一种检测土壤中芸苔素内酯的方法与流程

1.本发明涉及一种检测土壤中芸苔素内酯的方法，属于借助于测定材料的化学或物理性质来测定或分析材料领域。


背景技术：

2.芸苔素内酯是一种新型绿色环保植物生长调节剂，其通过适宜浓度芸苔素内酯浸种和茎叶喷施处理，可以促进蔬菜、瓜类、水果等作物生长，可改善品质，提高产量，色泽艳丽，叶片更厚实。也能使茶叶的采叶时间提前，也可令瓜果含糖份更高，个体更大，产量更高，更耐储藏。
3.农药市场上植物生长调节剂以人工合成的复硝酚钠和芸苔素两大类为主。在实际应用中，以天然提取的芸苔素质量最好，综合经济效益更优，更能得到农民欢迎和应用。不管属于哪一类植物激素，对人畜都是无害的，正常使用剂量非常安全有效。
4.近年来，研发人员采用gcms或者hplc对植物样品中的芸苔素内脂进行了检测，但土壤中芸苔素的检测尚未有报道。土壤是植物生长的基地，是人类赖以生存的物质基础，因此土壤质量的优劣直接影响人类的生存和发展。因此研究土壤中芸苔素内脂的测定对提高土壤的环境质量和生产能力，保障人民的身体健康具有十分积极的意义。
5.相对于植物样品中的芸苔素内脂，土壤中的芸苔素内酯与土壤结合较为牢固，提取不稳定，造成测定的精密度较低。
6.到目前为止，尚未发现土壤中芸苔素内脂的检测方法，伴随着环境污染的日趋严重，建立土壤中芸苔素内脂的检测方法，对土壤中的芸苔素内脂进行监测，是当前亟需解决的问题。


