用于治疗血细胞减少症或减少血细胞减少症的持续时间的佛波醇酯组合物和方法与流程

用于治疗血细胞减少症或减少血细胞减少症的持续时间的佛波醇酯组合物和方法
1.本技术是申请号为201580071387.2、申请日为2015年11月3日、名称为“用于治疗血细胞减少症或减少血细胞减少症的持续时间的佛波醇酯组合物和方法”的专利申请的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及佛波醇酯用于治疗血细胞减少症的用途。具体地，本发明涉及佛波醇酯如12-o-十四酰基佛波醇-13-乙酸酯(tpa)或佛波醇-12-肉豆蔻酸酯(pma)和g-csf在肿瘤疾病患者中治疗和减轻中性粒细胞减少症和血小板减少症的用途。本发明也涉及佛波醇酯如tpa和促红细胞生成素(epo)用于治疗患者的贫血症的用途。


背景技术：

3.植物长久以来已用于许多医药目的。世界卫生组织(who)估计目前有40亿人(世界人口的80％)使用草药药品进行某些方面的初级卫生保健(who情况说明书n
°
134情况说明书，2008年12月)。然而，具有医药效果的特定化合物可能难以以商业规模分离并再生。另外，尽管可将活性化合物从植物中分离出来，但植物的其它部分诸如矿物质、维生素、挥发油、糖苷、生物碱、生物类黄酮和其它物质也可能参与活性成分的功能发挥或该植物的已知医药作用，从而对基于植物的药剂的使用、纯化和商业化提出了挑战。
4.佛波醇是二萜类的巴豆萜烷家族的一种天然的植物来源的有机化合物。其于1934年作为来自巴豆(croton tiglium)(东南亚本土大戟科家族的一种多叶灌木)的种子的巴豆油的水解产物首次被分离出来。佛波醇的各种酯具有重要的生物学性质，包括已报道的模拟二酰甘油并活化蛋白激酶c(pkc)以及调节下游细胞信号传导途径(包括有丝分裂原活化蛋白激酶(mapk)途径)的能力。另外认为佛波醇酯结合嵌合蛋白(chimaerin)，ras激活剂rasgrp，和囊泡启动蛋白munc-13(brose n,rosenmund c.,jcell sci；115:4399-411(2002))。一些佛波醇酯还诱导核因子-κb(nf-κb)。佛波醇酯最显著的生理学性质是已报道的其充当肿瘤促进剂的能力(blumberg,1988；goel,g等，int,journal of toxicology 26,279-288(2007))。
5.12-o-十四酰基佛波醇-13-乙酸酯(tpa)，也称为佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(pma)，是一种在致癌模型中用作多种细胞系和原代细胞的分化和/或凋亡诱导剂的佛波醇酯。tpa也报道引起骨髓功能受到化疗抑制的患者中循环白细胞和中性粒细胞的增加(han z.t.等proc.natl.acad.sci.95,5363-5365(1998))。然而，由于多种因素，包括在与皮肤接触时的腐蚀性反应及对于其潜在毒性的顾虑，tpa尚未显示为有效的化疗辅助剂。事实上，由于佛波醇酯在蛋白激酶c的活化中发挥关键作用，蛋白激酶c的活化触发导致炎性反应及肿瘤形成的各种细胞反应(goel等，int,journal of toxicology 26,279-288(2007))，佛波醇酯一般被排除在肿瘤(包括癌症)的可能治疗候选物之外。
6.癌症是全世界主要的死亡原因之一，2008年中造成760万人死亡(全部死亡的大约
13％)(globocan 2008(iarc)(section of cancer information(8/12/2011))。世界上，在2008年中诊断了12,662,600个新病例(2008(globocan 2008(iarc))。仅在美国，在2011年中诊断了1,596,670个癌症新病例(cancer facts&figures
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2011,american cancer society(acs),atlanta,georgia,2011)。
7.癌症治疗一般包括手术、化疗、激素疗法和/或放疗的组合以根除患者中的肿瘤细胞。但是，当前的肿瘤治疗具有多种缺点，包括效力不足和不能耐受的副作用。例如，手术可能由于患者的健康原因而是禁忌的。另外，可能困难的是获得肿瘤周围的清晰边界，导致一些肿瘤组织遗留和疾病复发的可能性增加。
8.一般地，化疗剂通过杀死快速分裂的细胞发挥作用，快速分裂是大多数癌细胞的主要性质之一。但是，它们也伤害快速分裂的正常细胞如骨髓、消化道和毛囊中的细胞。它们通常具有显著的副作用，包括严重的恶心、骨髓抑制和免疫抑制。
9.电离辐射通过损伤暴露组织的dna起作用。但是，尽管是靶向的，电离辐射仍然可损伤正常细胞以及肿瘤，且可以具有副作用如贫血症、恶心和呕吐、食欲不良、体重减轻、便秘、腹泻、脱发和不育。
10.对于许多患者，当前疗法的毒性副作用降低他们的生活质量达到他们直接停止服药的程度。对于其它患者，治疗方案如此复杂和不方便使得顺应性受到限制。其它患者最初经历良好的结果，但尽管具有对治疗方案的完全顺应性，他们仍经历疾病的复发。存在着对于新的和更有效的肿瘤治疗及控制当前肿瘤(包括癌症)治疗的副作用的明确需要。


技术实现要素：

11.本发明涉及包含与g-csf组合的式i的佛波醇酯的组合物及使用与g-csf组合的式i的佛波醇酯的方法。本文所述的组合物和方法有效地治疗患有肿瘤病症的患者中的中性粒细胞减少症和血小板减少症和减少其持续时间。
12.在一个实施方案中，本发明涉及治疗血细胞减少症的方法，包括向需要的哺乳动物受试者施用与粒细胞集落刺激因子(g-csf)组合的式i的佛波醇酯(如本文所述的)，其药学上可接受的盐、异构体、对映异构体、溶剂合物、水合物、多形体或前药，其中r1和r2选自氢、羟基、及其取代的衍生物，r3选自氢、及其取代的衍生物。
13.在特定的实施方案中，本发明涉及治疗中性粒细胞减少症和/或血小板减少症的方法，包括向需要的哺乳动物受试者施用式i的佛波醇酯，其药学上可接受的盐、异构体、对映异构体、溶剂合物、水合物、多形体或前药与粒细胞集落刺激因子(g-csf)的组合。
14.在另一实施方案中，本发明涉及治疗血细胞减少症的方法，包括向需要的哺乳动物受试者施用与红细胞生成素(epo)组合的式i的佛波醇酯，其药学上可接受的盐、异构体、对映异构体、溶剂合物、水合物、多形体或前药。
15.在特定的实施方案中，本发明涉及治疗贫血症的方法，包括向需要的哺乳动物受试者施用与红细胞生成素(epo)组合的式i的佛波醇酯，其药学上可接受的盐、异构体、对映
异构体、溶剂合物、水合物、多形体或前药。
16.在本发明的方法中，式i的r1或r2是r1或r2的另一个是和式i的r3是氢。
17.特别地，在本发明的方法中，佛波醇酯是佛波醇13-丁酸酯、佛波醇12-癸酸酯、佛波醇13-癸酸酯、佛波醇12,13-二乙酸酯、佛波醇13,20-二乙酸酯、佛波醇12,13-二苯甲酸酯、佛波醇12,13-二丁酸酯、佛波醇12,13-二癸酸酯、佛波醇12,13-二己酸酯、佛波醇12,13-二丙酸酯、佛波醇12-肉豆蔻酸酯、佛波醇13-肉豆蔻酸酯、佛波醇12,13,20-三乙酸酯、12-脱氧佛波醇13-当归酸酯、12-脱氧佛波醇13-当归酸酯20-乙酸酯、12-脱氧佛波醇13-异丁酸酯、12-脱氧佛波醇13-异丁酸酯-20-乙酸酯、12-脱氧佛波醇13-苯基乙酸酯、12-脱氧佛波醇13-苯基乙酸酯20-乙酸酯、12-脱氧佛波醇13-十四酸酯、佛波醇12-顺芷酸酯13-癸酸酯、12-脱氧佛波醇13-乙酸酯、佛波醇12-乙酸酯或佛波醇13-乙酸酯。
18.在优选的实施方案中，佛波醇酯是12-o-十四酰基佛波醇-13-乙酸酯(tpa)。
19.本发明的方法可以进一步包括施用至少一种第二或辅助治疗剂。
20.在本发明的某些实施方案中，g-csf在协同施用方案中与所述式i的佛波醇酯的施用同时、在其之前或之后施用于所述受试者。
21.在本发明的某些实施方案中，epo在协同施用方案中与所述式i的佛波醇酯的施用同时、在其之前或之后施用于所述受试者。
22.本发明的方法包括每天或每隔一天以包含约10-1500μg的所述式i的佛波醇酯的有效量施用式i的佛波醇酯。
23.在某些实施方案中，本发明的方法包括每天或每隔一天以包含约150-500μg的所述式i的佛波醇酯或衍生化合物的有效量施用式i的佛波醇酯。
24.在本发明的优选实施方案中，式i的佛波醇酯和g-csf的组合提高哺乳动物受试者的嗜中性粒细胞绝对计数(anc)到高于1500/mm3。
25.在另一优选实施方案中，式i的佛波醇酯和g-csf的组合提高哺乳动物受试者的血小板水平到高于100,000/μl。
26.在本发明的某些优选实施方案中，式i的佛波醇酯和epo的组合提高全血细胞计数中测量的全血细胞计数(cbc)水平至少10％。
27.在另一优选实施方案中，其中式i的佛波醇酯和epo的组合提高哺乳动物受试者的血红蛋白水平到高于正常血红蛋白水平。
28.在优选的实施方案中，本发明的方法包括治疗或减轻患有急性髓性白血病(aml)的人中的血细胞减少症如中性粒细胞减少症、血小板减少症和/或贫血症。
29.在另一实施方案中，本发明涉及包含式i的佛波醇酯和g-csf的组合物。
30.在优选的实施方案中，式i的佛波醇酯以足以治疗血细胞减少症(如中性粒细胞减少症和/或血小板减少症)或减少血细胞减少症的持续时间的有效量存在。
31.在优选的实施方案中，本发明的组合物包含tpa作为佛波醇酯，且tpa和g-csf以治疗血细胞减少症(如中性粒细胞减少症和/或血小板减少症)或减少血细胞减少症的持续时
间的有效量存在。在特别优选的实施方案中，有效量可以是治疗中性粒细胞减少症和/或血小板减少症或者减少中性粒细胞减少症和/或血小板减少症的持续时间的协同有效量。
32.本发明还涉及包含式i的佛波醇酯和epo的组合物。
33.在优选的实施方案中，式i的佛波醇酯以足以治疗血细胞减少症(如贫血症)或减少血细胞减少症的持续时间的有效量存在。
34.在优选的实施方案中，本发明的组合物包含tpa作为佛波醇酯，且tpa和epo以治疗血细胞减少症(如贫血症)或减少血细胞减少症的持续时间的有效量存在。在特别优选的实施方案中，有效量可以是治疗贫血症或减少贫血症的持续时间的协同有效量。
