细胞外囊泡的回收方法和采血管与流程

1.本发明涉及细胞外囊泡的回收方法和采血管等。


背景技术：

2.细胞外囊泡(extracellular vesicle：ev)从各种种类的细胞中分泌，是具有膜结构的微小的囊泡，存在于血液等体液中。作为向细胞外分泌的细胞外囊泡，例如，已知有外泌体(exosome)、微囊泡(ectosome)、凋亡泡(apoptotic ble b)。细胞外囊泡包含具有细胞间信息传递等功能的各种物质，因此以诊断、制药等为目的而对其进行了分析。因此，需要开发能够在这样的分析中应用的、对细胞外囊泡的回收有用的手法。
3.例如，专利文献1中记载了：缓冲液中的细胞外囊泡与抗cd抗体之间的免疫反应(更具体而言，通过使用磁性粒子和清洗缓冲液，血清与缓冲液的液体介质进行了交换的细胞外囊泡含有缓冲液与抗cd抗体之间的免疫反应)中的非特异吸附可以通过非离子性表面活性剂来抑制(试验例4、图2)。
4.专利文献2中记载了：虽然在小于约3.0mg/ml(约8mm)这一低浓度的edta(螯合剂)的存在下能够提高细胞外囊泡的回收量，但在比这更高的浓度的edta的存在下不仅不能提高细胞外囊泡的回收量，反而会使回收量显著降低(实施例1、图1a～1c)。
5.然而，在临床的血液检查的场景中，作为血液样品，广泛使用可以由全血制备的血浆和血清。此外，已知由于红细胞的破坏而引起的溶血会对血液检查的结果产生影响，因此认为需要避免溶血。并且，在用于制备血液样品的全血的处理中，从处理的简便性和迅速性等的观点出发，临床场景中广泛使用采血管。
6.现有技术文献
7.专利文献
8.专利文献1：国际公开第2015/068772号
9.专利文献2：美国专利申请公开第2015/0125864a1说明书


技术实现要素：

10.本发明所要解决的技术问题
11.本发明的目的在于：提供对细胞外囊泡的回收有用的手法。
12.解决技术问题的技术手段
13.本发明者们进行了深入研究的结果，发现：通过将非离子性表面活性剂和螯合剂与全血混合，能够使从全血中回收的细胞外囊泡的量显著提高。
14.一般而言，表面活性剂会破坏脂质双分子层而引起红细胞的破坏导致的溶血，因此，在临床场景中，认为在以血液检查为前提的全血的处理中要避免表面活性剂使用。然而，从通过选择使用表面活性剂中的非离子性表面活性剂(特别是，特定的非离子性表面活性剂)，能够易于避免溶血这一点来看，通过将这样的非离子性表面活性剂与螯合剂组合使用，不仅能够使从全血中回收的细胞外囊泡的量显著提高，还能够期待溶血的减少或避免
溶血。因此，通过将非离子性表面活性剂和螯合剂适用于全血，能够制备不仅能在细胞外囊泡的分析中使用，还能在通常的血液检查中使用的通用性高的血液样品。
15.专利文献1中，如上所述，记载了通过非离子性表面活性剂能够抑制缓冲液中的细胞外囊泡与抗cd抗体之间的免疫反应中的非特异吸附。但是，专利文献1中没有记载：将全血与非离子性表面活性剂混合(使非离子性表面活性剂对全血进行作用)；和通过该混合能够使细胞外囊泡的回收量提高。此外，从可以认为通过将非离子性表面活性剂和螯合剂与全血混合所带来的从全血中回收的细胞外囊泡的量的提高与免疫反应中的非特异吸附的抑制是相互独立的2个效果这一点来看(实施例5)，专利文献1中对于本发明没有技术启示或教导。
16.本发明者们还发现，通过利用非离子性表面活性剂和螯合剂这两者，可以制作能够使从全血中回收的细胞外囊泡的量显著提高的采血管、以及不仅能在细胞外囊泡的分析中使用，还能在通常的血液检查中使用的、具有高通用性的采血管，从而完了本发明。
17.即，本发明如下。
18.1.19.一种细胞外囊泡的回收方法，其包含：
20.(1)将全血与非离子性表面活性剂和螯合剂混合，生成包含细胞外囊泡、非离子性表面活性剂和螯合剂的混合液的步骤；以及
21.(2)从所述混合液中分离细胞外囊泡的步骤。
22.2.23.根据[1]所述的方法，其中，
[0024]
非离子性表面活性剂为具有聚氧乙烯醇结构的非离子性表面活性剂。
[0025]
[3]
[0026]
根据[2]所述的方法，其中，
[0027]
具有聚氧乙烯醇结构的非离子性表面活性剂为醇乙氧基化物。
[0028]
[4]
[0029]
根据[2]所述的方法，其中，
[0030]
具有聚氧乙烯醇结构的非离子性表面活性剂为聚氧乙烯-聚氧化烯嵌段共聚物。
[0031]
[5]
[0032]
根据[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，
[0033]
非离子性表面活性剂为hlb 18以上的非离子性表面活性剂。
[0034]
[6]
[0035]
根据[1]～[5]中任一项所述的方法，其中，
[0036]
所述混合液中的非离子性表面活性剂的浓度为0.01～10重量/体积％。
[0037]
[7]
[0038]
根据[1]～[6]中任一项所述的方法，其中，
[0039]
螯合剂为羟乙基亚氨基二乙酸(hida)、次氮基三乙酸(nta)、羟乙基乙二胺三乙酸(hedta)、乙二胺四乙酸(edta)、乙二胺四(亚甲基膦酸)(edtmp)、乙二醇醚二胺四乙酸(egta)、或它们的盐。
[0040]
[8]
[0041]
根据[1]～[7]中任一项所述的方法，其中，
[0042]
所述混合液中的螯合剂的浓度为10mm～1000mm。
[0043]
[9]
[0044]
根据[1]～[8]中任一项所述的方法，其中，
[0045]
混合在将全血装入包含非离子性表面活性剂和螯合剂的采血管后进行。
[0046]
[10]
[0047]
根据[1]～[9]中任一项所述的方法，其中，
[0048]
分离通过下述(a)～(c)中的任一种进行：
[0049]