技术实现要素：

7.本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷，通过特定的前处理和提取步骤，并进一步进行检测，实现土壤中芸苔素内酯检测的精密度高。
8.为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：一种检测土壤中芸苔素内酯的方法，所述方法包括样品前处理、提取、衍生、检测。
9.以下是对上述技术方案的进一步改进：所述样品前处理包括研磨、烘制；所述研磨的方法为，将通过0.8-1.5mm的筛孔的风干土壤样品、无孔陶瓷球混合，加入去离子水，升温至90-95℃，控制速度为450-500rpm，进行研磨，研磨时间60-70min，保持温度为80-90℃，用氮气吹干至无去离子水，得到研磨料；所述无孔陶瓷求的粒径为1.2-2.0mm；所述风干土壤样品与无孔陶瓷球的质量比为4:4.5-5.5；所述去离子水与风干土壤样品的质量比为4-6:3；所述烘制的方法为，将研磨料置于真空烘箱中，控制真空度为35-45pa，控制温度
为150-160℃，烘制140-160min，然后调节真空度为15-25pa，调节温度为200-210℃，烘制40-60min，冷却，将无孔陶瓷球分离，得到前处理样品；所述提取包括一次提取、二次提取、混合吹干；所述一次提取的方法为，准确称取前处理样品2g（精确至0.01g），置于50ml塑料离心管中，加入8-12ml甲酸-甲醇溶液，涡旋50-70s，控制频率为30-50khz进行超声，超声时间25-35min，然后控制转速为3800-4500r/min进行离心，离心时间4-6min，取上清液，得到一次提取上清液、一次提取土壤；所述甲酸-甲醇溶液中，甲酸与甲醇的体积比为1:800-1200；所述二次提取的方法为，取一次提取土壤，置于50ml塑料离心管中，加入8-12ml乙醇-三氯甲烷溶液，涡旋80-100s，控制频率为40-50khz进行超声，超声时间12-17min，然后控制转速为5500-6500r/min进行离心，离心时间4.5-5.5min，取上清液，得到二次提取上清液；所述乙醇-三氯甲烷溶液中，乙醇与三氯甲烷的体积比为1:95-105；所述混合吹干的方法为，将一次提取上清液、二次提取上清液混合，控制频率为35-45khz进行超声，超声时间4.5-5.5min，进行氮吹，吹干至体积为原来的8-12%，得到吹干提取液；所述衍生的方法为，向吹干提取液中加入200μl 3-氨基苯硼酸-乙腈溶液，保持水浴温度为75℃，衍生30min，氮吹，吹干至吹干至体积为原来的50%，用甲醇定容至1ml，经0.22μm有机相微孔滤膜过滤，得到待测液；所述3-氨基苯硼酸-乙腈溶液中，3-氨基苯硼酸与乙腈的体积比为1:1000。
10.所述检测的方法为，将待测液进行液相色谱测定，液相色谱条件如下：色谱柱为gemini c
18 150mm*4.6mm（i.d），粒径5μm；柱温为40℃；流速为0.5ml/min；进样量为5μl；流动相a为乙腈，流动相b为超纯水；洗脱条件为流动相a和流动相b按体积比90:10进行等度洗脱，洗脱时间为7min。
11.与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：本发明的检测方法精密度高，精密度测定的rsd为0.87-1.57%；本发明的检测方法在不同加标浓度下回收率稳定，回收率为97.4-103.5%。
具体实施方式
12.实施例1（1）样品前处理a、研磨将通过1mm的筛孔的风干土壤样品、无孔陶瓷球混合，加入去离子水，升温至100℃，控制速度为450rpm，进行研磨，研磨时间70min，保持温度为85℃，用氮气吹干至无去离子水，得到研磨料；所述无孔陶瓷求的粒径为1.5mm；
所述风干土壤样品与无孔陶瓷球的质量比为4:5；所述去离子水与风干土壤样品的质量比为5:3；b、烘制将研磨料置于真空烘箱中，控制真空度为40pa，控制温度为155℃，烘制150min，然后调节真空度为20pa，调节温度为205℃，烘制50min，冷却，将无孔陶瓷球分离，得到前处理样品。
13.（2）提取a、一次提取准确称取前处理样品2g（精确至0.01g），置于50ml塑料离心管中，加入10ml甲酸-甲醇溶液，涡旋60s，控制频率为35khz进行超声，超声时间30min，然后控制转速为4000r/min进行离心，离心时间5min，取上清液，得到一次提取上清液、一次提取土壤；所述甲酸-甲醇溶液中，甲酸与甲醇的体积比为1:1000；b、二次提取取一次提取土壤，置于50ml塑料离心管中，加入10ml乙醇-三氯甲烷溶液，涡旋90s，控制频率为45khz进行超声，超声时间15min，然后控制转速为6000r/min进行离心，离心时间5min，取上清液，得到二次提取上清液；所述乙醇-三氯甲烷溶液中，乙醇与三氯甲烷的体积比为1:100；c、混合吹干将一次提取上清液、二次提取上清液混合，控制频率为40khz进行超声，超声时间5min，进行氮吹，吹干至体积为原来的10%，得到吹干提取液；（3）衍生向吹干提取液中加入200μl 3-氨基苯硼酸-乙腈溶液，保持水浴温度为75℃，衍生30min，氮吹，吹干至吹干至体积为原来的50%，用甲醇定容至1ml，经0.22μm有机相微孔滤膜过滤，得到待测液；所述3-氨基苯硼酸-乙腈溶液中，3-氨基苯硼酸与乙腈的体积比为1:1000。
14.（4）检测将待测液进行液相色谱测定，液相色谱条件如下：色谱柱为gemini c
18 150mm*4.6mm（i.d），粒径5μm；柱温为40℃；流速为0.5ml/min；进样量为5μl；流动相a为乙腈，流动相b为超纯水；洗脱条件为流动相a和流动相b按体积比90:10进行等度洗脱，洗脱时间为7min。