35.在另一实施方案中，中性粒细胞减少症、血小板减少症和/或贫血症与肿瘤的治疗有关。这些肿瘤可以是恶性的或良性的。在一些实施方案中，肿瘤可以是实体或非实体癌症。在其它实施方案中，肿瘤可以是复发的。在另一实施方案中，肿瘤可以是难治的。
36.示例性的肿瘤包括，但不限于造血系统恶性肿瘤/骨髓障碍，其包括，但不限于白血病，包括急性髓性白血病(aml)、慢性髓性白血病(cml)、慢性髓性白血病急变期、骨髓增生异常和骨髓增生综合症；淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；皮下腺癌；卵巢畸胎癌；肝癌；乳腺癌；骨癌；肺癌；胰腺癌；非小细胞肺癌；和前列腺癌。适合于使用本文描述的方法和组合物治疗的其它肿瘤病症包括其它癌症障碍和病症，包括各种类型的实体肿瘤。
37.在再另一实施方案中，如本文所述的佛波醇酯和佛波醇酯的衍生物可以用于调节细胞信号传导途径。这样的调节可以具有多种结果，例如，在一些实施方案中，使用包含佛波醇酯和佛波醇酯的衍生物的组合物可以提高哺乳动物受试者中的白细胞计数。在另一实施方案中，包含佛波醇酯和/或佛波醇酯衍生物的组合物可以改变哺乳动物受试者中的th1细胞因子的释放。在进一步的实施方案中，包含佛波醇酯和/或佛波醇酯衍生物的组合物可以改变哺乳动物受试者中的白介素2(il-2)的释放。在另外的实施方案中，包含佛波醇酯和/或佛波醇酯衍生物的组合物可以改变哺乳动物受试者中的干扰素的释放。在再另一实施方案中，包含佛波醇酯和/或佛波醇酯衍生物的组合物可以改变erk磷酸化的速率。
38.本发明通过提供可用于治疗血细胞减少症(如中性粒细胞减少症、血小板减少症和贫血症)或减少血细胞减少症的持续时间的新的和令人惊异的意料之外的方法和组合物实现前述目的并满足额外的目的和优点。
附图说明
39.专利或申请文件包含至少一幅以彩色绘制的图形。具有彩图的这一专利或专利申请公开的拷贝在提出要求并支付必要费用时由专利局提供。
40.图1阐明通过tpa和gcsf的组合实现的协同效应。tpa刺激上游干细胞分化成下游干细胞，而gcsf刺激下游干细胞。tpa也刺激下游干细胞。中性粒细胞是粒细胞的一种类型。
41.图2阐明tpa和gcsf的组合产生比单独的tpa或g-csf更强的刺激效应。关于以下术语的以下缩写用于图2和整个本公开中。
42.cfc
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集落形成细胞
43.cfu-e
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集落形成单位-红系
44.cfu-g
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集落形成单位-粒细胞
45.cfu-gemm
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集落形成单位-粒细胞、红细胞、巨噬细胞、巨核细胞
46.cfu-gm
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集落形成单位-粒细胞、巨噬细胞
47.cfu-m
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集落形成单位-巨噬细胞
48.bfu-e
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爆式集落形成单位-红系
49.本发明的上述和其它目标、特征、方面和优点将从以下详细说明中变得显而易见。
具体实施方式
50.定义
51.为方便起见，在进一步描述本发明之前，说明书、实施例和所附权利要求中使用的某些术语收集在此。这些定义应当参照本公开的其余部分来阅读且应当如本领域技术人员所理解的。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本领域技术人员理解的相同含义。
52."g-csf"或"gcsf"称为粒细胞集落刺激因子或集落刺激因子3("csf3")，且可以在本文中互换使用。"g-csf"、"gcsf"或"csf3"是刺激骨髓产生粒细胞和干细胞并将它们释放到血流中的糖蛋白。
53."epo"称为红细胞生成素，其是控制红细胞生成或红血细胞产生的糖蛋白激素。
54.诱导治疗在本文中用于指疾病(通常癌症)治疗的第一阶段。例如，急性髓性白血病的诱导治疗的目的是产生骨髓中的完全缓解和恢复到正常血细胞计数。
55.巩固治疗在本文中用于指在癌症于初始治疗后消失之后给予的治疗，且用于预防癌症的复发。巩固治疗用于杀死可能遗留在身体中的任何癌细胞。
56.血细胞减少症本文中用于指血细胞数量的减少，且包括低红细胞计数(贫血症)、低白细胞计数(白细胞减少症或中性粒细胞减少症)、低血小板计数(血小板减少症)或其组合(全血细胞减少症)，以及低粒细胞计数(粒细胞减少症)。
57.红细胞计数(rbc)是在1mm3的血液中能够携带血红蛋白的红细胞的数目。对于男性的正常rbc是4.5-6百万/mm3；对于女性为4-5.5百万/mm3。参见cytopenia-cancertype.blogspot.ca/2007/12/diagnosis-of-cytopenia.html。
58.白细胞计数(wbc)是全部五种类型的白细胞的总数。对于男性和女性的正常wbc是5,000-10,000/mm血液。参见cytopenia-cancertype.blogspot.ca/2007/12/diagnosis-of-cytopenia.html.
59.冠词"一(a)"和"一个(an)"在本文中用于指一个或多于一个(即，至少一个)该冠词的语法宾语。举例来说，"一元素"意思是一个元素或多于一个元素。
60.术语"包含"和"包括"以包括性的开放的含义使用，意思是可以包括另外的元素。
61.术语"基本上由
…
组成"用于限制元素到指明的那些和不实质地影响材料或步骤的基本和新型特性的那些。
62.术语"包括"在本文中用于指"包括但不限于"。"包括"和"包括但不限于"可互换使用。
63.通过所述方法治疗的"患者"、"受试者"或"主体(host)"可以指哺乳动物，如人和非人哺乳动物。
64.术语"药学上可接受的载体"是本领域公认的术语且指药学上可接受的材料、组合
物或媒介，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。这种载体在与所述组合物及其组分相容且对患者无害的意义上必须是"可接受的"。实例包括，但不限于粘合剂、填充剂、润滑剂、乳化剂、助悬剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、缓冲剂、湿润剂、崩解剂、泡腾剂及其它常规赋形剂和添加剂。
65.术语"治疗"是本领域公认的术语且指治愈以及改善或减轻任何病症或障碍的至少一种症状。
66.术语"治疗剂"或"药物"是本领域公认的术语且指作为在受试者中局部地或全身性地起作用的生物学、生理学或药理学上活性的化学部分。例如，治疗剂或药物在merck index、the physicians'desk reference和the pharmacological basis of therapeutics中描述。
67.术语"有效量"是治疗有效的，其在单一或多个单位剂型中。有效量是足以在哺乳动物(包括人)中提供治疗效果的量。例如，有效量可以是足以在受试者中可测量地治疗中性粒细胞减少症和/或血小板减少症或者减少/缩短其持续时间的量。有效量的另一实例是足以可测量地治疗贫血症或者减少/缩短其持续时间的量。用于提供治疗有效量的特定治疗剂或药物的剂量水平或量根据包括，但不限于哺乳动物/人的年龄、体重、性别、医疗状况及施用途径的因素而变化。式i的佛波醇酯化合物或者相关的或衍生的化合物(例如，包含有效浓度/量的tpa或者有效浓度/量的所选择的tpa的药学上可接受的盐、异构体、对映异构体、溶剂合物、多形体和/或前药的单位剂量)、g-csf或epo的有效量容易由本领域技术人员根据临床和患者特异性的因素确定。根据本发明的治疗有效量可以包括协同有效量。
68.血细胞减少症传统上分类为缺陷相关的(即，营养或激素缺陷的)、免疫介导的、基于bm衰竭的或特发性的血细胞减少症。参见valent,p.,hematology:485-491(2012)，其公开内容通过引用全文并入本文中。
69.癌症患者中血细胞减少症的诊断需要全血细胞计数(cbc)和任何血液和骨髓异常的鉴定，如贫血症、中性粒细胞减少症或血小板减少症。参见cytopenia-cancertype.blogspot.ca/2007/12/diagnosis-of-cytopenia.html。
70.化疗剂不利地影响骨髓细胞，且在各项治疗之前全血细胞计数(cbc)是必要的。对骨髓的作用是临时的且正常功能通常在4-10天内恢复，但白细胞具有1-3天的寿命；因此虽然循环中的那些wbc保持不受影响，但新的白细胞的缓慢产生造成感染风险增加的时期。参见cytopenia-cancertype.blogspot.ca/2007/12/diagnosis-of-cytopenia.html。如果白细胞产生在下一项治疗之前未恢复，则治疗被延迟直到细胞计数充分地增加。同上。成熟红细胞具有相对长的寿命(120天)，细胞产生通常在缺乏的症状出现之前恢复。同上。
71.贫血症是红细胞的缺乏，这减少到达身体中的所有细胞的氧量，从而所有组织和器官功能受损。贫血症产生包括重度疲劳、混乱、头晕、头痛、眩晕、注意力不集中、苍白(苍白的皮肤、甲床、牙龈、眼睑的内层)、快速心率(心动过速)和气促(呼吸困难)的症状。参见cytopenia-cancertype.blogspot.ca/2007/12/cytopenia-signs-and-symptoms.html。患有贫血症的个体建议休息和食用高铁的食物，且治疗可以包括帮助恢复红血供应的药物(如红细胞生成素)和压积红细胞(packed red blood cells)的输注。参见cytopenia-cancertype.blogspot.ca/2007/12/cytopenia-treatment.html。食品和药物管理局(fda)在2007年3月应对表明这些药物治疗可能在一些患者(例如，患有肾病的患者)中增加凝血、