(a)从所述混合液中分离得到上清；
[0050]
(b)对所述混合液使用与细胞外囊泡的表面标记结合的物质；或
[0051]
(c)从所述混合液中分离得到上清、以及对上清使用与细胞外囊泡的表面标记结合的物质。
[0052]
[11]
[0053]
根据[1]～[10]中任一项所述的方法，其中，
[0054]
细胞外囊泡为外泌体。
[0055]
[12]
[0056]
一种细胞外囊泡的分析方法，其包含：
[0057]
(1)将全血与非离子性表面活性剂和螯合剂混合，生成包含细胞外囊泡、非离子性表面活性剂和螯合剂的混合液的步骤；
[0058]
(2)从所述混合液中分离细胞外囊泡的步骤；以及
[0059]
(3)对细胞外囊泡进行分析的步骤。
[0060]
[13]
[0061]
一种采血管，其包含非离子性表面活性剂和螯合剂。
[0062]
[14]
[0063]
根据[13]所述的采血管，其中，
[0064]
采血管中的非离子性表面活性剂的量为0.1～2000mg。
[0065]
[15]
[0066]
根据[13]或[14]所述的采血管，其中，
[0067]
采血管中的螯合剂的量为3.8～3800mg。
[0068]
发明的效果
[0069]
本发明的方法能够使从全血中回收的细胞外囊泡的量显著提高，并且还能够期待溶血的减少或避免溶血。
[0070]
本发明的采血管能够使从全血中回收的细胞外囊泡的量显著提高，并且不仅能在细胞外囊泡的分析中使用，还能在通常的血液检查中使用，具有高通用性。
具体实施方式
[0071]
本发明提供一种包含以下步骤的细胞外囊泡的回收方法：
[0072]
(1)将全血与非离子性表面活性剂和螯合剂混合，生成包含细胞外囊泡、非离子性表面活性剂和螯合剂的混合液的步骤；以及
[0073]
(2)从所述混合液中分离细胞外囊泡的步骤。
[0074]
全血可以从动物中采集。作为动物，例如，可以举出哺乳动物(例如，人类、猴子等灵长类；小鼠、大鼠、兔子等啮齿类；牛、猪、山羊、马、绵羊等有蹄类、狗、猫等食肉类)、鸟类(例如，鸡)。优选动物为人类等哺乳动物。
[0075]
全血包含细胞外囊泡。因此，通过将全血与非离子性表面活性剂和螯合剂混合，生成包含细胞外囊泡、非离子性表面活性剂和螯合剂的混合液。
[0076]
细胞外囊泡从各种种类的细胞中分泌，是具有膜结构的微小的囊泡。作为细胞外囊泡，例如，可以举出外泌体、微囊泡和凋亡泡。优选细胞外囊泡为外泌体。细胞外囊泡还可以根据其尺寸而规定。细胞外囊泡的尺寸例如为30～1000nm，优选为50～300nm，更优选为80～200nm。细胞外囊泡的尺寸的测定可以通过nanosight(malvern instruments公司制)进行。
[0077]
细胞外囊泡还可以通过细胞外囊泡标记而规定。作为这样的细胞外囊泡标记，例如可以举出细胞外囊泡的内部标记和表面标记。作为细胞外囊泡的内部标记，例如可以举出癌胚抗原(cea)、ca125、ca15-3、肌动蛋白家族、tsg101、alix、带电多囊体蛋白(charged multivesicular body protein，ch mp)家族、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，gapdh)、聚(adp-核糖)聚合酶(poly(adp-ribose)polymerase，parp)家族、afp、ca19-9、flotillin-i、flotillin-ii、rab蛋白、programmed cell death(pdc d)6、磷脂爬行酶(phospholipid scramblase，plscr)家族、细胞色素c氧化酶(cox)家族、核纤层蛋白家族、增殖细胞核抗原(pcna)、微管蛋白家族、ta ta结合蛋白(tbp)、电位依赖性阴离子通道蛋白(vdac)、淀粉样蛋白β、ta u蛋白。作为细胞外囊泡的表面标记，例如可以举出四跨膜蛋白(细胞外囊泡膜特异性四次跨膜蛋白，例如，cd9、cd63、cd81)、细胞外基质金属蛋白酶诱导物质(例如，cd147)、热休克蛋白(hsp)70、hsp90、主要组织相容性复合体(mhc)i、溶酶体相关膜蛋白(lamp)1、细胞间粘附分子(icam)-1、整合素、神经酰胺、胆固醇、磷脂酰丝氨酸、膜联蛋白(annexins)、caveolin-i、epcam。细胞外囊泡标记优选为细胞外囊泡表面标记，更优选为四跨膜蛋白，进一步优选为cd9。
[0078]
在本发明中，通过使用表面活性剂中的非离子性表面活性剂，能够减少或避免溶血。作为非离子性表面活性剂，可使用任意的非离子性表面活性剂，优选使用具有聚氧乙烯醇结构的非离子性表面活性剂。
[0079]
具有聚氧乙烯醇结构的非离子性表面活性剂优选为包含-o-(-ch
2-ch
2-o-)
x-h所表示的结构(聚氧乙烯醇结构)的直链或支链化合物(不包含环状结构的化合物)。x可以为1以上的整数，优选为10以上的整数，更优选为20以上的整数，进一步优选为30以上的整数，特别优选为40以上的整数。x还可以为400以下的整数，优选为350以下的整数，更优选为300以下的整数，进一步优选为280以下的整数，特别优选为270以下的整数。更具体而言，x可以为1～400的整数，优选为10～350的整数，更优选为20～300的整数，进一步优选为30～280以下的整数，特别优选为40～270以下的整数。在本说明书中，x的值表示平均值。
[0080]
具有聚氧乙烯醇结构的非离子性表面活性剂可以仅包含单键，或也可以包含不饱和键(双键/三键)，优选为仅包含单键的化合物。就这样的化合物而言，作为聚氧乙烯醇结构以外的结构，例如，可以包含烷基结构(直链或支链)和/或聚氧化烯结构(直链或支链)。烷基结构例如可以为c
