0-ag14(sp2/o、sp2)、pai、f0或bw5147，来自大鼠的myeloma 210rcy3-ag.2.3.，来自人类的myeloma u-266ar1、gm1500-6tg-a1-2、uc729-6、cem-agr、d1r11或cem-t15等。
[0157]
作为融合促进剂，可举出聚乙二醇等，通常可以通过使用20～50％左右浓度的聚乙二醇(平均分子量1000～4000)在20～40℃、优选30～37℃的温度下，抗体产生细胞数与骨髓瘤细胞数的比通常为1：1～10：1左右，反应约1～10分钟左右，从而实施细胞融合。
[0158]
产生单克隆抗体的杂交瘤克隆的筛选可以通过将杂交瘤在例如微量滴定板中进行培养，通过elisa等免疫化学的方法测定孔的培养上清液的免疫抗原的反应性而进行。
[0159]
抗体产生杂交瘤细胞的筛选中，除进行与rgma蛋白质的结合分析外，还进行该抗体是否阻碍本发明的rgma活性的评价。通过这些筛选方法，能够选择本发明的抗rgma中和抗体。
[0160]
从包含产生目标抗体的杂交瘤的孔中进一步通过极限稀释法进行克隆，能够得到克隆体。杂交瘤的挑选、育种通常添加hat(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)，在包含10～20％牛
胎儿血清的动物细胞用培养基中进行。
[0161]
由杂交瘤的单克隆抗体的制造可以通过将杂交瘤在体外培养或者使其在小鼠、大鼠等哺乳动物的腹水中等体内进行增殖，从所得到的培养上清液或哺乳动物的腹水中进行分离而进行。
[0162]
在体外培养的情况下，可以根据进行培养的细胞种类的特性和培养方法等的各种条件，使杂交瘤增殖、维持和保存，使用适于在培养上清液中产生单克隆抗体的营养培养基。营养培养基可举出公知的营养培养基或由基本培养基制备的营养培养基等。
[0163]
作为基本培养基，例如可举出ham’f12培养基、mcdb153培养基或者低钙mem培养基等低钙培养基以及mcdb104培养基、mem培养基、d-mem培养基、rpmi1640培养基、asf104培养基或rd培养基等高钙培养基等，该基本培养基可以根据目的含有例如血清、激素、细胞因子和/或各种无机或有机物质等。
[0164]
单克隆抗体的分离、纯化可以通过将上述的培养上清液或腹水供给到饱和硫酸铵、优球蛋白沉淀法、己酸法、辛酸法、离子交换色谱法(deae或de52等)、抗免疫球蛋白柱或蛋白质a柱等亲和柱色谱等而进行。具体而言，单克隆抗体的纯化只要使用已知的方法作为免疫球蛋白的纯化法即可，例如，可以通过硫酸铵分级法、peg分级法、乙醇分级法、利用阴离子交换体、进一步使用rgma蛋白质的亲和色谱等手段而容易地实现。
[0165]
单克隆抗体也可以通过噬菌体展示法而取得。在噬菌体展示法中，使用目标免疫原对从任意的噬菌体抗体库所挑选的噬菌体进行筛选，选择对免疫原具有期望的结合性的噬菌体。接下来，对噬菌体中所含的抗体对应序列进行分离或序列决定，基于所分离的序列或所决定的序列信息来构建包含编码抗体或抗原结合结构域的核酸分子的表达载体。然后，通过培养该表达载体经转染的细胞株，能够产生单克隆抗体。通过使用人类抗体库作为噬菌体抗体库，能够产生具有期望的结合性的人类抗体。
[0166]
＜核酸分子＞
[0167]
编码本发明的抗rgma中和抗体或其抗原结合片段的核酸分子例如可以通过以下的方法而得到。首先，使用市售的rna提取试剂盒，由杂交瘤等的细胞制备全rna，使用随机引物等，通过逆转录酶合成cdna。接下来，在已知的人类抗体重链基因、轻链基因的可变区中，通过将分别保存的序列的寡核苷酸用于引物的pcr法使编码抗体的cdna扩增。对于编码恒定区的序列，可以通过使用pcr法将已知的序列进行扩增而得到。dna的碱基序列可以通过编入到序列决定用质粒中等并通过常规方法来决定。
[0168]
或者，通过化学合成可变区或其部分序列并与包含恒定区的序列结合，从而也能够得到编码本发明的单克隆抗体的dna。
[0169]
该核酸分子可以为编码所有重链和轻链的恒定区和可变区的核酸分子，也可以为仅编码重链和轻链的可变区的核酸分子。编码所有恒定区和可变区时的重链和轻链的恒定区的碱基序列优选为nucleic acids research vol.14,p1779,1986、the journal of biological chemistry vol.257,p1516,1982和cell vol.22,p197,1980中记载的碱基序列。
[0170]
＜功能改变抗体＞
[0171]
抗rgma中和抗体的功能改变抗体可以通过如下所述的方法来制备。例如，如果使用破坏α1,6-岩藻糖转移酶(fut8)基因的cho细胞作为宿主细胞来制造本技术的抗rgma中
和抗体，则可得到糖链的岩藻糖含量降低而提高细胞杀伤功能的抗体，如果将导入有fut8基因的cho细胞作为宿主细胞来制造，则可得到低细胞杀伤功能的抗体(国际公开第2005/035586号、国际公开第2002/31140号、国际公开第00/61739号)。另外，通过改变fc区的氨基酸残基，从而能够调节补体活化功能(美国专利第6737056号、美国专利第7297775号、美国专利第7317091号)。进而，通过使用提高了对作为fc受体的1种的fcrn的结合的fc区域的变异体，能够实现血中半衰期的延长(桥口周平等，生物化学，2010、vol.82(8),p710)。这些功能改变抗体可以采用基因工程来制造。通过使用提高了与作为fc受体的1种的fcrn的结合的fc区域的变异体，能够实现血中半衰期的延长(桥口周平等，生物化学，2010、vol.82(8),p710)。这些功能改变抗体可以采用基因工程来制造。
[0172]
＜偶联抗体＞
[0173]
作为本发明的抗rgma中和抗体的改变分子，可举出偶联抗体。作为偶联抗体，可举出以化学或基因工程方式在抗rgma中和抗体结合聚乙二醇(peg)等非肽性聚合物、放射性物质、毒素、低分子化合物、细胞因子、生长因子(tgf-β、ngf、神经营养蛋白等)、白蛋白、酶、其它抗体等本技术的抗rgma中和抗体以外的功能分子而成的偶联抗体。