中风和心脏病发作的风险的研究发布了关于这些药物的警告。同上。
72.中性粒细胞减少症是具有包括频繁和/或严重的细菌、病毒和/或真菌感染，发热及口喉溃疡的症状的白细胞缺乏。参见cytopenia-cancertype.blogspot.ca/2007/12/cytopenia-signs-and-symptoms.html。集落刺激因子(csf)可以指示用于加速白细胞的产生和缩短易感感染的时间。参见cytopenia-cancertype.blogspot.ca/2007/12/cytopenia-treatment.html。
73.血小板减少症是导致患者青肿和易于出血的血小板缺乏，且特征在于包括内衬口腔、鼻、结肠和阴道的粘膜中的出血的症状。参见cytopenia-cancertype.blogspot.ca/2007/12/cytopenia-signs-and-symptoms.html。其通过低于15,000-300,000/ml的正常血小板计数表征，且出血增加的风险通常在化疗疗程后10-14天达到峰值。同上。持久降低的血小板计数可以用血小板输注治疗。参见cytopenia-cancertype.blogspot.ca/2007/12/cytopenia-treatment.html。
74.生长因子(如epoetinαg-csf(粒细胞集落刺激因子；例如，非格司亭)和gm-csf(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子))是参与刺激红细胞和白细胞产生的物质的合成形式，但在指定这些药物治疗用于患有涉及骨髓的肿瘤的人时要加小心，因为生长因子可能刺激恶性细胞生长。参见cytopenia-cancertype.blogspot.ca/2007/12/cytopenia-treatment.html。与这些生长因子相关的副作用包括发热、疲劳、头晕、腹泻、恶心、呕吐、虚弱和感觉异常(刺痛感)(用依泊汀(epoetin)α)；及骨痛(用g-csf)。同上。
75.化疗和放疗两者减少癌症患者中血液形成干细胞的数目，但化疗剂具有更高的不良反应，因为它们以几种方式抑制骨髓功能
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损伤的程度与特定药物和使用的剂量相关。参见cytopenia-cancertype.blogspot.ca/2007/12/cytopenia-causes-and-risk-factors.html。
76.血细胞类型的缺陷可以损伤血液形成干细胞、抑制肾的红细胞生成素(刺激血细胞产生的激素)产生和通过诱导导致身体错误地将红细胞鉴别为外源体并破坏它们的免疫反应而引发红细胞破坏(溶血)的化疗剂导致。参见cytopenia-cancertype.blogspot.ca/2007/12/cytopenia-causes-and-risk-factors.html。但是，通过癌症治疗引起的贫血症、血小板减少症和中性粒细胞减少症通常在治疗疗程结束时缓解。参见cytopenia-cancertype.blogspot.ca/2007/12/cytopenia-treatment.html。
77.恶性肿瘤在直接侵入骨髓和抑制骨髓功能时也可以引起贫血症和其它血细胞减少症。参见cytopenia-cancertype.blogspot.ca/2007/12/cytopenia-causes-and-risk-factors.html。
78.本文所述的组合物和方法可以用于治疗哺乳动物受试者(包括人)的贫血症、中性粒细胞减少症和/或血小板减少症或者减少/缩短其持续时间。在一些实施方案中，哺乳动物受试者是患有肿瘤疾病的人。
79.使用与g-csf组合的以下式i的佛波醇酯治疗血细胞减少症(包括但不限于，中性粒细胞减少症和/或血小板减少症)的组合物和方法：
[0080][0081]
其中r1和r2可以是氢；羟基；其中烷基包含1-15个碳原子；其中低级烯基包含1-7个碳原子；及其取代的衍生物。r3可以是氢或及其取代的衍生物。本发明的方法和组合物还包括与g-csf组合用于治疗中性粒细胞减少症和/或血小板减少症的式i的组合物的任何药用盐、对映异构体、异构体、多形体、前药、水合物和溶剂合物。例如，式i的佛波醇酯与g-csf的组合也可用于减少或缩短中性粒细胞减少症和/或血小板减少症的持续时间。
[0082]
使用与epo组合的以下式i的佛波醇酯治疗血细胞减少症(包括但不限于，贫血症)的组合物和方法：
[0083][0084]
其中r1和r2可以是氢；羟基；其中烷基包含1-15个碳原子；
其中低级烯基包含1-7个碳原子；及其取代的衍生物。r3可以是氢或及其取代的衍生物。本发明的方法和组合物还包括与epo组合用于治疗贫血症的式i的化合物的任何药用盐、对映异构体、异构体、多形体、前药、水合物和溶剂合物。例如，式i的佛波醇酯与epo的组合也可用于减少或缩短贫血症的持续时间。
[0085]
在一些实施方案中，r1和r2中至少之一不是氢且r3是氢或及其取代的衍生物。在另一实施方案中，r1或r2是r1或r2中另一个是其中低级烷基是1-7碳的，且r3是氢。
[0086]
本文的式中的烷基、烯基、苯基和苄基可以是未取代的或被卤素，优选氯、氟或溴；硝基；氨基和/或相似类型的基团取代的。
[0087]
组合物和使用该组合物的方法包括式ii的佛波醇酯，如12-o-十四酰基佛波醇-13-乙酸酯(tpa)，与g-csf的组合：
[0088][0089]
用于治疗血细胞减少症，包括，但不限于中性粒细胞减少症和/或血小板减少症。例如，tpa与g-csf的组合也可用于减少或缩短中性粒细胞减少症和/或血小板减少症的持续时间。
[0090]
组合物和使用该组合物的方法包括式ii的佛波醇酯，如12-o-十四酰基佛波醇-13-乙酸酯(tpa)，与epo的组合:
[0091][0092]
用于治疗血细胞减少症，包括，但不限于贫血症。例如，tpa与epo的组合也可用于减少或缩短贫血症的持续时间。
[0093]
本发明的制剂和方法中有用的式i佛波醇酯及相关化合物和衍生物包括，但不限于所述化合物的其它药学上可接受的活性盐以及所述化合物的活性异构体、对映异构体、多形体、糖基化衍生物、溶剂合物、水合物和/或前药。用于本发明的组合物和方法中的佛波醇酯的示例性形式包括，但不限于佛波醇13-丁酸酯、佛波醇12-癸酸酯、佛波醇13-癸酸酯、佛波醇12,13-二乙酸酯、佛波醇13,20-二乙酸酯、佛波醇12,13-二苯甲酸酯、佛波醇12,13-二丁酸酯、佛波醇12,13-二癸酸酯、佛波醇12,13-二己酸酯、佛波醇12,13-二丙酸酯、佛波醇12-肉豆蔻酸酯、佛波醇13-肉豆蔻酸酯、佛波醇12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(也称为tpa或pma)、佛波醇12,13,20-三乙酸酯、12-脱氧佛波醇13-当归酸酯、12-脱氧佛波醇13-当归酸酯20-乙酸酯、12-脱氧佛波醇13-异丁酸酯、12-脱氧佛波醇13-异丁酸酯-20-乙酸酯、12-脱氧佛波醇13-苯基乙酸酯、12-脱氧佛波醇13-苯基乙酸酯20-乙酸酯、12-脱氧佛波醇13-十四酸酯、佛波醇12-顺芷酸酯13-癸酸酯、12-脱氧佛波醇13-乙酸酯、佛波醇12-乙酸酯和佛波醇13-乙酸酯。
[0094]
宽范围的哺乳动物受试者，包括人类受试者，适合于使用本发明的组合物和方法的治疗。这些受试者包括，但不限于患有疾病或病症(包括，但不限于肿瘤疾病)、化疗的副作用、放疗的副作用、前列腺增生、尿失禁、重症肌无力和肾脏疾病的个体。
[0095]
适合于根据本发明的方法用式i的佛波醇酯或式i佛波醇酯的衍生物(特别是tpa)与gcsf或epo组合治疗的哺乳动物受试者包括患有贫血症、中性粒细胞减少症和/或血小板减少症的受试者。适合于使用式i的佛波醇酯(特别是tpa)与gcsf或epo组合的治疗的这类受试者包括遭受疾病或障碍(包括，但不限于肿瘤疾病)的症状或者由肿瘤疾病的治疗引起的效应的那些受试者。
[0096]
适合于根据本发明的方法使用本文所述的组合物和方法(特别是tpa)治疗的另外的哺乳动物受试者(包括人)包括具有贫血症相关疾病或病症(包括，但不限于与肾衰竭或肾疾病相关的贫血症、与妊娠相关的贫血症、与营养不良相关的贫血症、恶性贫血、镰状细胞贫血、地中海贫血(thalassemia)、酒精中毒、骨髓相关贫血症(如白血病或淋巴瘤)、再生障碍性贫血(由病毒感染引起)、与药物治疗(如癌症药物治疗、hiv药物治疗、癫痫药物治疗、移植药物治疗、疟疾药物治疗、抗生素、抗真菌剂和抗组胺药)相关的贫血症、溶血性贫
血、与甲状腺问题相关的贫血症、与肝病相关的贫血症和自身免疫性疾病(如狼疮))的受试者或个体。
[0097]
适合于根据本发明的方法使用本文所述的组合物和方法(特别是tpa)治疗的另外的哺乳动物受试者(包括人)包括患有中性粒细胞减少症相关疾病或病症(包括，但不限于先天性中性粒细胞减少症(如kostmann's综合征)、周期性中性粒细胞减少症、特发性中性粒细胞减少症、自身免疫性中性粒细胞减少症和药物诱导的中性粒细胞减少症(如由癌症药物引起))的受试者或个体。
[0098]
适合于根据本发明的方法使用本文所述的组合物和方法(特别是tpa)治疗的另外的哺乳动物受试者(包括人)包括患有血小板减少症相关疾病或病症(包括，但不限于病毒感染(如细小病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒、水痘病毒、丙型肝炎病毒、eb病毒和hiv)、重症感染或脓毒症、药物诱导的血小板减少症(如由癌症药物、噻嗪、磺胺类抗生素、卡马西平、地高辛、奎宁、奎尼丁、醋氨酚、肝素和利福平(ripampin)引起的)、输血反应、风湿性病症(如系统性红斑狼疮)和特发性血小板减少性紫癜)的受试者或个体。这些和其它受试者通过向受试者施用足以治疗患有肿瘤疾病的哺乳动物受试者的贫血症、中性粒细胞减少症和/或血小板减少症和/或减少其持续时间的有效量的式i的佛波醇酯或式i佛波醇酯的衍生物而有效地预防性和/或治疗性地治疗。