6～31
烷基结构，优选为c
6～31
直链烷基结构。聚氧化烯结构中的亚烷基
例如可以为c
1～6
亚烷基。作为c
1～6
亚烷基，例如可以举出c1亚烷基(亚甲基)、c2亚烷基(亚乙基、乙叉基)、c3亚烷基(丙叉基、亚丙基、三亚甲基、异丙叉基)、c4亚烷基(例如，四亚甲基)、c5亚烷基(例如，五亚甲基)、c6亚烷基(例如，六亚甲基)。这样的化合物可以包含碳原子、氢原子和氧原子。
[0081]
更具体而言，作为具有聚氧乙烯醇结构的非离子性表面活性剂，例如可以举出醇乙氧基化物、和聚氧乙烯-聚氧化烯嵌段共聚物(例如，聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)。
[0082]
醇乙氧基化物也被称为聚(氧乙烯)烷基醚，是亲水性的聚氧乙烯(poe)链与疏水性的烷基通过醚键结合而得到的化合物。醇乙氧基化物可以通过下述式(1)表示。
[0083]
[化学式1]
[0084][0085]
(式中，x1为1以上的整数；
[0086]
y1为0以上的整数；
[0087]
z1为0以上的整数；
[0088]
y1≥z1)。
[0089]
本说明书中，x1、y1和z1的值表示平均值。
[0090]
x1可以为1以上的整数，优选为10以上的整数，更优选为20以上的整数，进一步优选为30以上的整数，特别优选为40以上的整数。x1还可以为300以下的整数，优选为250以下的整数，更优选为200以下的整数，进一步优选为150以下的整数，特别优选为100以下、80以下、60以下或50以下的整数。更具体而言，x1可以为1～300的整数，优选为10～250的整数，更优选为20～200的整数，进一步优选为30～150以下的整数，特别优选为40～100、40～80、40～60或40～50的整数。
[0091]
y1为0以上的整数，优选为1以上的整数，更优选为5以上的整数。y1还可以为30以下的整数，优选为20以下的整数，进一步优选为13以下的整数。更具体而言，y1可以为0～30的整数，优选为1～20的整数，进一步优选为5～13的整数。
[0092]
z1为0以上的整数，优选为1以上的整数。z1还可以为15以下的整数，优选为10以下的整数，优选为7。更具体而言，z1可以为0～15的整数，优选为1～10的整数，进一步优选为1～7的整数。
[0093]
可以优选y1和z1满足y1≥z1的关系。y1和z1还可以满足y1 z1为5～30的整数的关系。可以优选满足y1 z1为10～14的整数的关系。
[0094]
醇乙氧基化物可以为支链醇乙氧基化物或直链醇乙氧基化物中的任一种。可以优选醇乙氧基化物为支链醇乙氧基化物。
[0095]
支链醇乙氧基化物对应所述式(1)所表示的化合物中的、y1为1以上的整数，z1为1以上的整数的化合物。作为这样的支链醇乙氧基化物，例如可以举出聚氧乙烯(40)仲十三烷基醚。作为这样的支链醇乙氧基化物的具体例，可以举出tergitol 15-s-40等tergitol(注册商标)系列的化合物。
[0096]
直链醇乙氧基化物对应所述式(1)所表示的化合物中的、z1为0的化合物。作为直链醇乙氧基化物的具体例，可以举出brijs100等brij(注册商标)系列的化合物。直链醇乙氧基化物也可以通过下述式(1’)的形式表示。
[0097]
[化学式2]
[0098]
h-(-ch
2-)
y1-o-(-ch
2-ch
2-o-)
x1-h
ꢀꢀꢀꢀꢀ
(1')
[0099]
(式中，x1为1以上的整数；
[0100]
y1为1以上的整数)。
[0101]
式(1’)中的x1和y1的优选的例子分别与式(1)中的x1和y1的优选的例子相同。
[0102]
优选式(1)所表示的化合物如下。
[0103]
x1为40～100的整数；
[0104]
y1为0以上的整数；
[0105]
z1为0以上的整数；
[0106]
y1≥z1；
[0107]
y1 z1为5～30的整数。
[0108]
(x1、y1和z1的优选的范围与上述相同。)
[0109]
更具体而言，作为属于式(1)所表示的化合物的醇乙氧基化物，例如可以举出tergitol 15-s-40、brijs100。优选醇乙氧基化物为tergitol 15-s-40。
[0110]“聚氧乙烯-聚氧化烯嵌段共聚物”是包含聚氧乙烯嵌段和聚氧化烯嵌段的嵌段共聚物。聚氧化烯嵌段中的亚烷基例如可以为c
1～6
亚烷基，例如，可以举出c1亚烷基(亚甲基)、c2亚烷基(亚乙基、亚乙基)、c3亚烷基(亚丙基、亚丙基、三亚甲基、异丙叉基)、c4亚烷基(例如，四亚甲基)、c5亚烷基(例如，五亚甲基)、c6亚烷基(例如，六亚甲基)。作为聚氧乙烯-聚氧化烯嵌段共聚物，例如可以举出具有ho-[聚氧乙烯嵌段]-[聚氧化烯嵌段]-[聚氧乙烯嵌段]-oh的结构的嵌段共聚物。聚氧乙烯-聚氧化烯嵌段共聚物可以优选为聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。
[0111]“聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物”为下述式(2)所表示的化合物。
[0112]
[化学式3]
[0113]
ho-(-ch
2-ch
2-o-)
x2-((-ch(-ch3))ch
2-o-)
y2-(-ch
2-ch
2-o-)
z2-h
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(2)
[0114]
(式中，x2、y2、z2为1以上的整数)。
[0115]
本说明书中，x2、y2和z2的值表示平均值。