[0174]
在结合peg作为功能分子的情况下，peg可以非限定地使用分子量2000至100000da、更优选10000至50000da的peg，可以为直链型，也可以为分支型。peg例如通过使用nhs活性基团而能够结合于抗rgma中和抗体的氨基酸的n末端氨基等。
[0175]
在使用放射性物质作为功能分子的情况下，可使用
131
i、
125
i、
90
y、
64
cu、
99
tc、
77
lu或
211
at等。放射性物质能够通过氯胺t法等而直接结合于抗rgma中和抗体。
[0176]
在使用毒素作为功能分子的情况下，可以使用细菌毒素(例如白喉毒素)、植物毒素(例如蓖麻毒蛋白)、低分子毒素(例如格尔达霉素)、美登素和卡奇霉素等。
[0177]
在使用低分子化合物作为功能分子的情况下，可举出道诺霉素、阿霉素、甲氨蝶呤、丝裂霉素、新抑癌素、长春地辛和fitc等荧光色素等。
[0178]
在使用酶作为功能分子的情况下，可以使用荧光素酶(例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶；美国专利第4737456号)、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶(例如，辣根过氧化物酶(hrpo))、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环式氧化酶(例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶等)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。
[0179]
作为将毒素、低分子化合物或酶化学结合时使用的连接子，可举出二价自由基(例如亚烷基、亚芳基、杂亚芳基)、-(cr2)no(cr2)
n-(r为任意的取代基、n为正整数)表示的连接子、烷氧基的重复单元(例如聚亚乙基氧基、peg、聚亚甲基氧基等)和烷基氨基(例如聚亚乙基氨基、jeffamine(商标))、以及二酸酯和酰胺(可举出琥珀酸酯、琥珀酰胺、二甘醇酸酯、丙二酸酯和己酰胺等)。使功能分子结合的化学修饰方法已经在该领域中建立(d.j.king.,applications and engineering of monoclonal antibodies.,1998t.j.international ltd,monoclonal antibody-based therapy of cancer.,1998marcel dekker inc；chari et al.,cancer res.,1992vol152:127；liu et al.,proc natl acad sci usa.,1996vol 93:8681)。
[0180]
＜抗原结合片段＞
[0181]
在本发明的实施方式中，抗体的“抗原结合片段”是指如上所述的抗体的具有抗原
结合性的一部分区域，具体而言，可举出f(ab')2、fab'、fab、fv(variable fragment of antibody)、二硫键fv、单链抗体(scfv)以及它们的聚合物等，进而，抗原结合片段包含以化学或基因工程方式结合了聚乙二醇(peg)等非肽性聚合物、放射性物质、毒素、低分子化合物、细胞因子、生长因子(tgf-β、ngf、神经营养蛋白等)、白蛋白、酶、其它抗体等本技术的抗rgma中和抗体以外的功能分子的偶联片段。
[0182]“f(ab')
2”和“fab'”是指通过利用作为蛋白分解酶的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶等对免疫球蛋白进行处理而制造，且在存在于铰链区中的2条重链间的二硫键前后被消化而生成的抗体片段。例如，如果利用木瓜蛋白酶对igg进行处理，则在存在于铰链区中的2条重链间的二硫键的上游被切断，能够制造由vl(轻链可变区)和cl(轻链恒定区)构成的轻链以及由vh(重链可变区)和chγ1(重链恒定区中的γ1区域)构成的重链片段在c末端区域通过二硫键而结合的相同的2个抗体片段。将这2个相同的抗体片段分别称为fab。另外，如果利用胃蛋白酶对igg进行处理，则在存在于铰链区中的2条重链间的二硫键的下游被切断，能够制造比上述2个fab在铰链区连接的抗体片段稍大的抗体片段。将该抗体片段称为f(ab')2。
[0183]
＜嵌合抗体＞
[0184]
作为本发明的抗rgma中和抗体的优选的方式，可举出嵌合抗体。作为“嵌合抗体”，可例示可变区为来自非人类动物(小鼠、大鼠、仓鼠、鸡等)的免疫球蛋白的可变区、恒定区为来自人免疫球蛋白的恒定区的嵌合抗体。例如，可以将抗原对小鼠进行免疫，从该小鼠单克隆抗体的基因中切出与抗原结合的可变区，与来自人骨髓的抗体恒定区结合而制作。来自人免疫球蛋白的恒定区根据igg(igg1、igg2、igg3、igg4)、igm、iga(iga1、iga2)、igd和ige等同型而各自具有固有的氨基酸序列，本发明中的重组嵌合抗体的恒定区可以为属于任一同型的人免疫球蛋白的恒定区。优选为人igg的恒定区。可以使用如此制作的嵌合抗体的基因来制作表达载体。利用该表达载体将宿主细胞进行转化，从而得到嵌合抗体产生转化细胞，通过对该转化细胞进行培养，从而从培养上清液中得到目标嵌合化抗体。
[0185]
＜人源化抗体＞
[0186]
作为本发明的抗rgma中和抗体的其它优选的方式，可举出人源化抗体。本发明中的“人源化抗体”是仅将小鼠等非人类动物抗体的抗原结合位点(cdr、互补决定区)的dna序列移植(cdrgrafting)到人类抗体基因而成的抗体。例如，可以参照日本特表平4-506458号公报和日本专利2912618号说明书等中记载的方法来制作。具体而言，是指一种人源化抗体，其特征在于，其cdr的一部分或全部为来自非人类哺乳动物(小鼠、大鼠、仓鼠等)的单克隆抗体的cdr，其可变区的构架区为来自人免疫球蛋白的可变区的构架区，且其恒定区为来自人免疫球蛋白的恒定区。
[0187]