[0099]
化疗是用抗肿瘤药物或这类药物的组合治疗癌症。化疗通过消弱快速分裂细胞(癌性细胞共同的特性)的繁殖而发挥作用。但是它不主动地区分同样快速分裂的健康细胞和癌细胞，因而具有多种副作用，例如但不限于，中性粒细胞减少症、贫血症和血小板减少症。
[0100]
适合于根据本发明的方法使用式i的佛波醇酯(特别是tpa)治疗的哺乳动物受试者另外包括，但不限于经历化疗的哺乳动物受试者。
[0101]
患有肿瘤疾病的哺乳动物受试者包括恶性肿瘤疾病如实体和非实体癌症。非实体癌症可以包括血液恶性肿瘤/骨髓障碍，包括但不限于，白血病，包括急性髓性白血病(aml)、慢性髓性白血病(cml)、慢性髓性白血病急变期、脊髓发育不良、骨髓增生综合征。实体癌症可以包括，但不限于淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、皮下腺癌、卵巢畸胎癌、肺癌、骨癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、口腔癌、非小细胞肺癌和前列腺癌。
[0102]
本发明的治疗有用的方法和制剂如上所述有效地使用各种形式的式i的佛波醇酯，包括所述化合物的任何活性的药学上可接受的盐以及活性异构体、对映异构体、多形体、溶剂合物、水合物、前药和/或其组合。式ii的tpa作为本文中以下实施例中的本发明说明性实施方案使用。
[0103]
在本发明的另外的方面中，提供了使用与一种或多种第二或辅助活性剂组合的有效量的式i的佛波醇酯或式i佛波醇酯的衍生物的组合制剂和方法，该第二或辅助活性剂与式i的佛波醇酯组合地配制或协同地施用以在受试者中产生有效的反应。
[0104]
式i的佛波醇酯化合物或式i佛波醇酯的衍生物与g-csf组合使用。具体地，g-csf与佛波醇酯，例如，tpa组合使用。
[0105]
式i的佛波醇酯化合物或式i佛波醇酯的衍生物与促红细胞生成素(epo)组合使用。具体地，epo与tpa组合使用。
[0106]
式i的佛波醇酯化合物或式i佛波醇酯的衍生物与g-csf组合使用。具体地，g-csf
与tpa组合使用。
[0107]
本文描述的组合物包含治疗中性粒细胞减少症和/或血小板减少症或减少其持续时间的有效量的g-csf和式i的佛波醇酯化合物或式i佛波醇酯的衍生化合物，包括其药学上可接受的盐、对映异构体、异构体、多形体、前药、水合物和溶剂合物。
[0108]
本文描述的组合物包含治疗贫血症或减少其持续时间的有效量的epo和式i的佛波醇酯化合物或式i佛波醇酯的衍生化合物，包括其药学上可接受的盐、对映异构体、异构体、多形体、前药、水合物和溶剂合物。
[0109]
本发明的组合物包含协同有效量的或有效地治疗中性粒细胞减少症和/或血小板减少症或减少其持续时间的协同组合的g-csf和式i的佛波醇酯化合物或式i佛波醇酯的衍生化合物，包括其药学上可接受的盐、对映异构体、异构体、多形体、前药、水合物和溶剂合物。本发明的组合物在患有肿瘤疾病的人和其它哺乳动物受试者中协同有效地治疗中性粒细胞减少症和/或血小板减少症或减少其持续时间。应用于包含g-csf和式i的佛波醇酯化合物或式i佛波醇酯的衍生化合物(包括其药学上可接受的盐、对映异构体、异构体、多形体、前药、水合物和溶剂合物)的本发明组合物的"协同有效量"有效地缩短中性粒细胞减少症和/或血小板减少症的持续时间，其有效地治疗中性粒细胞减少症和/或血小板减少症或减少其持续时间。由本发明的组合产生的效应导致高于单独的g-csf或式i的佛波醇酯化合物或式i佛波醇酯的衍生化合物或者其单独效应的总和的反应。
[0110]
协同有效量的式i的佛波醇酯(如tpa)与g-csf或协同有效量式i的佛波醇酯(如tpa)与epo的组合可以通过口服方法(如胶囊、液体形式、片剂等)、肠胃外方法(如肠胃外注射)或本领域中已知适合于向哺乳动物施用药物的任何其它方法，与一种或多种第二药剂或一种或多种辅助治疗剂以单一或多个单位剂型同时地或顺序地在组合的或单独的制剂中施用于哺乳动物。
[0111]
本发明的组合物包含协同有效量的或有效地治疗贫血症或减少其持续时间的协同组合的epo和式i的佛波醇酯化合物或式i佛波醇酯的衍生化合物，包括其药学上可接受的盐、对映异构体、异构体、多形体、前药、水合物和溶剂合物。特别地，本发明的组合物在患有肿瘤疾病的人或其它哺乳动物受试者中协同有效地治疗贫血症或减少其持续时间。
[0112]
本发明的组合物包含有效量的或单位剂量的式i的佛波醇酯化合物或式i佛波醇酯的衍生化合物和g-csf，其可以与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂、媒介、乳化剂、稳定剂、防腐剂、缓冲剂和/或可以增强稳定性、递送、吸收、半衰期、效能、药代动力学和/或药效学，减轻副作用或提供用于制药用途的其它优势的添加剂一起配制。
[0113]
本发明的组合物和方法的效力可以通过贫血症、中性粒细胞减少症和/或血小板减少症的持续时间的减少来证明。
[0114]
本发明的组合物可以与一种或多种第二癌症治疗剂或其它指示或辅助治疗剂(同时或顺序地，在组合或单独的制剂中)协同地施用，包括但不限于，阿霉素、维生素d3、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、柔红霉素、环磷酰胺、吉妥珠单抗、伊达比星、巯基嘌呤、米托蒽醌、硫鸟嘌呤、阿地白介素、天冬酰胺酶、卡铂、磷酸依托泊苷、氟达拉滨、甲氨蝶呤、依托泊苷、地塞米松和三水杨酸胆碱镁。
[0115]
在本发明的方法和组合物中，本文中公开的式i的佛波醇酯化合物(如tpa)与gcsf有效地配制或施用以治疗中性粒细胞减少症、血小板减少症和/或相关障碍。在示例性的实
施方案中，tpa为说明性的目的证明与gcsf组合在药物制剂和治疗方法中是有效的药剂。本公开进一步提供原始或合成化合物形式的另外的药学上可接受的佛波醇酯化合物(如tpa)(包括本文中公开的化合物的复合物、衍生物、盐、溶剂合物、异构体、对映异构体、多形体和前药)，及其组合，其在本发明的方法和组合物中作为治疗剂是有效的。
[0116]
本发明的组合物可以包含在例如，通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微囊、微粒或微球(例如，分别羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中，在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中，或在粗乳液中包封用于递送(单独地或与gcsf或epo一起)的式i的佛波醇酯化合物(如tpa)。
[0117]
如上所述，在某些实施方案中，本发明的方法和组合物可以采用上述式i的佛波醇酯化合物和/或相关或衍生的化合物(如tpa)的药学上可接受的盐，例如，酸加成盐或碱式盐。药学上可接受的加成盐的实例包括无机和有机酸加成盐。合适的酸加成盐由形成非毒性盐的酸形成，例如，盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐和磷酸氢盐。另外的药学上可接受的盐包括，但不限于金属盐如钠盐、钾盐、铯盐等；碱土金属盐如钙盐、镁盐等；有机胺盐如三乙胺盐、吡啶盐、甲基吡啶盐、乙醇胺盐、三乙醇胺盐、二环己基胺盐、n,n
’‑
二苄基乙二胺盐等；有机酸盐如乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、富马酸盐、扁桃酸盐、醋酸盐、二氯乙酸盐、三氟乙酸盐、草酸盐和甲酸盐；磺酸盐如甲磺酸盐、苯磺酸盐和p-甲苯磺酸盐；及氨基酸盐如精氨酸盐、天冬酰胺盐(asparginate)、谷氨酸盐、酒石酸盐和葡糖酸盐。合适的碱式盐由形成非毒性盐的碱形成，例如铝盐、钙盐、锂盐、镁盐、钾盐、钠盐、锌盐和二乙醇胺盐。
[0118]
在其它详细实施方案中，本发明的方法和组合物采用式i佛波醇酯的前药。前药被认为是在体内释放活性母体药物的任何共价键合的载体。可用于本发明中的前药的实例包括与作为取代基的羟基烷基或氨基烷基的酯或酰胺化物，且这些可以通过使如上所述的这类化合物与酸酐如琥珀酸酐反应来制备。
[0119]
例如，在当前的aml治疗方案中，g-csf已经是用于在化疗后减少中性粒细胞减少症(但非血小板减少症)的持续时间的常用辅助药物。本发明表明与佛波醇酯如tpa组合的g-csf可以通过以下两种机制治疗中性粒细胞减少症和/或血小板减少症两者或减少其持续时间。
[0120]
1)tpa刺激上游干细胞分化成下游干细胞。tpa也刺激下游干细胞。gcsf仅刺激下游干细胞。
[0121]
2)tpa刺激对干细胞提供营养的基质细胞的生长。
[0122]
例如，在高剂量化疗和gcsf的治疗后中性粒细胞减少症的持续时间是例如，约24
±
3天。tpa和gcsf的组合减少中性粒细胞减少症的持续时间到约15
±
3天，或中性粒细胞减少症的持续时间减少约25％-50％。
[0123]
tpa和gcsf的组合与单独的gcsf或tpa治疗相比可以导致血细胞减少症(包括，但不限于中性粒细胞减少症、血小板减少症和/或贫血症)的持续时间约15％-70％的减少。更优选地，该组合导致血细胞减少症的持续时间约20％-60％的减少，且最优选地，该组合导致血细胞减少症的持续时间约25％-50％的减少。
[0124]
同样，tpa和epo的组合与单独的epo或tpa治疗相比可以导致血细胞减少症(包括，但不限于中性粒细胞减少症、血小板减少症和/或贫血症)的持续时间约15％-70％的减少。
更优选地，该组合导致血细胞减少症的持续时间约20％-60％的减少，且最优选地，该组合导致血细胞减少症的持续时间约25％-50％的减少。
[0125]
本发明令人惊讶地通过刺激上游干细胞分化成下游干细胞实现了协同效应，如图1中所示。
[0126]
或者，本发明的组合物和方法的效力也可以例如，通过红细胞、白细胞、中性粒细胞和/或血小板朝向正常水平的提高来证明。例如，本发明的组合物和方法的效力可以通过中性粒细胞减少症、贫血症和/或血小板减少症的减轻来证明。
[0127]