[0116]
x2和z2分别为1以上的整数。x2与z2的合计可以为2以上的整数，优选为20以上的整数，更优选为80以上的整数，特别优选为150以上的整数。x2与z2的合计还可以为400以下的整数，优选为350以下的整数，更优选为300以下的整数，特别优选为270以下的整数。更具体而言，x2与z2的合计可以为2～400的整数，优选为20～350的整数，更优选为80～300的整数，特别优选为150～270的整数。
[0117]
y2可以为1以上的整数，优选为5以上的整数，更优选为10以上的整数，进一步优选为15以上的整数，特别优选为20以上的整数。y2还可以为200以下的整数，优选为150以下的整数，更优选为100以下的整数，进一步优选为80以下的整数，特别优选为70以下的整数。更具体而言，x1可以为1～200的整数，优选为5～150的整数，更优选为10～100的整数，进一步优选为15～80以下的整数，特别优选为20～70的整数。
[0118]
作为聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，例如可以举出泊洛沙姆(poloxamer)188、泊洛沙姆388、泊洛沙姆407等。作为聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物的具体例，例如可以举出pluronic f68、pluronic f108、pluronic f127等plur onic(注册商标)系列的化合物。
[0119]
优选式(2)所表示的化合物如下。
[0120]
x2为1以上的整数；
[0121]
y2为15～80的整数；
[0122]
z2为1以上的整数；
[0123]
x2 z2为80～280的整数。
[0124]
(x2、y2和z2的优选范围与上述相同。)
[0125]
更具体而言，作为属于式(2)所表示的化合物的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，例如可以举出泊洛沙姆188(例如，pluronic f68)、泊洛沙姆108(例如，pluronic f38)、泊洛沙姆217(例如，pluronic f77)、泊洛沙姆237(例如，plur onic f87)、泊洛沙姆238(例如，pluronic f88)、泊洛沙姆288(例如，pluronicf98)、泊洛沙姆388(例如，pluronic f108)、泊洛沙姆407(例如，pluronic f127)。就聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物而言，可以优选地举出泊洛沙姆188(例如，pluronic f68)、泊洛沙姆388(例如，pluronic f108)、泊洛沙姆407(例如，pluronic f127)。
[0126]
在特定的实施方式中，非离子性表面活性剂可以为hlb 18以上的非离子性表面活性剂。hlb值如果在18以上，则能够在更容易避免血细胞成分的溶解的同时回收细胞外囊泡。特别是，从红细胞中含有包含cd9的四跨膜蛋白等ev相关蛋白、除此之外的可能成为杂质的蛋白质这一点来看，在回收细胞外囊泡时，优选避免作为血细胞成分的红细胞的溶解。hlb值可以通过griffin法求得。
[0127]
作为参考，非离子性表面活性剂(醇乙氧基化物/聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)与所述式(1)或(2)所表示的化合物的关系如下表示。
[0128]
[表a]
[0129]
表a.醇乙氧基化物与所述式(1)所表示的化合物的关系(其1)
[0130]
非离子性表面活性剂x1y1 z1y1z1hlbtergitol 15-s-404010-145-131-718
[0131]
[表b]
[0132]
表b.醇乙氧基化物与所述式(1)所表示的化合物的关系(其2)
[0133]
非离子性表面活性剂x1y1hlbbrij s1001001818
[0134]
[表c]
[0135]
表c.聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物与所述式(2)所表示的化合物的关系
[0136]
非离子性表面活性剂x2 z2y2hlbpluronic f388516＞24pluronic f6815329＞24pluronic f7710534＞24pluronic f8712340＞24pluronic f8820739＞24pluronic f9823645＞24pluronic f10826550＞24
pluronic f1272006518-23
[0137]
在本发明中，可以使用1种非离子性表面活性剂，也可以将多种(例如，2种、3种、4种)非离子性表面活性剂组合使用。
[0138]
就在使非离子性表面活性剂作用于全血时的非离子性表面活性剂的浓度而言，只要是通过将非离子性表面活性剂与螯合剂组合使用，能够使从全血中回收的细胞外囊泡的量提高的浓度，就无特别限定。在本发明中，从通过将全血与非离子性表面活性剂和螯合剂混合，生成包含细胞外囊泡、非离子性表面活性剂和螯合剂的混合液这一点来看，使非离子性表面活性剂作用于全血时的非离子性表面活性剂的浓度与这样的混合液中的非离子性表面活性剂的浓度相同。因此，在本发明中，使非离子性表面活性剂作用于全血时的螯合剂的浓度也可以以这样的混合液中的非离子性表面活性剂的浓度的形式而规定。这样的浓度也随着与非离子性表面活性剂组合使用的螯合剂的种类和浓度等因素而变动，例如为0.01～10重量/体积％(w/v％)。可以优选非离子性表面活性剂的浓度为0.02w/v％以上、0.04w/v％以上、0.06w/v％以上、0.08w/v％以上、0.1w/v％以上、0.2w/v％以上或0.5w/v％以上。这样的浓度也可以为8w/v％以下、6w/v％以下、5w/v％以下、4w/v％以下、3w/v％以下、2w/v％以下或1w/v％以下。更具体而言、非离子性表面活性剂的浓度可以为0.02～8w/v％、0.04～6w/v％、0.06～5w/v％、0.08～4w/v％、0.1～3w/v％、0.2～2w/v％或0.5～1w/v％。