本发明中的人源化抗体例如可以按照以下方式来制造。但是，当然并不限定于这样的制造方法。
[0188]
例如，来自小鼠单克隆抗体的重组人源化抗体可以参照日本特表平4-506458号公报和日本特开昭62-296890号公报等，以基因工程方式来制作。即，从产生小鼠单克隆抗体的杂交瘤分离小鼠重链cdr部分的dna和小鼠轻链cdr部分的dna，从人免疫球蛋白基因分离除人重链cdr以外的全部区域的人重链基因和除人轻链cdr以外的全部区域的人轻链基因。
[0189]
将移植了分离出的小鼠重链cdr部分的dna的人重链基因以能够表达的方式导入到适当的表达载体中，同样地将移植了分离出的小鼠轻链cdr部分的dna的人轻链基因以能
够表达的方式导入到适当的另1个表达载体中。或者也可以将移植了小鼠的cdr的人的重链和轻链基因以能够表达的方式导入到同一表达载体中。利用如此制作的表达载体将宿主细胞进行转化，从而得到人源化抗体产生转化细胞，通过对该转化细胞进行培养而从培养上清液中得到目标人源化抗体。
[0190]
＜人类抗体＞
[0191]
作为本发明的抗rgma中和抗体的其它优选的方式，可举出人类抗体。人类抗体是包含构成免疫球蛋白的重链的可变区和重链的恒定区以及轻链的可变区和轻链的恒定区的全部区域为来自编码人免疫球蛋白的基因的免疫球蛋白的抗体，可以将人类抗体基因导入到小鼠中来制作。具体而言，例如可以至少将人免疫球蛋白基因编入到小鼠等人类以外的哺乳动物的基因座中而制作转基因动物，并利用抗原对该转基因动物进行免疫敏化，从而与上述多克隆抗体或单克隆抗体的制作方法同样地制造。
[0192]
例如，产生人类抗体的转基因小鼠可以按照nature genetics,vol.7,p.13-21,1994；nature genetics,vol.15,p.146-156,1997；日本特表平4-504365号公报；日本特表平7-509137号公报；国际公开wo94/25585号公报；nature,vol.368,p.856-859,1994；以及日本特表平6-500233号公报等中记载的方法来制作。更具体而言，可举出humab(注册商标)小鼠(medarex,princeton nj)、kmtm小鼠(kirin pharma company,japan)、km(fcγriib-ko)小鼠等。
[0193]
作为本发明的抗rgma中和抗体，具体而言，可举出具有在重链可变区包含特定的氨基酸序列的cdr且具有在轻链可变区包含特定的氨基酸序列的cdr的抗rgma中和抗体(优选为上述(a)～(l)的抗体)。
[0194]
应予说明，只要具有与rgma的结合能力且可维持抑制(中和)rgma的活性这样的本发明的抗体的特性，则在抗rgma中和抗体(优选为上述(a)～(l)的抗rgma中和抗体)的氨基酸序列中也可以取代、缺失、附加或插入1或多个氨基酸(1～20个、1～10个或1～5个，优选1～2个)。这样的取代、缺失、附加可以导入于cdr，但优选导入于cdr以外的区域。另外，为了维持本发明的特性，该氨基酸取代优选为保守取代。
[0195]
在氨基酸序列中包含取代、缺失等的本发明的抗rgma中和抗体(优选为上述(a)～(l)的抗rgma中和抗体)的氨基酸序列例如为如下氨基酸序列：氨基酸序列改变后的重链可变区与改变前的氨基酸序列具有90％以上(更优选为95％、96％、97％、98％、99％以上)的％同源性，且氨基酸序列改变后的轻链可变区与改变前的氨基酸序列具有90％以上(更优选为95％、96％、97％、98％、99％以上)的％同源性。
[0196]
在本发明中，sirna是指能够抑制靶基因(在本发明中为rgma基因)的表达的短的双链rna。只要作为抑制本发明的rgma活性的sirna发挥作用，则碱基序列、长度(碱基长度)没有特别限定，优选小于约30个碱基，更优选为约19～27个碱基，进一步优选为约21～25个碱基。
[0197]
在本发明中，shrna是指通过在单链rna中部分包含廻文状的碱基序列而在分子内形成双链结构，由在3'末端具有突出部的短的发夹结构(hairbin)构成的约20个碱基对以上的分子。这样的shrna在导入到细胞内后，在细胞内分解成约20个碱基(代表性为例如21个碱基、22个碱基、23个碱基)的长度，能够与sirna同样地抑制靶基因的表达。
[0198]
在本发明中，上述sirna和shrna只要能够抑制rgma基因的表达，则可以为任何形
态。
[0199]
在本发明中，sirna或shrna可以人工进行化学合成。另外，例如可以使用t7rna聚合酶和t7启动子，由模板dna在体外合成反义和正义的rna。反义寡核苷酸只要是与rgma基因的dna序列中连续的5至100个碱基序列互补或杂交的核苷酸即可，可以为dna或rna中的任一者。另外，只要不影响功能，则也可以进行修饰。反义寡核苷酸可以按照常规方法进行合成，例如，可以利用市售的dna合成装置而容易地合成。
[0200]
优选的序列可以使用通常的选择方法来选择，作为本发明中的sirna或shrna，可以通过评价功能性rgma的表达抑制来确认。
[0201]
＜急性期的视神经脊髓炎＞
[0202]
视神经脊髓炎的病期在临床上可大致分为“急性期”(在本发明中为包含急性恶化期的概念)和“慢性期”这2种。
[0203]
这里，“急性期”是指出现视神经炎和脊髓炎等视神经脊髓炎的症状，且这些症状持续或症状加重(恶化)的时期。另外，在这样的时期，可通过利用mri在部分病变处看出钆造影效果；或通过脊髓液检查看出细胞数增多或蛋白质上升，因此，也能够以这些为参考来判断急性期。
[0204]
另一方面，“慢性期”是指通过治疗使症状的恶化好转，症状得到改善而呈稳定的时期。另外，在这样的时期，在mri中钆造影效果消失，因此，也能够以此为参考来判断慢性期。
[0205]
本发明中的视神经脊髓炎的急性期是指上述的“急性期”，不仅是发生初次发作的视神经脊髓炎的急性期的病征，第二次以后发生视神经脊髓炎的复发时的急性期的病征也包含在本发明中。
[0206]