效力可以使用例如，全血细胞计数(cbc)证明。cbc中进行的测量包括白细胞计数(wbc)、红细胞计数(rbc)、红细胞分布宽度、血细胞比容和血红蛋白量。有效量的本发明的组合物提高全血细胞计数中测量的水平达10％、20％、30％、50％或更多，直到75-90％或者95％或更多。有效量也对于各类型的蛋白质将个体的血蛋白朝向最佳范围移动。
[0128]
正常红细胞(rbc)计数为4.0x10
12
/l至5.2x10
12
/l(女性中)和4.4x10
12
/l至5.7x10
12
/l(男性中)。本文中的组合物和方法的效力朝向正常计数范围来提高rbc计数。
[0129]
正常血红蛋白水平通常是130g/l-175g/l。具体地，正常血红蛋白水平在人类男性中通常是140g/l-180g/l，且正常血红蛋白水平在人类女性中通常是120g/l-160g/l。贫血症是血液中rbc或血红蛋白的量的降低。贫血症在男性中是基于低于130-140g/l(13-14g/dl)的血红蛋白，而贫血症在女性中是低于120-130g/l(12-13g/dl)。本文中的组合物和方法的效力朝向正常血红蛋白水平来提高血红蛋白水平。
[0130]
正常血细胞比容水平是0.370-0.460(女性中)和是0.420-0.520(男性中)。本文中的组合物和方法的效力朝向正常范围来提高血细胞比容水平。
[0131]
正常wbc计数是4.0x109/l-10.0x109/l。本文中的组合物和方法的效力朝向正常计数范围来提高wbc计数。
[0132]
本文中的组合物和方法的效力可以使用嗜中性粒细胞绝对计数(anc)评估。正常anc是在1,500-8,000/mm3之间。患有中性粒细胞减少症的个体的anc低于1500/mm3，且可以甚至达到低于500/mm3的水平。本文组合物和方法的有效量提高个体的anc达10％、20％、30％、50％或更高，直到75-90％或者95％或更高。有效量可以提高anc水平到高于1500/mm3。
[0133]
本文中的组合物和方法的效力可以进一步使用例如，血小板计数进行评估。血小板计数在正常情况下为150,000-450,000血小板/微升(x10
–
6/l)。患有血小板减少症的个体的血小板计数可以低于100,000/微升(100,000/μl)。有效量的本文的组合物和方法提高个体的血小板计数达10％、20％、30％、50％或更高，直到75-90％或者95％或更高。有效量可以提高血小板水平到高于100,000/微升。
[0134]
本文的组合物和方法的效力可以另外地例如，通过测量成髓细胞的数目来评估。成髓细胞在正常情况下占骨髓中细胞的少于5％，但不应当存在于循环血中。有效量的本文的组合物和方法降低成髓细胞数目达10％、20％、30％、50％或更高，直到75-90％、96％或更多。有效量可以降低成髓细胞到低于5％。
[0135]
本文的组合物和方法的效力可以进一步通过检验成髓细胞的auer棒状小体的存在来评估。有效量的本发明的组合物降低可见的auer棒状小体的数目达10％、20％、30％、50％或更多，直到75-90％、96％或更多，直至完全消除auer棒状小体。
[0136]
本发明的组合物和方法的效力可以通过伴随血细胞减少症(包括，但不限于中性粒细胞减少症、贫血症和/或血小板减少症)的症状的减轻来证明。
[0137]
式i的佛波醇酯化合物或者相关或衍生的化合物的有效量(例如，包含有效浓度/量的tpa或tpa的所选择的药学上可接受的盐、异构体、对映异构体、溶剂合物、多形体和/或前药的单位剂量)容易通过本领域技术人员根据临床和患者特定的因素来确定。适合施用于哺乳动物受试者(包括人)的活性化合物的有效单位剂量可以为约10-约1500μg、约20-约1000μg、约25-约750μg、约50-约500μg、约150-约500μg、约125μg-约500μg、约180-约500μg、约190-约500μg、约220-约500μg、约240-约500μg、约260-约500μg、约290-约500μg的范围。在某些实施方案中，式i的佛波醇酯化合物或者相关或衍生的化合物的疾病治疗有效剂量可以在例如，10-25μg、30-50μg、75-100μg、100-300μg或150-500μg的较窄范围内选择。这些和其它有效单位剂量的量可以以单一剂量或者多个每日、每周或每月剂量的形式施用，例如在包括每天、每周或每月施用的1-5或2-3个剂量的给药方案中。在一个示例性实施方案中，10-30μg、30-50μg、50-100μg、100-300μg或300-500μg的剂量每天施用一次、两次、三次、四次或五次。在更具体的实施方案中，50-100μg、100-300μg、300-400μg或400-600μg的剂量每天施用一次或两次。在进一步的实施方案中，50-100μg、100-300μg、300-400μg或400-600μg的剂量每隔一天施用。在可选的实施方案中，剂量基于体重计算，且可以例如，以每天约0.5μg/m
2-约300μg/m2，约1μg/m
2-约200μg/m2，每天约1μg/m
2-约187.5μg/m2，每天约1μg/m
2-每天约175μg/m2，每天约1μg/m
2-每天约157μg/m2，每天约1μg/m
2-约125μg/m2，每天约1μg/m
2-约75μg/m2，每天1μg/m
2-约50/μg/m2，每天2μg/m
2-约50μg/m2，每天2μg/m
2-约30μg/m2或每天3μg/m
2-约30μg/m2的量施用。
[0138]
在其它实施方案中，剂量可以以较低频率施用，例如，每隔一天0.5μg/m
2-约300μg/m2，约1μg/m
2-约200μg/m2，每隔一天约1μg/m
2-约187.5μg/m2，每隔一天约1μg/m
2-约175μg/m2，每天约1μg/m
2-每隔一天约157μg/m2，每隔一天约1μg/m
2-约125μg/m2，每隔一天约1μg/m
2-约75μg/m2，每隔一天1μg/m
2-约50μg/m2，每隔一天2μg/m
2-约50μg/m2，每天2μg/m
2-约30μg/m2或每天3μg/m
2-约30μg/m2。在另外的实施方案中，剂量可以施用3次/周、4次/周、5次/周，仅在周末施用，仅与其它治疗方案协同施用，在连续日施用或以任何适宜的剂量方案施用，取决于临床和患者特异性的因素。
[0139]
红细胞生成素是主要在肾中产生的糖基化蛋白质激素和造血生长因子，和对于临床应用来说，通过重组dna技术产生，且名称依泊汀通常应用于这种材料。参见noblood.org/forum/content/179-erythrogenin_-28epo-29。依泊汀α、依泊汀β、依泊汀γ、依泊汀ω和依泊汀ζ是源自克隆的人红细胞生成素基因的重组人红细胞生成素，其全部具有相同的165个氨基酸的序列但糖基化模式不同。同上。依泊汀δ是源自遗传工程化的连续人细胞系的重组人红细胞生成素，且具有与人红细胞生成素相同的氨基酸序列和糖基化模式。同上。
[0140]
epo如可以作为iv或sc注射给予，如在inceptapharma.com/epoetin/submenu_page_view.php？menu_id＝86&submenu_id＝223&fs中所描述的，其公开内容通过引用全文合并于此。例如，剂量可以对每名患者进行调整以获得和维持10-12g/dl之间的血红蛋白水平。同上。例如，如果血红蛋白正在增加且接近12g/dl，剂量可以降低约25％；如果血红蛋白继续增加，剂量可以临时撤除直到血红蛋白开始降低和然后以低于先
前剂量约25％的剂量重新开始；或如果血红蛋白在2周时间内提高超过1g/dl，剂量可以降低约25％。同上。如果血红蛋白的增加在4周内少于1g/dl且铁贮量充足，则的剂量可以提高先前剂量的约25％。进一步的提高可以以4周间隔进行直到获得指定的血红蛋白。同上。
[0141]
epo的剂量可以对正在进行化疗的患者或已经经历化疗的患者滴定以实现或维持足以避免输血的需要的最低血红蛋白水平且不超过12g/dl的安全上限。inceptapharma.com/epoetin/submenu_page_view.php？menu_id＝86&submenu_id＝223&fs。成人中epo的初始推荐剂量是150单位/kg sc tiw或每周40,000单位sc，且儿科患者中epo的初始推荐剂量是每周600单位/kg iv。同上。
[0142]
促红细胞生成素的合适的有效单位剂量的量可以取决于几种因素且由受试者的医生来判断。例如，一些患者对于本文所述的化合物或组合物的敏感性较高或较低，且对于那些患者，可能优选的是提供较低或较高血浆或血清值的组合物。而且，一些受试者可以代谢该化合物或可以以不同的速率代谢该化合物，因而可能需要提供希望的血清或血浆浓度的这种剂量和/或可选剂型。技术人员可理解，本发明的组合物中epo的特定剂量可以根据疾病的状况、受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、给药间隔、施用途径、排泄率及活性化合物的组合来调整。
[0143]
epo的给药方案可以包括如每天或每隔一天给予的每千克体重75-150iu(u/kg)的剂量；每周一次给予的600u/kg的剂量；或一周三或四次的300u/kg的剂量；如noblood.org/forum/content/179-erythrogenin_-28epo-29所述的是建议的用药指导，其公开内容通过引用全文合并于此。例如，对于70kg的患者，可以指定每周60,000iu。同上。
[0144]
epo的合适的有效单位剂量的量可以包括450iu/kg 900iu/kg的范围，每天或每隔一天给予，一周给予一次、两次、三次或四次。参见noblood.org/forum/content/179-erythrogenin_-28epo-29。
[0145]
epo-β的合适的有效单位剂量的量可以包括1000iu/0.3ml、2000iu/0.3ml、3000iu/0.3ml、4000iu/0.3ml、5000iu/0.3ml、6000iu/0.3ml、10,000iu/0.6ml和30,000iu/0.6ml溶液；且在用于注射的预填充注射器中包含尿素、氯化钠、磷酸钠和水。参见noblood.org/forum/content/179-erythrogenin_-28epo-29。