[0139]
螯合剂是具有可与金属离子配位键合的配位部分的化合物或其盐。配位部分的个数优选为2个以上，更优选为3个以上(例如，3个或6个)。就作为配位部分的配位原子而言，例如可以举出氧原子、磷原子、氮原子、硫原子和氯原子。配位原子优选为氧原子或磷原子，更优选为氧原子。就作为配位部分的配位基而言，例如可以举出具有所述配位原子的基团。配位基优选为羧酸基或磷酸基，更优选为羧酸基。
[0140]
作为螯合剂，例如可以举出羟乙基亚氨基二乙酸(hida)、次氮基三乙酸(nta)、羟乙基乙二胺三乙酸(hedta)、乙二胺四乙酸(edta)、乙二胺四(亚甲基膦酸)(edtmp)、乙二醇醚二胺四乙酸(egta)、以及它们的盐。作为盐，例如可以举出金属盐(例如，钠盐、钾盐等一价的金属盐、和钙盐、镁盐等二价的金属盐)、无机盐(例如，氟化物、氯化物、溴化物、碘化物等卤化物盐、和铵盐)、有机盐(例如，被烷基取代了的铵盐)、和酸加成盐(例如，与硫酸、盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸等无机酸的盐、和乙酸、草酸、乳酸、柠檬酸、三氟甲磺酸、三氟乙酸等有机酸等的盐)。
[0141]
在特定的实施方式中，螯合剂可以为，作为临床检查用的采血管中包含的成分而广泛使用的螯合剂。作为这样的螯合剂，例如可以举出edta、egta、nta、hedta、edtmp、hida、柠檬酸和它们的盐。在本发明中，这样的螯合剂的使用从临床应用的观点出发，也较为优选。
[0142]
在本发明中，可以单独使用1种螯合剂，也可以将多种(例如，2种、3种、4种)的螯合剂组合使用。
[0143]
就使螯合剂作用于全血时的螯合剂的浓度而言，只要是通过使螯合剂与非离子性表面活性剂组合使用，能够使从全血中回收的细胞外囊泡的量提高的浓度，就无特别限定。在本发明中，从通过将全血与非离子性表面活性剂和螯合剂混合，生成包含细胞外囊泡、非离子性表面活性剂和螯合剂的混合液这一点来看，使螯合剂作用于全血时的螯合剂的浓度与这样的混合液中的螯合剂的浓度相同。因此，在本发明中，使螯合剂作用于全血时的螯合
剂的浓度也可以以这样的混合液中的螯合剂的浓度的形式而规定。这样的浓度也会随着与螯合剂组合使用的非离子性表面活性剂的种类和浓度等因子而变动，例如为10mm～1000mm。可以优选螯合剂的浓度为20mm以上、30mm以上、40mm以上、50mm以上、60mm以上、80mm以上或100mm以上。这样的浓度也可以为800mm以下、600mm以下、500mm以下、450mm以下、400mm以下、350mm以下或300mm以下。更具体而言，螯合剂的浓度可以为20～800mm、30～600mm、40～500mm、50～450mm、60～400mm、80～350mm或100～300mm。
[0144]
工序(1)中的混合可以以任意的样式进行。例如，混合可以通过倒转混和/或搅拌进行。全血、以及非离子性表面活性剂和螯合剂的混合的顺序无特别限定。例如，混合可以通过先将全血与非离子性表面活性剂或螯合剂中的一者混合，再与另一者混合而进行。混合也可以通过将全血与非离子性表面活性剂和螯合剂的混合物混合而进行。就混合时间而言，只要是对全血、以及非离子性表面活性剂和螯合剂的混合而言充分的时间，就无特别限定，例如可以为1秒～30分钟，优选为30秒～5分钟。就混合时的温度而言，例如可以为4～37℃，优选为15～30℃。混合后，混合液可以静置。静置时间例如为1秒～60分钟，可以优选为5秒～20分钟。
[0145]
在特定的实施方式中，混合可以在向包含非离子性表面活性剂和螯合剂的采血管(优选为以密封手段进行了密封的真空采血管)放入全血后进行。在该情况下，作为混合，优选为倒转混和。采血管的详细信息，如后所述。
[0146]
工序(2)中的分离可以以任意的样式进行。例如，分离可以通过下述(a)～(c)中的任一种方式进行：
[0147]
(a)从混合液中分离得到上清；
[0148]
(b)对混合液使用与细胞外囊泡的表面标记结合的物质；或
[0149]
(c)从混合液中分离得到上清，并对上清使用与细胞外囊泡的表面标记结合的物质。
[0150]
对(a)从混合液中分离得到上清进行说明。在本发明中，从添加了螯合剂以及表面活性剂的全血(混合液)中分离得到的上清中存在的细胞外囊泡的量，与从只添加了螯合剂或表面活性剂中的任一者或这两者都没有添加的全血中分离得到的上清中存在的细胞外囊泡的量相比，显著增加这一点得到了证实(实施例)。因此，根据本分离，能够简便并且迅速回收将全血中的大量的杂质除外了的、高浓度的细胞外囊泡(富含细胞外囊泡的上清)。
[0151]
从混合液中分离得到上清可以通过任意的方法进行。作为这样的方法，例如可以举出混合液的离心分离和混合液的静置。从迅速地获得澄清的上清的观点出发，就从混合液中分离得到上清而言，优选在混合液的离心分离后分离得到上清。离心分离可以在通常的离心分离的条件下进行。作为这样的条件，例如也随着离心分离机的转子的旋转半径等因素而变动，可以采用以100～100000
×
g(优选为200～5000
×