另外，关于视神经脊髓炎，对于治疗对象(优选为哺乳动物，特别是人类)，到其症状的高峰为止约为8.5天左右(范围：2天～63天)(参考文献：flanagan et al.ann neurol.2016mar；79(3):437-47等)。因此，本发明中的急性期的期间从视神经脊髓炎的发病起通常为1个月以内。
[0207]
本发明中的视神经脊髓炎是指视神经脊髓炎相关疾病(neuromyelitis optica spectrum disorder,nmosd)，是包含视神经脊髓炎的国际诊断基准(wingerchuket al.neurology,2015；8582):177-189)所举出的抗aqp4抗体阳性的视神经脊髓炎相关疾病(nmosd)和抗aqp4抗体阴性的视神经脊髓炎相关疾病(nmosd)中的任一者的概念。其中，在本发明中，优选为抗aqp4抗体阳性的视神经脊髓炎相关疾病。
[0208]
本发明中的治疗对象(优选为哺乳动物，特别是人类)以患有视神经脊髓炎相关疾病(nmosd)的患者，优选为患有抗aqp4抗体阳性的视神经脊髓炎相关疾病(nmosd)的患者为对象，可以对这些患者给药本发明的急性期的视神经脊髓炎的预防或治疗剂。
[0209]
另外，对于本发明中的急性期的视神经脊髓炎，作为患者的主症状之1，多伴有疼痛，因此，在本发明中，可以将rgma抑制物质、优选为抗rgma中和抗体作为视神经脊髓炎中可见的疼痛症状的预防或治疗剂用于伴有这样的疼痛的患者。
[0210]
应予说明，在本发明的急性期的视神经脊髓炎的预防或治疗剂以及预防或治疗方法中所说明的事项全部适用于本发明的视神经脊髓炎中可见的疼痛症状的预防或治疗剂、以及预防或治疗方法的说明。
[0211]
这里，“治疗”是包含对治疗对象、优选为哺乳动物、特别是人类的疾病的任意的治疗，包含阻止疾病和症状的恶化，并消除、治愈、减轻或缓和这样的疾病和症状。
[0212]
另外，“预防”是包含对治疗对象、优选为哺乳动物、特别是人类防止或抑制上述疾病的发生。进而，本发明中的“预防”是包含对治疗对象、优选为哺乳动物、特别是人类缓解或防止反复复发的上述疾病的复发的“预防复发”。
[0213]
＜药物组合物＞
[0214]
本发明中的急性期的视神经脊髓炎的预防或治疗剂通常是全身或局部地以口服或非口服的形式进行给药。
[0215]
本发明中的急性期的视神经脊髓炎的预防或治疗剂以rgma抑制物质为有效成分，可以适当地配合药学上允许的载体或添加剂而制剂化。如此制剂化的药物组合物能够以口服或非口服的形式给药。具体而言，可以制成片剂、包衣片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、液剂、悬浮剂、乳剂等口服剂，另外，可以制成注射剂、输液、栓剂、软膏、贴剂等非口服剂。对于载体或添加剂的配合比例，只要基于医药品领域中通常采用的范围适当地设定即可。可以配合的载体或添加剂没有特别限定，可举出例如水、生理盐水、其它水性溶剂、水性或油性基剂等各种载体、例如赋形剂、粘合剂、ph调节剂、崩解剂、吸收促进剂、润滑剂、着色剂、矫味剂、香料等各种添加剂。
[0216]
在rgma抑制物质为抗rgma中和抗体、其功能改变抗体、其偶联抗体或它们的抗原结合片段的情况下，优选作为与药学上允许的载体一起制剂化的注射剂或输液以非口服给药途径、例如静脉内、肌肉内、皮肤内、腹腔内、皮下或局部进行给药。
[0217]
例如，包含抗rgma中和抗体的注射剂或输液可以以溶液、悬浮液或乳浊液的形式使用。作为其溶剂，可以使用例如注射用蒸馏水、生理盐水、葡萄糖溶液和等渗液(例如氯化钠、氯化钾、甘油、甘露醇、山梨糖醇、硼酸、硼砂、丙二醇等的溶液)等。
[0218]
进而，包含这样的抗rgma中和抗体的注射剂或输液还可以包含稳定剂、助溶剂、悬浮剂、乳化剂、舒缓剂、缓冲剂、保存剂、防腐剂、ph调节剂等。
[0219]
作为稳定剂，可以使用例如白蛋白、球蛋白、明胶、甘露醇、葡萄糖、葡聚糖、乙二醇、丙二醇、抗坏血酸、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、edta钠、柠檬酸钠、二丁基羟基甲苯等。
[0220]
作为助溶剂，可以使用例如醇(例如乙醇等)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇等)、非离子性表面活性剂(例如polysolvate80(注册商标)、hco-50等)等。
[0221]
作为悬浮剂，可以使用例如单硬脂酸甘油酯、单硬脂酸铝、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、月桂基硫酸钠等。
[0222]
作为乳化剂，可以使用例如阿拉伯胶、海藻酸钠、黄蓍胶等。
[0223]
作为舒缓剂，可以使用例如苄醇、氯丁醇、山梨糖醇等。
[0224]
作为缓冲剂，可以使用例如磷酸缓冲液、乙酸缓冲液、硼酸缓冲液、碳酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、tris缓冲液等。
[0225]
作为保存剂，可以使用例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、氯丁醇、苄醇、苯扎氯铵、脱氢乙酸钠、依地酸钠、硼酸、硼砂等。
[0226]
作为防腐剂，可以使用例如苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。
[0227]
作为ph调节剂，可以使用例如盐酸、氢氧化钠、磷酸、乙酸等。
[0228]
在rgma抑制物质为核酸(sirna、shrna、反义寡核苷酸等)的情况下，可以以非病毒
载体或病毒载体的形式进行给药。在非病毒载体形式的情况下，可以利用使用脂质体导入核酸分子的方法(脂质体法、hvj-脂质体法、阳离子脂质体法、脂质体转染法、脂转染胺(lipofectamine)法等)、微注射法、用基因枪(gene gun)将核酸分子与载体(金属颗粒)一起移入到细胞中的方法等。例如，在使用病毒载体将sirna或shrna对生物体进行给药的情况下，可以利用重组腺病毒、逆转录病毒等病毒载体。通过对经无毒化的逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、辛德比斯病毒、仙台病毒、sv40等dna病毒或rna病毒导入表达sirna或shrna的dna，使细胞或组织感染该重组病毒，从而能够将基因导入到细胞或组织内。