[0146]
依泊汀α可以基于治疗需要和患者体重通过注射1ml的水基溶液(其可以包含单剂量的2000、3000、4000、10,000或40,000单位依泊汀α/单一剂量以及其它成分，包括白蛋白)来施用。参见noblood.org/forum/content/179-erythrogenin_-28epo-29。另外，多剂量注射也可以用10,000单位或20,000单位/1ml注射溶液施用。同上。这适用于其它形式的epo。同上。慢性疾病，如肾衰竭、心脏病、糖尿病和炎性疾病如类风湿性关节炎，全都造成贫血症且产生对epo疗法的钝化反应-在所有这类情况中，剂量应当提高。同上。
[0147]
epoα(rch)或的剂量可以如medsafe.govt.nz/profs/datasheet/e/eprexinj.pdf中所述施用，其公开内容通过引用全文合并于此。例如，epoα可以用每周3次150单位/kg 3或每周40,000单位和/或每周3次300单位/kg或每周60,000单位皮下施用。参见drugs.com/ppa/epoetin-alfa-erythrogenin-epo.html，其公开内容通过引用全文合并于此。
[0148]
epo的剂量可以包括如美国专利no.7,232,797中所述的高剂量，其公开内容通过
引用合并于此。例如，美国专利no.7,232,797描述了每周5000iu/kg或17,000～25,000iu/kg(每两周或每三周)的epo剂量。
[0149]
epo的剂量可以包括如ca2418531中所述的低剂量，其公开内容通过引用合并于此。例如，ca2418531专利描述了每周约1-约90iu/kg的epo剂量，以及每周约75-约120iu/kg的初始治疗剂量和每周约20-约75iu/kg的维持剂量。另外，ca2418531描述了每周一到三次施用5-150iu/kg剂量的重组依泊汀ω。
[0150]
用于本发明的当前疾病治疗(或者，“嗜中性粒细胞刺激”、“红血球生成刺激”或“血小板刺激”)制剂的有效剂量或多剂量治疗方案一般地选择为接近于在受试者中实质上治疗贫血症、中性粒细胞减少症和/或血小板减少症或减少/缩短其持续时间必要和足够的最低给药方案。剂量和施用方案通常包括在几天或甚至一周或多周或一年或多年的过程中的重复给药疗法。有效治疗方案也可以包括一天施用的预防剂量或按天的多个剂量，持续数天、数周、数月或甚至数年。
[0151]
本发明的组合物和方法的效力也可以通过患有肿瘤疾病(包括，但不限于贫血症、慢性疲劳、出血过多或易出血如鼻、牙龈和皮下的出血、容易瘀伤，特别是没有明显原因的瘀伤，气促，瘀点，回归热，牙龈肿痛，切口的缓慢愈合，骨和关节不适，反复感染，体重减轻，瘙痒，盗汗，淋巴结肿大，发烧，腹痛和不适，视觉障碍，咳嗽，食欲不振，胸痛，吞咽困难，面部、颈部和上肢的肿胀，尿频(特别是在夜间)，排尿困难或憋尿，尿无力或尿中断，排尿疼痛或灼热感，勃起困难，射精痛，尿血或精血，下背、臀部或大腿的频繁疼痛或僵硬和/或虚弱)的受试者的症状的减轻来证明。
[0152]
本发明的组合物和方法在类风湿性关节炎的治疗中的效力也可以通过红细胞沉降率的改变来证明。有效量的本发明的组合物使红细胞沉降水平降低达初始诊断的红细胞沉降水平的10％、20％、30％、50％或更多，直到75-90％、96％或更多。效力也可以通过类风湿因子和抗环瓜氨酸化抗体水平的改变来证明。
[0153]
本文描述的化合物和组合物可以配制成药学上可接受的组合物，其可以包括一种或多种药学上可接受的载体。这样的组合物可以通过混合本文描述的一种或多种化合物或组合物(例如，其药学上可接受的盐或其立体异构体)和药学上可接受的载体、赋形剂、粘合剂、稀释剂等来制备以治疗血细胞减少症如中性粒细胞减少症、血小板减少症和/或贫血症或减少其持续时间。
[0154]
该组合物可以配制用于各种施用途径，例如，通过口服、透皮、肠胃外、直肠、经鼻、阴道施用或经由植入的储室或其它装置如支架施用。这样的植入物可以采用已知的惰性材料如硅橡胶和可生物降解聚合物。它们也可以与递送媒介(如在胶束或脂质体中)或一些其它包封技术结合提供。肠胃外或系统性施用包括，但不限于皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内、鞘内、颅内和脑室内注射。
[0155]
对于口服、口腔和舌下施用，粉末、悬浮液、颗粒、片剂、丸剂、囊形片(gelcaps)和囊片作为固体剂型是可接受的。这些可以例如，通过混合一种或多种本文所公开的化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体与至少一种添加剂(包括，但不限于蔗糖、乳糖、纤维素糖、甘露醇、麦芽糖醇、葡聚糖、淀粉、琼脂、海藻酸盐、几丁质、壳聚糖、果胶、黄蓍胶、阿拉伯胶、明胶、胶原、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成聚合物和甘油酯)来制备。任选地，口服剂型可以包含其它成分以帮助施用，如非活性稀释剂、润滑剂如硬脂酸镁、防腐剂如对羟基苯
甲酸酯或山梨酸、抗氧化剂如抗坏血酸、生育酚或半胱氨酸、崩解剂、粘合剂、增稠剂、缓冲剂、甜味剂、矫味剂或香料。片剂和丸剂可以进一步用本领域中已知的包衣材料包被。
[0156]
用于口服施用的液体剂型可以是药学上可接受的乳液、糖浆、酏剂、混悬剂和溶液的形式，其可以包含无活性的稀释剂如水。药物制剂和药剂可以使用无菌液体(包括，但不限于油、水、醇及其组合)制备为液体悬浮液或溶液。可以添加用于口服或肠胃外施用的药学上合适的表面活性剂、悬浮剂、乳化剂。
[0157]
可注射剂型包括可以使用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂制备的水性悬浮液或油悬浮液。可注射的形式可以为溶液相或为悬浮液的形式，其使用溶剂或稀释剂制备，包括但不限于，无菌水、林格氏液或等渗盐水溶液。为用于注射，药物制剂和/或药剂可以是适合于用合适的溶液重构的粉末，且可以任选地包含稳定剂、ph调节剂、表面活性剂、生物利用度改进剂及其组合。这样的合适粉末的实例包括，但不限于冻干的、旋转干燥的或喷雾干燥的粉末、无定形粉末、颗粒、沉淀物或颗粒状物质。
[0158]
本文所述的化合物和组合物也可以通过经鼻或口的吸入施用于肺。合适的用于吸入的药物制剂包括，但不限于水性和非水性气雾剂、溶液、干燥粉末或包含任何适宜的溶剂和任选的其它化合物(例如，但不限于稳定剂、抗微生物剂、抗氧化剂、ph调节剂、表面活性剂、生物利用度改进剂及其组合)的气雾剂。用于吸入施用的制剂可以包含赋形剂，包括但不限于，乳糖、聚氧乙烯-9-月桂基醚、甘氨胆酸盐和脱氧胆酸盐。水性气雾剂通过将化合物或组合物的水性溶液或悬浮液与常规的药学上可接受的载体和稳定剂(其包括但不限于非离子表面活性剂(tweens、pluronics或聚乙二醇)、无害的蛋白质如血清白蛋白、山梨聚糖酯、油酸、卵磷脂、氨基酸如甘氨酸、缓冲剂、盐、糖或糖醇)一起配制来制备。气雾剂可以从等渗溶液制备，或非水性悬浮液(例如，在氟碳推进剂中)也可以用于递送本文所述的化合物和组合物的实施方式。
[0159]
本发明的化合物和组合物可以在包含适宜的溶剂和任选地用于经鼻施用的其它化合物(例如，但不限于稳定剂、抗微生物剂、抗氧化剂、ph调节剂、表面活性剂、生物利用度改进剂及其组合)的喷雾、滴鼻剂或气雾剂中提供。
[0160]
本发明的化合物和组合物可以提供用于持续释放或立即释放。持续释放剂型控制释放速率，且可以随时间维持组合物的有效浓度，从而提供在延长的时间段内具有治疗效果的配方。药物组合物是选自片剂、用于口服施用的液体、口腔喷雾剂、鼻喷雾剂、可吸入制剂、丸剂、凝胶、固体、胶囊、多颗粒剂(multi-particulate)、透皮贴片、可植入剂型和包括静脉滴注(包括冻干和重构的形式)的可注射溶液的剂型；以及溶胀或展开以使得剂型在胃或小肠上部保留至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时或长于6小时的时间段的剂型。描述持续释放组合物的专利的实例包括，但不限于美国专利no.7,438,927,美国专利no.7,413,751,美国专利no.7,405,238,美国专利no.6,723,340,美国专利no.6,682,759,美国专利no.6,635,280,美国专利no.6,488,962,美国专利no.6,451,808,美国专利no.6,340,475,美国专利no.5,972,389,美国专利no.5,582,837和美国专利no.5,007,790。
[0161]
提供以下非限制性实施例仅用于阐明本发明的各个方面或实施方案。
[0162]
实施例
[0163]
实施例1：
[0164]
tpa和gcsf在集落形成细胞上的体外研究
[0165]
tpa和gcsf的组合对于集落形成细胞产生比单独的tpa或g-csf更强的刺激效应，如图2中所示的。
[0166]
骨髓抑制是使用化疗药物的癌症患者的最常见不良反应，重度骨髓抑制经常使得化疗难以按照计划的继续，可以导致并发症，可能是致命的。最近，rhg-csf、epo广泛地用于治疗通过化疗和放疗疗程导致的白细胞减少症或贫血症。但对于接受高强度或许多次化疗的人，特别是对于白血病患者，仅rhg-csf、epo不能在短期内恢复骨髓造血。因为当化疗药物杀伤癌细胞时，它们可能伤害正常造血细胞和骨髓中的微环境。同时，rhg-csf、epo在造血作用的下游发挥作用。例如g-csf在髓系祖细胞期发挥作用，其刺激它们的增殖、分化，且促进成熟中性粒细胞释放到外周血中。epo在髓系祖细胞阶段发挥作用以刺激红细胞生成、提高外周血中的红细胞数目。但它们对骨髓微环境完全没有作用。因此，重要的是发现快速恢复骨髓造血功能的方法。据报告，称为佛波醇酯(tpa)的12-o-十四酰基佛波醇-13-乙酸酯不仅可以诱导多种白血病细胞变成正常细胞，而且tpa对于骨髓造血细胞具有特定影响和可以增加白细胞。
[0167]