g)的旋转速度进行10秒～1小时(优选为1～10分钟)、40℃以下(优选为30℃以下)的条件。如此得到的上清在细胞外囊泡的基础上，可以包含螯合剂以及表面活性剂。如此得到的上清中的螯合剂以及表面活性剂的浓度可以与混合液中的螯合剂以及表面活性剂的浓度相同。
[0152]
就(b)对混合液使用与细胞外囊泡的表面标记结合的物质进行说明。在本发明中，在从添加了螯合剂以及表面活性剂的全血(混合液)中得到的样品中，使用细胞外囊泡的表面标记而测定得到的细胞外囊泡的量，与在从只添加了螯合剂或表面活性剂中的任一者或
这两者都没有添加的全血中得到的样品中，使用细胞外囊泡的表面标记而测定得到的细胞外囊泡的量相比，显著增加这一点得到了证实(实施例)。因此，根据本分离，能够简便并且迅速地大量回收高纯度的细胞外囊泡。
[0153]
作为与细胞外囊泡的表面标记结合的物质，例如可以举出针对所述细胞外囊泡表面标记的抗体、适体、磷脂酰丝氨酸结合蛋白、神经酰胺结合蛋白。在本发明中，作为与细胞外囊泡的表面标记结合的物质，可以使用单一的物质，或使用多种(例如，2种、3种、4种)物质。
[0154]
从对于细胞外囊泡的表面标记的特异性的确保、和制备的简便度等观点出发，可以优选与细胞外囊泡的表面标记结合的物质为针对细胞外囊泡的表面标记的抗体。作为抗体，例如可以举出全长抗体(例如，单克隆抗体、多克隆抗体)和其抗原结合性片段。抗原结合性片段只要是保持有针对作为对象的细胞外囊泡表面标记的结合性的抗体片段即可，可以举出fab、fab’、f(ab’)2、scfv等。在本发明中，可以使用单一的抗体或多种(例如，2种、3种、4种)抗体。
[0155]
与细胞外囊泡的表面标记结合的物质(优选为抗体)可以固定于使细胞外囊泡的分离变得容易的固相。作为固相，例如可以举出珠和粒子(例如，sepharose珠、琼脂糖珠、磁性珠(磁性粒子))、支撑体(例如，塑料板等板、膜)。物质向固相的固定可以通过任意的方法进行。将如此固定于固相的与细胞外囊泡表面标记结合的物质与包含细胞外囊泡的混合液混合，形成与细胞外囊泡表面标记结合的物质与细胞外囊泡的复合体，通过将该复合体从混合液中分离，能够将细胞外囊泡从混合液中分离。例如，在使用珠或粒子作为固相的情况下，通过在复合体形成后进行离心分离，除去上清，能够将细胞外囊泡从混合液中分离。在使用磁性珠作为固相的情况下，也可以通过在复合体形成后进行集磁将上清除去，而将细胞外囊泡从混合液中分离。在使用支撑体作为固相的情况下，通过在复合体形成后除去混合液，能够将细胞外囊泡从混合液中分离。
[0156]
就(c)从混合液中分离得到上清、并对上清使用与细胞外囊泡的表面标记结合的物质而言，可以将所述(a)和(b)组合进行。
[0157]
本发明还提供包含以下步骤的细胞外囊泡的分析方法：
[0158]
(1)将全血与非离子性表面活性剂和螯合剂混合，生成包含细胞外囊泡、非离子性表面活性剂和螯合剂的混合液的步骤；
[0159]
(2)从所述混合液中分离细胞外囊泡的步骤；以及
[0160]
(3)对细胞外囊泡进行分析的步骤。
[0161]
本发明的分析方法中的工序(1)和(2)可以以与本发明的回收方法中的工序(1)和(2)同样的方式进行。
[0162]
在工序(3)中，细胞外囊泡的分析可以在细胞外囊泡的分离后进行，或与细胞外囊泡的分离同时进行。作为细胞外囊泡的分析中的分析对象，例如可以举出细胞外囊泡中包含的成分(例如，细胞外囊泡的内部中包含的成分、细胞外囊泡的膜成分、存在于细胞外囊泡的膜表面的成分)、和细胞外囊泡本身(粒子)。
[0163]
细胞外囊泡中包含的成分的分析可以定性地或定量地进行。这样的分析可以为单成分或多成分的分析。作为分析的成分，例如可以举出蛋白质、核酸(例如，rna、dna)、糖、脂质、氨基酸、维生素类、多胺和肽。根据本发明，由于细胞外囊泡的回收量增加，因此能够高
精度地分析细胞外囊泡中的成分。
[0164]
成分的分析可以通过该领域中公知的任意方法进行。
[0165]
在分析的成分是蛋白质的情况下，作为分析方法，例如可以举出免疫测定、质谱法。作为免疫测定，例如可以举出直接竞争法、间接竞争法和夹心法。此外，作为这样的免疫测定，可以举出化学发光免疫测定(clia)〔例如，化学发光酶免疫测定法(cleia)〕、免疫比浊法(tia)、酶免疫测定法(eia)(例如，直接竞争elisa、间接竞争elisa和夹心elisa)、放射免疫测定(ria)、乳胶凝聚反应法、荧光免疫测定(fia)、和免疫层析法、蛋白质印迹法、免疫染色、荧光激活细胞分选(fluorescence activated cell sorting，facs)。在分析多成分的情况下，也可以进行蛋白质组分析。
[0166]
在分析的成分为核酸的情况下，作为分析方法，例如可以举出使用探针的杂交法、使用引物(例如，2、3或4个引物)的基因扩增法、质谱法。
[0167]
在分析的成分为蛋白质和核酸以外的成分的情况下，作为分析方法，例如可以举出免疫测定、质谱法。在分析多成分的情况下，也可以进行代谢组分析。
[0168]
细胞外囊泡本身(粒子)的分析也可以定性地或定量地进行。例如，细胞外囊泡的分析可以通过粒子分析机器、电子显微镜、流式细胞仪等机器进行。在该情况下，可以分析细胞外囊泡的粒子数、粒子的大小和形状、以及它们的分布。
[0169]
细胞外囊泡被报告可能与癌等各种疾病有关(国际公开第2014/003053号；国际公开第2014/152622号；taylor et al.，gynecologic oncol，100(2008)pp13-21)。因此，本发明例如在基于细胞外囊泡的诊断和制药中是有用的。
[0170]
本发明还提供一种包含非离子性表面活性剂和螯合剂的采血管。
[0171]