[0229]
如此得到的制剂通过对例如人类或其它哺乳动物(例如大鼠、小鼠、兔子、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴等)给药其有效量，能够预防或治疗急性期的视神经脊髓炎。给药量可以考虑目的、疾病的严重程度、患者的年龄、体重、性别、病史、有效成分的种类等而适当地设定。例如在有效成分为抗rgma中和抗体的情况下，将具有约65～70kg的体重的平均人类作为对象时，优选每1天为0.02mg～4000mg左右，更优选为0.1mg～200mg左右。每1天的总给药量可以为单一给药量，也可以为分批给药量。
[0230]
＜与其它药剂或治疗的并用＞
[0231]
在本发明中，急性期的视神经脊髓炎的预防或治疗剂能够与其它有用于治疗视神经脊髓炎的药剂或治疗并用而给药。
[0232]
作为能够与本发明中的急性期的视神经脊髓炎的预防或治疗剂并用而使用的其它药剂或治疗，可举出例如血浆交换和/或免疫球蛋白制剂的静脉内给药、霉酚酸酯、利妥昔单抗、依库珠单抗和/或萨特利珠单抗的给药。这样的其它药剂或治疗可以为对治疗视神经脊髓炎之类的中枢神经系统的损伤或对延迟中枢神经系统损伤的恶化有效的具有生物学活性的其它药剂或治疗。
[0233]
例如，具有生物学活性的其它药剂可以为皮质类固醇、(静脉内)免疫球蛋白制剂或抗淋巴球制剂、霉酚酸酯、利妥昔单抗、依库珠单抗和/或萨特利珠单抗。在优选的实施方式中，患者通过静脉内免疫疗法(例如皮质类固醇，例如甲泼尼龙这样的(合成)糖皮质激素)进行治疗。因此，具有生物学活性的其它药剂也可以为皮质类固醇，例如甲泼尼龙这样的(合成)糖皮质激素。具有生物学活性的其它药剂被给药至静脉内。对于其它药剂或治疗，例如在对类固醇无响应的患者(例如经过类固醇治疗后仅能够确认到未充分抑制中枢神经系统炎症的情况)的情况下，也可以进行血浆交换。因此，患者可以为类固醇输注无效的患者，也可以任意地接受血浆交换。
[0234]
上述其它药剂或治疗可以在本发明的急性期的视神经脊髓炎的预防或治疗剂的给药前或给药后进行给药或实施，另外，也可以同时给药或实施。
[0235]
实施例
[0236]
以下，举出实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明并不限定于这些实施例。
[0237]
[实施例1]抗rgma中和抗体对急性期的视神经脊髓炎的效果
[0238]
利用急性期重症型nmo大鼠模型来评价抗rgma中和抗体对临床症状恶化的治疗效果。应予说明，作为抗rgma中和抗体，将包含本说明书中记载的(a)的氨基酸序列(序列号5～10)的抗rgma中和抗体用于实验。
[0239]
(1-1)大鼠的nmo诱导的步骤
[0240]
依据现有报导(kurosawa k,et al.,acta neuropathol commun.2015；3:82)进行急性期重症型nmo大鼠模型的制作。实验使用雌性lewis大鼠。作为前炎症环境诱发与破坏血液脊髓屏障(bscb)的刺激，进行了对中枢抗原mbp的免疫导入。作为mbp，使用guinea pig brain myelin basic protein，利用pbs以成为1mg/ml的方式使其溶解，以等量与包含1mg/ml的死结核菌h37ra的完全弗氏佐剂混合，通过超声处理来制作乳液。将制作的乳液(200μl/head)皮下给药至背部2处，在10天后，对神经分数为1以下的个体以3mg/kg的用量单次腹腔内给药抗aqp4抗体(小鼠抗aqp4单克隆抗体e5415a)，诱导抗aqp4抗体依赖性的临床症状恶化。
[0241]
(1-2)神经分数评价
[0242]
基于以下的判断基准对神经症状进行评分，以尾部和两后肢的神经分数的合计值为神经分数(0～6分)而用于评价。尾部分数：0:无麻痹症状；1:不完全麻痹；2:完全麻痹；各后肢的分数：0:无症状；1:不完全麻痹；2:后肢拖行的后肢完全麻痹。神经评分在盲测下实施，每天1次进行神经症状的评价直到抗rgma中和抗体给药后第13天(抗aqp4抗体给药后第14天)。
[0243]
(1-3)分组和抗rgma中和抗体的给药
[0244]
以抗aqp4抗体给药次日的神经分数与体重的平均值的偏差在组间成为最小的方式分成2组，以10mg/kg的用量单次尾静脉内给药抗rgma中和抗体或同型对照抗体(palivizumab)。抗rgma中和抗体给药组、同型对照抗体给药组均以6只构成。
[0245]
(1-4)结果
[0246]
将单次给药抗rgma中和抗体对急性期重症型nmo大鼠模型的临床急性恶化的效果示于图1。在抗aqp4抗体给药次日静脉内给药抗rgma中和抗体或同型对照抗体，每天1次进行神经症状的评价直到抗aqp4抗体给药后第14天。在抗aqp4抗体给药次日给药抗rgma中和抗体的组的神经分数与给药同型对照抗体的组相比，在整个观察期间均显示低值，给药抗aqp4抗体后第2-8天和第2-14天的平均分数显著降低(第2-8天平均分数，2.13
±
0.41vs.3.70
±
0.20for isotype control igg-treated rats，p＜0.01，mann-whitney u检验)；第2-14天平均分数，1.90
±
0.43vs.3.05
±
0.19for isotype control igg-treated rats，p＜0.05，mann-whitney u检验)。
[0247]
由以上的结果可知，rgma抑制物质、特别是抗rgma中和抗体对急性期的视神经脊髓炎的临床恶化显示治疗效果。
[0248]
[实施例2]抗rgma中和抗体对血液脊髓屏障的破坏的效果
[0249]