为研究单独的tpa或组合的rhg-csf在体外对来自骨髓抑制期的急性髓性白血病(aml)的患者的骨髓造血细胞增殖和集落形成能力的作用和观察tpa对骨髓抑制期的aml患者和健康人的骨髓基质细胞(bmsc)增殖或抑制的作用。
[0168]
方法：
[0169]
1)来自同一化疗后aml患者的人骨髓细胞通过甲基纤维素半固体培养基培养。组：空白、tpa(10ng/ml)、g-csf(50ng/ml)、tpa(10ng/ml) gcsf(50ng/ml)。实验重复4次。
[0170]
2)来自健康人和化疗后aml患者的骨髓基质细胞通过甲基纤维素半固体培养基培养。添加不同的tpa浓度。组：空白、tpa(0.1ng/ml)、tpa(1.0ng/ml)、tpa(5ng/ml)、tpa(10ng/ml)、tpa(20ng/ml)、tpa(30ng/ml)。
[0171]
3)来自健康人和骨髓抑制期的aml患者的体外bmsc的培养，添加不同浓度的tpa，0.1ng/ml、1.0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml并设定对照以使用cck8方法检测细胞增殖或抑制。
[0172]
结果和结论：
[0173]
1.比较不完全培养基中四个组的克隆，在对照组中可以观察到小细胞簇24-72小时，但细胞随着时间延长死亡。培养14天，对照组没有克隆形成，对于g-csf组cfu-gm是主要的，单独tpa和g-csf组合组具有髓细胞集落形成，同时bfu-e和cfu-gemm。对于g-csf组、单独tpa组和g-csf组合组，克隆的总数高于对照组(均p《0.05)，同时单独tpa组和g-csf组合组的克隆高于g-csf组(均p《0.05)，联合组的克隆高于tpa组(p《0.001)。
[0174]
2.比较不完全培养基中不同浓度的tpa刺激的克隆，5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml组的总克隆高于其它组，包括最高的10ng/ml，存在统计学显著性(均p《0.05)。而提高或降低tpa浓度不能提高集落数。tpa刺激集落形成的较佳浓度是5～20ng/ml。培养的14天，除cfu-gm外，在1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml组中观察到cfu-gemm，且在5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml组中可以观察到较少的bfu-e，而其它浓度组未观察到红系克隆。
[0175]
3.比较不完全培养基中不同浓度的tpa和g-csf(50ng/ml)刺激的克隆。与g-csf组合，tpa的较佳浓度是1～10ng/ml(均p《0.05)。与g-csf组合，tpa的最佳浓度对于cfu-gm和
cfu-gemm是5ng/ml和1ng/ml。主要克隆类型是髓系克隆，cfu-gm，也具有cfu-gemm和较少的bfu-e。
[0176]
4.比较不完全培养基中四个组的克隆，克隆可以在四个组中看到，包括cfu-gm、cfu-gemm、bfu-e、cfu-e的克隆。tpa与g-csf组的克隆与tpa组、g-csf组和对照组相比是最高的，差异具有统计学显著性(均p《0.05)。而tpa组和g-csf组，tpa组和g-csf组的克隆数不具有统计学显著性(p＝0.577)。
[0177]
5.实验显示tpa促进5～10ng/ml浓度的健康人骨髓基质细胞增殖(细胞数2x105/ml)。降低或提高tpa的浓度，其显示bmsc受到抑制。同时，tpa促进5～30ng/ml浓度的aml患者骨髓基质细胞增殖(细胞数2x105/ml)。5ng/ml的tpa是促进增殖的最佳浓度，且g-csf对来自健康人或aml患者的bmsc生长没有作用。
[0178]
结论：
[0179]
tpa单独地促进造血细胞克隆形成，对于体外骨髓抑制期aml患者的骨髓主要为cfu-gm，最佳浓度是10ng/ml。tpa在不同阶段促进cfu-gm、cfu-gemm和bfu-e的形成。
[0180]
除了促进cfu-gemm和bfu-e形成外，tpa和g-csf具有促进骨髓髓系克隆形成的协同效应，tpa的最佳浓度是5ng/ml。g-csf促进cfu-gm的形成，但对cfu-gemm和bfu-e没有作用。
[0181]
tpa促进健康人和体外骨髓抑制期的化疗后aml患者的骨髓基质细胞(bmsc)的生长。最佳浓度是5ng/ml和10ng/ml。
[0182]
如图1中所示，tpa刺激上游干细胞分化成下游干细胞。gcsf仅刺激下游干细胞。tpa也刺激下游干细胞。中性粒细胞是粒细胞的一种类型。
[0183]
实施例2:
[0184]
投送tpa(pd616)用于aml
[0185]
·
moa:蛋白激酶c(pkc)激动剂
[0186]
·
指标：
[0187]
1)当前方案：复发后aml的挽救疗法
[0188]
2)新策略：诱导/巩固化疗后对wbc和血小板恢复的aml支持性治疗。
[0189]
·
基本原理：
[0190]
(1)pkc的激活有助于造血细胞恢复
[0191]
(2)pkc诱导白血病细胞的分化
[0192]
aml中的tpa强度
[0193]
·
增强诱导和巩固化疗后1l aml中的骨髓恢复
[0194]
·
良好建立的通过pkc激活的作用机制
[0195]
·
来自先前临床研究的公知可耐受毒性谱
[0196]
·
aml患者中中性粒细胞减少症&血小板减少症持续时间从20天潜在缩短到12天的强效能数据
[0197]
减少住院期
[0198]
最小化感染机会
[0199]
减少血液产品支持的需要
[0200]
减少aml患者治疗费用
[0201]
tpa作为aml化疗后白细胞&血小板恢复的支持性治疗
[0202]
·
标准治疗(soc)的陷阱：g-csf或gm-csf不对早期造血祖细胞发挥作用且对缩短诱导或巩固治疗后中性粒细胞减少症&血小板减少症的持续时间具有有限的效能。
[0203]
·
没有利于aml诱导/巩固化疗后血小板恢复的有效途径。
[0204]
·
tpa增强早期祖细胞的生长且潜在地帮助缩短中性粒细胞减少症和血小板减少症的持续时间。
[0205]
·
aml的年发病率14,000例，且80％接受积极化疗和发生延长的中性粒细胞减少症。
[0206]
·
目标：
[0207]
缩短中性粒细胞减少症的持续时间和住院期从20天到12天，
[0208]
由于血小板恢复的促进，减少血液产品(prbc和血小板)支持，
[0209]
减少感染并发症，
[0210]
没有对疗效、cr率或反应持续时间的负面影响。
[0211]
指标
[0212]
诱导和巩固化疗后aml患者中中性粒细胞减少症&血小板减少症的缩短。中性粒细胞减少症和血小板减少症的缩短。
[0213]
施用
[0214]
作为化疗完成后24
–
48小时开始的单一疗程，0.125mg/m2的tp iv每周3次(m-w-f)直到anc高于1000和血小板高于20,000至少2天，而其它支持性治疗保持为soc。
[0215]
效能
[0216]
减少中性粒细胞减少症的持续时间40％，从20天到12天。减少平均住院天数40％。减少血液产品支持40％。
[0217]
安全性
[0218]
所有毒性不显著重于与标准aml化疗相关的常见毒性。
[0219]
竞争
[0220]
g-csf和gm-csf不是非常有效
[0221]
·
12名患者的2期单组研究(6名用于诱导3 7治疗和6名用于2 5的巩固治疗或高剂量ara-c)，tpa在标准化疗完成后24
–
48小时开始。每周m-w-f的tpa iv直到anc高于1000和血小板高于20,000持续2 天，而其它支持性治疗保持为soc。
[0222]
·
双盲随机2期研究，1:1的tpa g-csf vs.g-csf。20名患者的样本大小具有～90％的能力和α0.1以检测中性粒细胞减少症&血小板减少症的持续时间40％的减少(从20天到12天)。
[0223]
主要终点：中性粒细胞减少症的持续时间、血液产品支持和住院日期全部减少40％。
[0224]
·
实现40％减少的目标，且没有对于白血病治疗的明显不利影响。
[0225]
另外的aml方案包括在化疗完成后24
–
48小时开始tpa且观察中性粒细胞减少症&血小板减少症的持续时间。
[0226]
两个同龄组中的随机化2期试验。一个用于诱导化疗，一个用于巩固化疗。显示降低40％的中性粒细胞减少症持续时间。
[0227]
实施例3:
[0228]
本方案是诱导治疗，且不包括巩固。这一辅助疗法将tpa和g-csf(粒细胞集落刺激因子)结合。
[0229]
这是单组的开放标签研究。十名(10)患者在第1、2、3天接受伊达比星(12mg/m2)或道诺霉素(60mg/m2)的标准诱导化疗和在第1-7天接受ara-c连续(100-200mg/m2/天)输注。在第8天或完成所有安排的ara-c输注后24小时，除了g-csf(每天400μg皮下)支持外，tpa每两天以0.125mg/m
2 iv开始直到嗜中性粒细胞绝对计数(anc)连续两天高于1000/μl。
[0230]
在接受诱导化疗的急性髓细胞性白血病患者中佛波醇酯缩短中性粒细胞减少症和血小板减少症的持续时间的2a期研究。
[0231]
佛波醇酯(12-o-十四酰基佛波醇-13-乙酸酯，tpa)是蛋白激酶c的激动剂，且已经通过体外研究证明增加早期造血祖细胞。在tpa的先前的1期剂量递增研究中，tpa观察到能够缩短急性髓细胞性白血病(aml)患者中化疗后中性粒细胞减少症的持续时间。在最多一周5天x2周，每天0.125mg/m2的推荐的2期剂量中，其良好耐受而仅具有轻度不良事件如气促、蛋白尿、发烧、发冷和输注部位的静脉刺激。这一研究设计为检验tpa作为支持性治疗剂增强诱导化疗后aml患者中的骨髓恢复的效能。
[0232]
研究目的：
[0233]
1.评估诱导化疗后tpa在aml患者中的安全性和耐受性。
[0234]
2.评估诱导化疗后缩短aml患者中中性粒细胞减少症和血小板减少症的持续时间的初步效能。
[0235]
3.评估诱导化疗后维持tpa的诱导化疗后初步完全缓解(cr)率。
[0236]
适格性
[0237]
入组标准包括：
[0238]