作为采血管，可以使用任意形态的采血管，可以优选地使用筒状的采血管。就筒状的采血管而言，优选其截面为环状(例如，圆形、约圆形)。优选采血管为临床检查用的采血管。
[0172]
此外，作为采血管，可以使用未密封的采血管；以及以橡胶栓、膜片等的密封手段进行了密封的真空采血管。从能够容易地回收来自注射器的一定量的血液、以及采血管中包含的非离子性表面活性剂和螯合剂的保持等观点出发，优选如上所述的以密封手段进行了密封的真空采血管。真空采血管中的减压的程度可以根据采血量等因素而适宜设定。
[0173]
作为采血管的材料，可以使用任意的材料，可以优选使用无色透明的材料。作为这样的材料，例如可以举出玻璃、塑料(例如，聚乙烯对苯二甲酸酯)。
[0174]
就本发明中使用的采血管的尺寸而言，可以根据其能够容纳的全血的容量而规定。例如，作为采血管，适于容纳1～10ml的全血的尺寸的采血管在临床检查中广泛使用。因此，在本发明中，可以适宜地使用这样的尺寸的采血管。当然，在本发明中，根据目的，也可以适宜地使用小于1ml的尺寸(例如，0.5ml以上且小于1.0ml)、或超过10ml的尺寸的采血管(例如，超过10ml且为15ml以下)。
[0175]
采血管中包含的非离子性表面活性剂和螯合剂的详细内容与本发明的方法中所述的内容相同。非离子性表面活性剂和螯合剂只要包含在采血管中，其形态就无特别限定。例如，非离子性表面活性剂和螯合剂分别可以以液体、或固体(例如，粉末)的形态包含在采血管中。非离子性表面活性剂和螯合剂还可以以作为液体或固体而积聚在采血管的底部的样式而提供，此外，也可以以涂层或含浸在采血管(和密封手段)的内侧的样式而提供。采血
管中包含的非离子性表面活性剂和螯合剂分别可以是1种，也可以是多种(例如，2种、3种、4种)。
[0176]
就非离子性表面活性剂和螯合剂而言，优选以在将全血添加至采血管中，与全血进行了混合的情况下，能够达成如上所述的混合液中的非离子性表面活性剂和螯合剂的所述浓度的量而包含在采血管中。这样的非离子性表面活性剂的量虽然也随着采血管的尺寸、添加的全血的容量等因素而变动，但例如可以为0.1～2000mg(全血每1ml为0.1mg～200mg)，优选为0.2～1500mg(全血每1ml为0.2mg～150mg)，更优选为0.5～1000mg(全血每1ml为0.5mg～100mg)，进一步优选为1～700mg(全血每1ml为1mg～70mg)，特别优选为2mg～500mg(全血每1ml为2mg～50mg)。这样的螯合剂的量虽然也随着采血管的尺寸、添加的全血的容量等因素而变动，但例如可以为3.8～3800mg(全血每1ml为3.8～380mg)，优选为7.6～1900mg(全血每1ml为7.6～190mg)，更优选为15.2～1500mg(全血每1ml为15.2～150mg)，进一步优选为30.4～1200mg(全血每1ml为30.4～120mg)，特别优选为60.8～1000mg(全血每1ml为60.8～100mg)。
[0177]
在特定的实施方式中，螯合剂可以是作为临床检查用的采血管中包含的成分而广泛使用的所述螯合剂。从临床应用的观点出发，在采血管中使用这样的螯合剂也是优选的。
[0178]
在其他特定的实施方式中，采血管可以进一步包含1种以上的临床检查用的采血管中包含的螯合剂以外的通用成分。因此，采血管可以进一步包含选自肝素或其盐、以及氟化物(例如，氟化钠)中的1种以上的通用成分。作为盐，可以举出上述的盐。
[0179]
包含非离子性表面活性剂和螯合剂的本发明的采血管能够使从全血中回收的细胞外囊泡的量显著提高，因此对可用于细胞外囊泡的分析的血液样品的制备是有用的。本发明的采血管还由于包含作为通常的血液检查用采血管中包含的抗凝成分的螯合剂、以及能够减少或避免溶血的非离子性表面活性剂，因此对不仅可以用于细胞外囊泡的分析、在通常的血液检查中也可以使用的通用性高的血液样品的制备是有用的。本发明的采血管还可以适宜地用于本发明的方法，因此对本发明的方法的简便且迅速的实施是有用的。
[0180]
实施例
[0181]
以下，将通过实施例详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。需要说明的是，实施例中记载的％都表示w/v％。
[0182]
(材料和方法)
[0183]
(1)抗体固相化粒子(固相抗体)的制备
[0184]
在10mm mes缓冲液(ph5.0)中向磁性粒子0.01g/ml添加识别作为细胞外囊泡(ev)表面标记的cd9的小鼠抗cd9单克隆抗体(fujirebio公司)0.2mg/ml，在25℃下一边缓慢搅拌一边孵育1小时。反应后，将磁性粒子集磁，用清洗液(50mm tris缓冲液，150mm nacl2，2.0％bsa，ph7.2)清洗粒子，得到了抗cd9抗体固相化粒子。将各抗体固相化粒子悬浮于粒子稀释液(50mm tris缓冲液，1mm edta
·
2na，0.1％nan3，2.0％bsa，ph7.2)中，得到了各抗体固相化粒子溶液。
[0185]
(2)碱性磷酸酶标记抗体的制备
[0186]
将脱盐的碱性磷酸酶(alp)与n-(4-马来酰亚胺丁酰氧基)-琥珀酰亚胺(gmbs)(终浓度0.3mg/ml)混合，在30℃下静置1小时进行了alp的马来酰亚胺化。接下来，在偶联用反应液(100mm磷酸缓冲液，1mm edta
·
2na，ph6.3)中，将fab’化的小鼠抗cd9单克隆抗体与马
来酰亚胺化alp以1:1的摩尔比混合，在25℃下进行了1小时反应。将反应液用superdex200柱层析(general electric公司)进行纯化，得到了alp标记抗cd9抗体。将各alp标记抗体悬浮于标记体稀释液(50mm mes缓冲液，150mm nacl2，0.3mm zncl2，1mm mgcl2，0.1％nan3，2.0％bsa，ph6.8)，得到了各标记抗体溶液。