使用能制作局限于脊髓节段的bscb破坏的teae小鼠，通过钆造影mri来研究抗rgma中和抗体对bscb破坏的治疗效果。应予说明，作为抗rgma中和抗体，将包含本说明书中记载的(a)的氨基酸序列(序列号5～10)的抗rgma中和抗体用于实验。
[0250]
(2-1)teae小鼠的制作
[0251]
使用雌性c57/bl6j小鼠。利用pbs以成为2mg/ml的方式使myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide fragment 35-55,rat,mouse(mevgwyrspfsrvvhlyrngk(序列号46)；mog
35-55
，sigma-aldrich)溶解，以等量与包含5mg/ml的死结核菌h37ra的完全弗氏佐剂混合，通过超声处理来制作乳液。将制作的乳液各以100μl皮下给药至背部2处(200μl/head)，进行mog免疫导入。在约21天后，对第8胸椎下的胸髓深
度0.5-0.8mm注入1.5μl的细胞因子混合溶液(750ng tumor necrosis factor-α,1μg interferon-γ)，在刚注入后和2天后，对尾静脉内给药200ng百日咳毒素(pertussis toxin)，诱导teae。
[0252]
(2-2)神经分数评价
[0253]
神经分数基于现有报导的判断基准(参照tanabe s,fujita y,ikuma k,yamashita t.inhibiting repulsive guidance molecule-a suppresses secondary progression in mouse models of multiple sclerosis.cell death dis.2018；9(11):1061)，在盲测下进行评价。
[0254]
(2-3)使用钆造影核磁共振图像法(magnetic resonance imaging，mri)的bscb破坏评价
[0255]
使用biospec 117/11(bruker)取得钆造影剂(omniscan,daiichi sankyo)给药前后的经时t1增强图像(dynamic contrast-enhanced mri；dce-mri)，根据t1信号强度变化而定量性地评价作为bscb破坏的指标的钆向脊髓内的漏出。在七氟醚麻醉下安装体温维持装置，经由留置于尾静脉内的导管，以0.25mmol/kg的用量急速给药钆造影剂。dce-mri是针对有效视野(field of view；fov)26
×
26mm设定200
×
200的收集基质(acquisition matrix)，以胸髓细胞因子注入部位为中心，以0.8mm的切片厚度和间隔共取得11张轴位剖面的图像。另外，重复时间(repetition time；tr)设定为500ms，回声时间(echo time；te)设定为18ms，激发次数(number of excitation；nex)设定为4次，以约10分钟经时共取得6张图像(每1张约100秒)。
[0256]
图像以dicom形式输出，使用fiji(http://fiji.sc/)进行解析。为了排除脑脊髓液的t1信号的影响，在脊髓内设定感兴趣区(region of interest；roi)，基于式(1)算出各时间点的脊髓内的t1信号强度的增加率(t1signal enhancement ratio；ser)。各个体的钆脊髓内漏出强度(total gd influx rate)如式(2)所示，以ser每单位时间的斜率作为钆流入速度，使用microsoft excel 2016(microsoft)的slope函数求出，作为11个切片的总和而算出。
[0257][0258][0259]
根据正常小鼠的研究结果，式(2)中的slope(ser0):ser(10),0:10)的值小于0.02时，作为分析误差从式(2)的加算对象中排除。
[0260]
(2-4)分组和抗rgma中和抗体的给药
[0261]
以注入细胞因子7天后的钆漏出的定量值在组间为均匀的方式分成2组，以每周2次以10mg/kg的用量对尾静脉内给药抗rgma中和抗体或同型对照抗体(palivizumab)。抗rgma中和抗体给药组以10只构成，同型对照抗体给药组以9只构成，神经分数评价和mri解析在同一个体中实施。
[0262]
(2-5)结果
[0263]
将抗rgma中和抗体对teae小鼠急性期的bscb破坏和神经症状的恢复效果示于图
2。以7天后的定量值为基准，在同一个体中纵向地算出注入细胞因子7、14、21天后的钆漏出强度的变化率，解析抗rgma中和抗体对bscb破坏的恢复效果。在细胞因子注入7天后的时间点所产生的钆脊髓内漏出通过重复给药抗rgma中和抗体而得到显著抑制(细胞因子注入14天后的时间点，p＜0.001，bonferroni multiple comparison test)，确认到bscb破坏的早期恢复(图2的a)。另外，在同一个体所取得的神经分数也得到显著抑制，对神经症状也确认到早期恢复(图2的b)。
[0264]
将teae小鼠急性期的钆脊髓内漏出强度和神经症状严重程度的相关性示于图3。细胞因子注入7天后的钆脊髓内漏出强度与神经症状疾病严重程度确认到高度正相关(r＝0.831,p＜0.001)，在14天后也确认到正相关(r＝0.549,p＜0.05)。表示bscb破坏的严重程度规定了神经症状的严重程度。
[0265]
由以上的结果可知，rgma抑制物质、特别是抗rgma中和抗体通过对bscb破坏的修复促进作用而显示对急性期的视神经脊髓炎的药效。
[0266]
[实施例3]抗rgma中和抗体对血液脊髓屏障破坏的治疗效果
[0267]
通过免疫组织化学染色解析血液脊髓屏障破坏所致的大鼠igg的脊髓内漏出，评价抗rgma中和抗体对急性期重症型nmo大鼠的血液脊髓屏障破坏的治疗效果。
[0268]
(3-1)急性期重症型nmo大鼠模型的制作
[0269]
实验使用雌性lewis大鼠。在mbp免疫后第10天，对神经分数为1以下的个体以3mg/kg的用量单次腹腔内给药抗aqp4抗体(小鼠抗aqp4单克隆抗体e5415a)，诱导nmo病征。