15.实施例2（1）样品前处理a、研磨将通过0.8mm的筛孔的风干土壤样品、无孔陶瓷球混合，加入去离子水，升温至90℃，控制速度为500rpm，进行研磨，研磨时间60min，保持温度为80℃，用氮气吹干至无去离子水，得到研磨料；
所述无孔陶瓷求的粒径为1.2mm；所述风干土壤样品与无孔陶瓷球的质量比为4:4.5；所述去离子水与风干土壤样品的质量比为4:3；b、烘制将研磨料置于真空烘箱中，控制真空度为35pa，控制温度为160℃，烘制140min，然后调节真空度为15pa，调节温度为210℃，烘制40min，冷却，将无孔陶瓷球分离，得到前处理样品。
16.（2）提取a、一次提取准确称取前处理样品2g（精确至0.01g），置于50ml塑料离心管中，加入8ml甲酸-甲醇溶液，涡旋50s，控制频率为30khz进行超声，超声时间35min，然后控制转速为3800r/min进行离心，离心时间6min，取上清液，得到一次提取上清液、一次提取土壤；所述甲酸-甲醇溶液中，甲酸与甲醇的体积比为1:800；b、二次提取取一次提取土壤，置于50ml塑料离心管中，加入8ml乙醇-三氯甲烷溶液，涡旋80s，控制频率为40khz进行超声，超声时间17min，然后控制转速为5500r/min进行离心，离心时间5.5min，取上清液，得到二次提取上清液；所述乙醇-三氯甲烷溶液中，乙醇与三氯甲烷的体积比为1:95；c、混合吹干将一次提取上清液、二次提取上清液混合，控制频率为35khz进行超声，超声时间5.5min，进行氮吹，吹干至体积为原来的8%，得到吹干提取液；（3）衍生向吹干提取液中加入200μl 3-氨基苯硼酸-乙腈溶液，保持水浴温度为75℃，衍生30min，氮吹，吹干至吹干至体积为原来的50%，用甲醇定容至1ml，经0.22μm有机相微孔滤膜过滤，得到待测液；所述3-氨基苯硼酸-乙腈溶液中，3-氨基苯硼酸与乙腈的体积比为1:1000。
17.（4）检测将待测液进行液相色谱测定，液相色谱条件如下：色谱柱为gemini c
18 150mm*4.6mm（i.d），粒径5μm；柱温为40℃；流速为0.5ml/min；进样量为5μl；流动相a为乙腈，流动相b为超纯水；洗脱条件为流动相a和流动相b按体积比90:10进行等度洗脱，洗脱时间为7min。
18.实施例3（1）样品前处理a、研磨将通过1.5mm的筛孔的风干土壤样品、无孔陶瓷球混合，加入去离子水，升温至95℃，控制速度为480rpm，进行研磨，研磨时间65min，保持温度为90℃，用氮气吹干至无去离
子水，得到研磨料；所述无孔陶瓷求的粒径为2.0mm；所述风干土壤样品与无孔陶瓷球的质量比为4:5.5；所述去离子水与风干土壤样品的质量比为6:3；b、烘制将研磨料置于真空烘箱中，控制真空度为45pa，控制温度为150℃，烘制160min，然后调节真空度为25pa，调节温度为200℃，烘制60min，冷却，将无孔陶瓷球分离，得到前处理样品。
19.（2）提取a、一次提取准确称取前处理样品2g（精确至0.01g），置于50ml塑料离心管中，加入12ml甲酸-甲醇溶液，涡旋70s，控制频率为40khz进行超声，超声时间25min，然后控制转速为4500r/min进行离心，离心时间4min，取上清液，得到一次提取上清液、一次提取土壤；所述甲酸-甲醇溶液中，甲酸与甲醇的体积比为1:1200；b、二次提取取一次提取土壤，置于50ml塑料离心管中，加入12ml乙醇-三氯甲烷溶液，涡旋100s，控制频率为50khz进行超声，超声时间12min，然后控制转速为6500r/min进行离心，离心时间4.5min，取上清液，得到二次提取上清液；所述乙醇-三氯甲烷溶液中，乙醇与三氯甲烷的体积比为1:105；c、混合吹干将一次提取上清液、二次提取上清液混合，控制频率为45khz进行超声，超声时间4.5min，进行氮吹，吹干至体积为原来的12%，得到吹干提取液；（3）衍生向吹干提取液中加入200μl 3-氨基苯硼酸-乙腈溶液，保持水浴温度为75℃，衍生30min，氮吹，吹干至吹干至体积为原来的50%，用甲醇定容至1ml，经0.22μm有机相微孔滤膜过滤，得到待测液；所述3-氨基苯硼酸-乙腈溶液中，3-氨基苯硼酸与乙腈的体积比为1:1000。
20.（4）检测将待测液进行液相色谱测定，液相色谱条件如下：色谱柱为gemini c
18 150mm*4.6mm（i.d），粒径5μm；柱温为40℃；流速为0.5ml/min；进样量为5μl；流动相a为乙腈，流动相b为超纯水；洗脱条件为流动相a和流动相b按体积比90:10进行等度洗脱，洗脱时间为7min。
21.对比例1在实施例1的基础上，省去样品前处理步骤，其余步骤相同，进行检测。
22.对比例2在实施例1的基础上，提取步骤中，省去二次提取步骤，一次提取后，将一次提取液
超声，控制频率为40khz，超声5min，氮吹，吹干至体积为原来的10%，得到吹干提取液，其余步骤相同，进行检测。
23.实施例4精密度测定测试样品为黑垆土土壤标准物质gbw07494(htsb-2)，称取足量土壤成分分析标准物质，进行加标，芸苔素内酯加标量为0.006g/g，分别用实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2的方法检测，平行测定6次，统计计算，测定结果见表1。
24.实施例5空白加标回收率测定测试样品为黑垆土土壤标准物质gbw07494(htsb-2)，称取足量土壤成分分析标准物质，分为五组，分别进行加标，芸苔素内酯加标量为0.002g/g、0.005 g/g 、0.0100g/g、0.025g/g、0.050g/g，分别用实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2的方法检测，测定其芸苔素内酯含量并统计计算，计算加标回收率，测定结果见表2。计算，计算加标回收率，测定结果见表2。