1.诊断具有aml或晚期骨髓增生异常综合征(mds，如具有难治性贫血伴原始细胞增多(raeb)或带有转化的raeb)的患者，如果他们的骨髓原始细胞计数超过20％。
[0239]
2.aml应当按照fab分类法分类，且允许所有亚型并在入组过程中记录，除了患有m3或急性早幼粒细胞白血病的患者。
[0240]
3.认为适合于接受3 7诱导化疗(蒽环霉素和阿糖胞苷)的aml或晚期msd患者。
[0241]
4.年龄18-70。
[0242]
5.ecog 0-2。
[0243]
6.如通过肌酐≤2mg/dl，ast/alt≤5x uln，胆红素≤2mg/dl定义的没有主要器官功能障碍的证据，且没有重大的心血管问题如入组前6个月内的近期急性心肌梗死或中风的患者。
[0244]
7.具有足够的心脏功能而没有如通过不差于美国心脏协会(american heart association)i类限定的充血性心力衰竭史的患者(具有心肌疾病但不造成体力活动限制的患者。普通的体力活动不引起过度疲劳、心悸、呼吸困难或心绞痛)。
[0245]
8.有能力给出研究知情同意书的患者。
[0246]
排除标准包括：
[0247]
1.在过去24个月内患有其它非aml恶性肿瘤的患有，除了被认为可治愈的那些，如治疗的皮肤基底细胞癌、切除的早期恶性肿瘤如乳腺的原位导管癌和其它治愈的癌症。
[0248]
2.具有临床活动性或慢性感染且不适合于标准的aml 3 7诱导疗法的患者。
[0249]
3.不适合于标准的aml 3 7诱导疗法的在6个月内具有大出血、手术和其它重大医学问题的患者。
[0250]
4.需要长期补氧以维持高于92％的脉搏血氧饱和度的患有慢性copd的患者。
[0251]
5.哺乳和怀孕妇女。
[0252]
6.过去具有阳性hiv感染的患者。
[0253]
研究设计
[0254]
这是单组的开放标签研究。十名(10)患者在第1、2、3天接受伊达比星(12mg/m2)或道诺霉素(60mg/m2)的标准诱导化疗和在第1-7天接受ara-c连续(100-200mg/m2/天)输注。在第9天或完成所有安排的ara-c输注后24小时，tpa每天早晨以0.125mg/m
2 iv开始，持续5天，然后停药2天。相同的5天给药和2天停药的tpa施用循环重复一次直到患者的嗜中性粒细胞绝对计数(anc)在连续的两天高于1000/μl。每天皮下或静脉内400μg的g-csf在开始第一天tpa的同一天开始，但在下午或tpa的早晨剂量后大约8小时施用。g-csf也在患者的嗜中性粒细胞绝对计数(anc)连续两天高于1000/μl时停止。这种tpa接着g-csf的顺序施用方式基于tpa对早期祖细胞如cfu-gm和cfu-gemm的增殖的刺激来设计；而g-csf刺激晚期祖细胞(主要地cfu-gm或cfu-g)的增殖。在没有早期祖细胞群体的扩增的情况下，g-csf没有靶细胞群体且不能有效地发挥作用以增强正常白细胞的恢复。
[0255]
所有其它支持性疗法如iv广谱抗生素、抗病毒剂(如抗疱疹剂)和抗-真菌剂(如抗-念珠菌病剂)支持遵循aml诱导治疗的标准操作指南。在血细胞比容低于30和没有出血的临床证据的情况下血小板计数低于10,000(或有出血的临床证据的情况下50,000)时，血液产品支持也遵循浓集红细胞(prbc)输注的标准操作指南。所有患者对于整个诱导期住院直到anc和血小板恢复到充足水平而没有活动性感染的证据。采用中性粒细胞减少症的标准治疗。
[0256]
研究持续时间
[0257]
在患者从诱导治疗恢复后，患者可以出院和随后返回以根据其风险因素按照治疗医生的判断进行后续的附加化疗如高剂量ara-c或考虑骨髓移植。患者在他们返回进行诱导治疗疗效的后续骨髓评估后退出研究。所有进一步的巩固治疗不被认为是研究的部分。
[0258]
安全性评估
[0259]
安全性分析基于common terminology criteria for adverse events(ctcae)vs.4.0评估。常见的不良事件包括气促、发热、发冷和蛋白尿。治疗相关的发热和发冷与研究药物的iv输注后细胞因子的增加一致，但一般是短时的且在24小时后消退。如果必要，醋氨酚用于发热的症状缓解。
[0260]
效能分析
[0261]
诱导化疗后中性粒细胞减少症和血小板减少症的评估通过每日血液学检查进行，包括全血细胞计数和分类计数。在第14天，骨髓按照标准临床操作指南常规地进行以在完成诱导治疗后7天评价任何残留原始细胞。进行抽取的骨髓的流式细胞分析以区分收集的正常祖细胞与残留原始细胞。中性粒细胞减少症和血小板减少症的持续时间单独地评价且
anc和血小板计数应当对于各患者在图表中作图。
[0262]
统计分析
[0263]
该研究探索了aml患者中标准的3 7诱导化疗后中性粒细胞减少症和血小板减少症的持续时间。通常，80％的aml患者具有20
±
3天的中性粒细胞减少症/血小板减少症的持续时间(即，假设化疗在第1天开始，anc或血小板恢复在大约第24-30天)且然后出院(如果没有感染的证据)。在该研究中，tpa显著地缩短中性粒细胞减少症和血小板减少症的持续时间。用tpa治疗的患者的中性粒细胞减少症或血小板减少症的持续时间减少到12天(anc或血小板恢复在第14-24天)，标准差5天，10名患者的样本大小具有90％的能力检测差异和排除零假设。
[0264]
实施例4：
[0265]
年龄25的男性患者诊断有aml(m2)。患者的骨髓成髓细胞加前髓细胞计数是约60％。在他接受一个标准疗程的da方案(7 ara c 3道诺霉素)后，他的外周wbc计数下降到0.8
×
109/l。他然后每天施用150μg g-csf。在化疗后，花费12天的时间(中性粒细胞减少症和血小板减少症的持续时间)使他的血小板计数和wbc计数(包括嗜中性粒细胞计数)返回到正常。他的骨髓成髓细胞加前髓细胞计数是约40％，仍远高于正常值(0～5％)。然后，他接受第二个标准疗程的da方案。在第二疗程的da方案后，他的外周wbc计数和血小板计数分别降低到0.6
×
109/l和80
×
109/l。他然后在第1天和第2天每天施用tpa加g-csf(150μg tpa，接着150μg g-csf)。在第4天和第5天，他每天仅施用150μg tpa。wbc计数和括号中的嗜中性粒细胞百分比*在第3天是1.8
×
109/l(39％)，在第7天是6.5
×
109/l(72％)和在第14天是5.7
×
109/l(77％)。估计的化疗后中性粒细胞减少症持续时间缩短到约5天。血小板计数在第3天是330x109/l，在第7天是715
×
109/l和在第14天是568
×
109/l。估计的化疗后血小板减少症持续时间缩短到少于3天。他的骨髓成髓细胞加前髓细胞计数是2％，回落到正常值。
[0266]
*中性粒细胞通常占到循环wbc的60-70％。
[0267]
实施例5:
[0268]
年龄33岁的男性患者诊断有骨髓增生异常综合征(mds5q-)。他已经用包括epo、g-csf、沙利度胺和睾酮的疗法治疗7个月而没有任何改善。他的造血功能非常低，特别是红细胞生成。他的血红蛋白水平在没有输血的情况下是40g/l。除了接受药物治疗外，他还每月接受输血。在输血后，他的血红蛋白水平达到70-80g/l。一至两周后，降低到60g/l。在该月结束时，再次降低到40g/l。他必须再次接受输血。他具有工作能力丧失的问题且不可能过正常生活。他施用tpa g-csf epo治疗(tpa:150-180μg iv输注 g-csf:150μg im epo:5000单位im)5次。每一次，epo和g-csf在tpa给予后5小时给予。在tpa g-csf与epo的5次治疗后，他在没有输血的情况下维持70g/l的血红蛋白水平。他自此之后停止输血。他的血红蛋白水平之后两个月继续地逐渐提高且在tpa g-csf epo治疗后的三个月内达到120g/l，接近正常血红蛋白水平(130-175g/l)。他的wbc、rbc和血小板计数也逐渐地提高到接近正常水平。他已经恢复其日常工作和正常生活。
[0269]
实施例6:
[0270]
通过tpa治疗的药物诱导的血细胞减少症
[0271]
九十(90)只成年小鼠随机分配到9个组(每组10只小鼠)。对照组没有施用药物。模
p＜0.05,“④④”p＜0.01 vs epo组，“⑤”p＜0.05,“⑤⑤”p＜0.01 vs tpa12.5μg.kg-1
组
[0286]
表4.各组之间血细胞计数的比较(n＝10)
[0287]
(dnr ara-c后9天，2
nd tpa或其它后1天)
[0288][0289][0290]
注：数据表示平均值 sd。“①”p＜0.05，“①①”p＜0.01 vs对照组；
[0291]“②”p＜0.05，“②②”p＜0.01 vs模型组，“③”p＜0.05,“③③”p＜0.01 vs g-csf组，“④”p＜0.05,“④④”p＜0.01 vs epo组，“⑤”p＜0.05,“⑤⑤”p＜0.01 vs tpa 12.5μg.kg-1
组
[0292]
表5.各组之间血细胞计数的比较(n＝10)
[0293]
(dnr ara-c后10天，3
rd tpa或其它后1天)
[0294][0295]
注：数据表示平均值 sd。“①”p＜0.05，“①①”p＜0.01 vs对照组；
[0296]“②”p＜0.05，“②②”p＜0.01 vs模型组，“③”p＜0.05,“③③”p＜0.01 vs g-csf组，“④”p＜0.05,“④④”p＜0.01 vs epo组，“⑤”p＜0.05,“⑤⑤”p＜0.01 vs tpa12.5μg.kg-1
组
[0297]
结论：
[0298]
1)tpa促进wbc、rbc和血小板的产生。其可以用于治疗不同形式的血细胞减少症，如贫血症、白细胞减少症、中性粒细胞减少症、血小板减少症、粒细胞减少症、全血细胞减少症和低血细胞减少症(hypocytopenia)(参见https//:en.wikipedia.org/wiki/cytopenia)。
[0299]
2)tpa与g-csf组合具有促进wbc产生的协同作用。
[0300]
3)tpa与epo组合具有促进rbc产生的协同作用。
[0301]
4)tpa可以在不同阶段促进造血途径，从上游髓样干细胞分化为下游干细胞和然后从下游干细胞进一步分化为不同血细胞。