[0270]
(3-2)分组和抗rgma中和抗体的给药
[0271]
以抗aqp4抗体给药次日的神经分数与体重的平均值的偏差在组间成为最小的方式分成2组，以10mg/kg的用量对尾静脉内给药抗rgma中和抗体或同型对照抗体(palivizumab)。抗rgma中和抗体处置组和同型对照抗体处置组以各6只构成，健康无处置组以4只构成。
[0272]
(3-3)免疫组织化学染色
[0273]
在抗aqp4抗体给药后第4天进行解剖。去血后采取脊髓，在4℃在4％多聚甲醛中后固定1天。后固定后，进行基于蔗糖取代的冷冻保护处置，然后，对oct化合物包埋组织片。以30μm薄切而制作冷冻切片，使用alxa488标记驴抗大鼠igg抗体(1：500，thermo fisher scientific公司)进行免疫组织染色。染色切片的摄影使用倒立型荧光显微镜olympus ix83，使用图像解析软件image j software测定大鼠igg阳性面积相对于脊髓剖面的比例(％大鼠igg阳性面积)。
[0274]
(3-4)结果
[0275]
将抗rgma中和抗体对大鼠igg漏出的脊髓漏出的效果示于图4。通过在nmo发病后次日给药抗rgma中和抗体，作为血液脊髓屏障破坏指标的大鼠igg的脊髓内漏出得到显著抑制。
[0276]
由以上的结果表明，rgma抑制物质、特别是抗rgma中和抗体对急性期的视神经脊髓炎的效果是对血液脊髓屏障破坏的修复促进作用。
[0277]
[实施例4]抗rgma中和抗体对nmo病征的疼痛症状的效果
[0278]
对急性期重症型nmo大鼠反复给药抗rgma中和抗体，评价抗rgma中和抗体对持续性疼痛的效果。
[0279]
(4-1)急性期重症型nmo大鼠模型的制作
[0280]
实验使用雌性lewis大鼠。在mbp免疫后第10天对神经分数为1以下的个体以3mg/kg的用量单次腹腔内给药抗aqp4抗体(小鼠抗aqp4单克隆抗体e5415a)，诱导nmo病征。
[0281]
(4-2)疼痛相关行为的评价
[0282]
使用基于von frey刺激的up-down法(参照chaplan,s.r.,bach,f.w.,pogrel,j.w.,chung,j.m.,yaksh,t.l.,quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw,j.neurosci.methods,53,55-63(1994))求出将后肢抬起的50％逃避反应阈值(g)，评价疼痛。解析使用两侧后肢的50％逃避反应阈值(g)的平均值。
[0283]
(4-3)分组和抗rgma中和抗体的给药
[0284]
以抗aqp4抗体给药次日的神经分数与体重的平均值的偏差在组间成为最小的方式分成2组，以10mg/kg的用量，每周1次对尾静脉内给药抗rgma中和抗体或同型对照抗体(palivizumab)。解析组是抗rgma中和抗体处置组、同型对照抗体处置组、健康无处置组共计3组，均以6只构成。在神经症状恶化期，确认到因后肢的脱力而无法进行von frey刺激的个体，因此成为抗aqp4抗体给药后第4天的抗rgma中和抗体处置组为5例、抗aqp4抗体给药后第7天的同型对照抗体处置组为2例、抗rgma中和抗体处置组为3例的数据集。
[0285]
(4-4)结果
[0286]
将抗rgma中和抗体对疼痛的抑制效果示于图5。从nmo发病后次日给药抗rgma中和抗体的组与给药同型对照抗体的组相比，从50％逃避反应阈值降低中的恢复快，在抗aqp4抗体给药后第18天和第21天确认到50％逃避反应阈值的显著上升。
[0287]
由以上的结果可知，rgma抑制物质、特别是抗rgma中和抗体显示对急性期的视神经脊髓炎的疼痛症状的效果。
[0288]
[实施例5]抗rgma中和抗体对脊髓的粒细胞浸润的抑制效果
[0289]
通过免疫组织化学染色来解析抗rgma中和抗体对急性期重症型nmo大鼠脊髓的粒细胞浸润的抑制效果。
[0290]
(5-1)急性期重症型nmo大鼠模型的制作
[0291]
实验使用雌性lewis大鼠。在mbp免疫后第10天，对神经分数为1以下的个体以3mg/kg的用量单次腹腔内给药抗aqp4抗体(小鼠抗aqp4单克隆抗体e5415a)，诱导nmo病征。
[0292]
(5-2)分组和抗rgma中和抗体的给药
[0293]
以抗aqp4抗体给药次日的神经分数与体重的平均值的偏差在组间成为最小的方式分成2组，以10mg/kg的用量对尾静脉内给药抗rgma中和抗体或同型对照抗体(palivizumab)。抗rgma中和抗体处置组和同型对照抗体处置组以各6只构成，健康无处置组以4只构成。
[0294]
(5-3)免疫组织化学染色
[0295]
在抗aqp4抗体给药后第4天进行解剖。去血后采取脊髓，在4℃在4％多聚甲醛中后固定1天。后固定后，进行基于蔗糖取代的冷冻保护处置，然后，对oct化合物包埋组织片。以30μm薄切而制作冷冻切片，，使用兔抗大鼠粒细胞血清(1：5000，lifespan biosciences公司)作为1次抗体，使用alxa488标记驴抗兔igg抗体(1：500，thermo fisher scientific公司)作为2次抗体进行免疫组织染色。染色切片的摄影使用倒立型荧光显微镜olympus ix83，使用图像解析软件image j software测定粒细胞阳性面积相对于脊髓剖面的比例
(％粒细胞阳性面积)。
[0296]
(5-4)结果
[0297]
将抗rgma中和抗体对急性期重症型nmo大鼠脊髓的粒细胞浸润的抑制效果示于图6。通过在nmo发病后次日给药抗rgma中和抗体，nmo大鼠脊髓的粒细胞浸润得到显著抑制。
[0298]
由以上的结果判明，rgma抑制物质、特别是抗rgma中和抗体抑制急性期的视神经脊髓炎的病征中可见的粒细胞的浸润。认为由于对粒细胞的浸润抑制作用有助于对急性期的视神经脊髓炎的效果表达，因此，表明rgma抑制物质、特别是抗rgma中和抗体通过粒细胞浸润抑制作用而显示对急性期的视神经脊髓炎的效果。
[0299]
[实施例6]脊髓的aqp4脱落部位的rgma表达
[0300]
通过nmo大鼠脊髓的免疫组织化学染色来检测急性期重症型nmo大鼠模型中的rgma的表达。
[0301]
(6-1)急性期重症型nmo大鼠模型的制作
[0302]
实验使用雌性lewis大鼠。利用pbs以成为1mg/ml的方式使、使guinea pig brain myelin basic protein溶解，以等量与包含1mg/ml的死结核菌h37ra的完全弗氏佐剂混合，通过超声处理来制作乳液。皮下给药mbp乳液(200μl/head)(mbp免疫)，在10天后，对神经分数为1以下的个体以3mg/kg的用量单次腹腔内给药抗aqp4抗体(小鼠抗aqp4单克隆抗体e5415a)，诱导nmo病征。
[0303]
(6-2)免疫组织化学染色
[0304]
在抗aqp4抗体给药后第1天进行解剖。去血后采取脊髓，在4℃在4％多聚甲醛中后固定1天。后固定后，进行基于蔗糖取代的冷冻保护处置，然后，对oct化合物包埋组织片。以30μm薄切而制作冷冻切片，使用山羊抗rgma抗体(1：100，r&d公司)和兔抗aqp4抗体(1：1000，cell signaling technology公司)作为1次抗体，使用alxa488标记驴抗山羊igg抗体(1：500，thermo fisher scientific公司)和alxa647标记驴抗兔igg抗体(1：500，thermo fisher scientific公司)作为2次抗体，进行双重免疫组织染色。染色切片的摄影使用倒立型荧光显微镜olympus ix83。
[0305]
(6-3)结果
[0306]
将急性期重症型nmo大鼠脊髓切片的免疫组织化学染色图像示于图7。在nmo病变的aqp4脱落部位确认到rgma的强表达。
[0307]
＜序列表的说明＞
[0308]
序列号1：人rgma前体蛋白质的氨基酸序列
[0309]
序列号2：小鼠rgma前体蛋白质的氨基酸序列
[0310]
序列号3：大鼠rgma前体蛋白质的氨基酸序列
[0311]
序列号4：人rgma基因的dna序列
[0312]
序列号5：抗rgma中和抗体r116a3的lcdr1的氨基酸序列
[0313]
序列号6：抗rgma中和抗体r116a3的lcdr2的氨基酸序列
[0314]
序列号7：抗rgma中和抗体r116a3的lcdr3的氨基酸序列
[0315]
序列号8：抗rgma中和抗体r116a3的hcdr1的氨基酸序列
[0316]
序列号9：抗rgma中和抗体r116a3的hcdr2的氨基酸序列
[0317]
序列号10：抗rgma中和抗体r116a3的hcdr3的氨基酸序列
[0318]
序列号11：抗rgma中和抗体r70e的lcdr1的氨基酸序列
[0319]
序列号12：抗rgma中和抗体r70e的lcdr2的氨基酸序列
[0320]
序列号13：抗rgma中和抗体r70e的lcdr3的氨基酸序列
[0321]
序列号14：抗rgma中和抗体r70e的hcdr1的氨基酸序列
[0322]
序列号15：抗rgma中和抗体r70e的hcdr2的氨基酸序列
[0323]
序列号16：人rgma的表位的氨基酸序列
[0324]
序列号17：抗rgma中和抗体5f9的lcdr1的氨基酸序列
[0325]
序列号18：抗rgma中和抗体5f9的lcdr2的氨基酸序列
[0326]
序列号19：抗rgma中和抗体5f9的lcdr3的氨基酸序列
[0327]
序列号20：抗rgma中和抗体5f9的hcdr1的氨基酸序列
[0328]
序列号21：抗rgma中和抗体5f9的hcdr2的氨基酸序列
[0329]
序列号22：抗rgma中和抗体5f9的hcdr3的氨基酸序列
[0330]
序列号23：抗rgma中和抗体8d1的lcdr1的氨基酸序列
[0331]
序列号24：抗rgma中和抗体8d1的lcdr2的氨基酸序列
[0332]
序列号25：抗rgma中和抗体8d1的lcdr3的氨基酸序列
[0333]
序列号26：抗rgma中和抗体8d1的hcdr1的氨基酸序列
[0334]
序列号27：抗rgma中和抗体8d1的hcdr2的氨基酸序列
[0335]
序列号28：抗rgma中和抗体8d1的hcdr3的氨基酸序列
[0336]
序列号29：抗rgma中和抗体ae12-1的lcdr1的氨基酸序列
[0337]
序列号30：抗rgma中和抗体ae12-1的lcdr2的氨基酸序列
[0338]
序列号31：抗rgma中和抗体ae12-1的lcdr3的氨基酸序列
[0339]
序列号32：抗rgma中和抗体ae12-1的hcdr1的氨基酸序列
[0340]
序列号33：抗rgma中和抗体ae12-1的hcdr2的氨基酸序列
[0341]
序列号34：抗rgma中和抗体ae12-1的hcdr3的氨基酸序列
[0342]
序列号35：抗rgma中和抗体ae12-1y的lcdr3的氨基酸序列
[0343]
序列号36：人rgma的表位的氨基酸序列
[0344]
序列号37：人rgma的表位的氨基酸序列
[0345]
序列号38：人rgma的表位的氨基酸序列
[0346]
序列号39：人rgma的表位的氨基酸序列
[0347]
序列号40：抗rgma中和抗体ae12-1f的lcdr3的氨基酸序列
[0348]
序列号41：抗rgma中和抗体ae12-1h的lcdr3的氨基酸序列
[0349]
序列号42：抗rgma中和抗体ae12-1l的lcdr3的氨基酸序列
[0350]
序列号43：抗rgma中和抗体ae12-1v的lcdr3的氨基酸序列
[0351]
序列号44：抗rgma中和抗体ae12-1i的lcdr3的氨基酸序列
[0352]
序列号45：抗rgma中和抗体ae12-1k的lcdr3的氨基酸序列
[0353]
序列号46：大鼠
·
小鼠mog的氨基酸序列(35-55)
[0354]
产业上的可利用性
[0355]
本发明中，rgma抑制物质对急性期的视神经脊髓炎的预防或治疗是有用的，另外，对视神经脊髓炎的疼痛症状的预防或治疗是有用的，因此，在医药品产业中具有高利用价值。