[0187]
(3)ev表面标记(cd9)的测定方法
[0188]
以下的实施例中的ev表面标记(cd9)的测定方法如下。
[0189]
将测定用样品20μl以及抗cd9抗体固相化粒子溶液50μl分注至反应槽中，并搅拌。然后，将得到的混合液在37℃下孵育8分钟(一次反应)，进行了b(结合)/f(游离)分离
·
清洗。将alp标记抗体50μl分注至反应槽中，搅拌后在37℃下孵育8分钟，进行了b/f分离
·
清洗。然后，将包含作为化学发光基质的3-(2
’‑
螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3
”‑
磷酰氧基)苯基-1,2-二氧杂环丁烷
·
2钠盐(amppd)的lumipulse(注册商标)基质液(fujirebio公司)200μl分注至反应槽中，搅拌后在37℃下孵育4分钟后，用光度计测定了发光量。作为测定值，得到了计数值。发光量的测定通过全自动化学发光酶免疫测定系统(lumipulse l2400(fujirebio公司))进行。
[0190]
固相化至磁性粒子的抗体和alp标记抗体使用了识别cd9中的同一表位的抗体。由于在一个细胞外囊泡上存在多个cd9，因此通过使用与固相化抗体识别同一表位的抗体作为alp标记抗体的夹心免疫测定，能够针对不是作为游离cd9而是作为表面标记而呈现多个cd9的细胞外囊泡进行测定。
[0191]
实施例1：从添加了螯合剂的全血中回收细胞外囊泡(ev)
[0192]
向人类全血中添加螯合剂，离心分离后，对上清中的cd9进行了测定。作为螯合剂，使用了乙二胺四乙酸二钠(edta
·
2na)、乙二醇醚二胺四乙酸(egta)、次氮基三乙酸(nta)、羟乙基乙二胺三乙酸(hedta)、乙二胺四(亚甲基膦酸)(edtmp)、以及羟乙基亚氨基二乙酸(hida)。
[0193]
更具体而言，向加入了添加有各螯合剂的d-pbs(-)100μl的聚丙烯制5ml试验管(nunc制)中，添加采血后的全血900μl。螯合剂以与全血混合后的终浓度为15mm的方式而添加。添加全血后，将试验管倒转混和，在室温下静置30分钟，进行离心分离(hitachi cf5re，3000rpm(2130xg)，5分钟，室温)，回收上清，通过(材料与方法)中所述的方法，对作为细胞外囊泡(ev)的表面标记蛋白的cd9进行测定，得到了计数值。作为对照组(未添加)，使用未添加螯合剂的d-pbs(-)，以同样的方式进行了测定。
[0194]
其结果，对于进行了探讨的所有螯合剂而言，从添加了螯合剂的全血中制备得到的上清与从未添加螯合剂的全血中制备得到的上清相比，表现出了显著更高的计数值(表1)。这表示，从添加了螯合剂的全血中制备得到的上清中存在的ev的量与从未添加螯合剂的全血中制备得到的上清中存在的ev的量相比显著增加。
[0195]
因此，可以看出，通过将螯合剂添加至全血中，能够使ev的回收量显著增加。
[0196]
[表1]
[0197]
表1.从添加了螯合剂的全血中回收ev
[0198][0199]
实施例2：添加了表面活性剂的全血中有无溶血的确认
[0200]
向人类全血中添加表面活性剂，对溶血的有无进行了确认。作为非离子性表面活性剂，使用了tergitol 15-s-30、brij 35、pluronic f68、tween20、以及pvpk30。作为阳离子性表面活性剂，使用了辛基三甲基溴化铵(c8tab)、以及十六烷基三甲基氯化铵(c16tac)。作为阴离子性表面活性剂，使用了n-癸酰基肌氨酸钠(n-dss(nds))、以及n-月桂酰肌氨酸钠水合物(nls)。作为两离子性表面活性剂，使用了chaps、以及n-十二烷基-n，n-二甲基-3-氨-1-丙烷磺酸盐(c12aps)。
[0201]
更具体而言，向加入了添加有表面活性剂的d-pbs(-)100μl的聚丙烯制5ml试验管(nunc制)中，添加采血后的全血900μl。表面活性剂以与全血混合后的终浓度为0.5w/v％的方式而添加。添加全血后，将试验管倒转混和，在室温下静置30分钟，进行离心分离(3000rpm，5分钟)，回收上清，以肉眼观察确认了溶血的有无。
[0202]
其结果，确认了tween、brij、tergitol这样的非离子性表面活性剂不会引起溶血(表2)。
[0203]
[表2]
[0204]
表2.添加了表面活性剂的全血中有无溶血的确认
[0205]
表面活性剂样本1样本2tween20
‑‑
tergitol 15-s-30
‑‑
brij 35
‑‑
pluronic f68
‑‑
c8tab
‑‑
c16tac溶血溶血n-dss(nds)溶血溶血nls溶血溶血chaps溶血溶血c12aps溶血溶血pvpk30
‑‑
[0206]
实施例3：从添加了螯合剂和表面活性剂的全血中回收ev
[0207]
向人类全血中添加螯合剂和表面活性剂，离心分离后对上清中的cd9进行了测定。作为螯合剂，使用了edta
·
2na以及egta。作为表面活性剂，使用了tergitol15-s-40。
[0208]
首先，将添加有螯合剂的d-pbs(-)100μl、以及添加有表面活性剂的d-pbs(-)100μl加入至聚丙烯制5ml试验管(nunc制)中，制作了包含螯合剂以及表面活性剂的采血管模型。在该采血管模型的制作中，螯合剂以与全血混合后的终浓度为60mm的方式而设定。表面活性剂以与全血混合后的终浓度为0.5％的方式而设定。
[0209]
接下来，向该试验管(采血管模型)中，添加采血后的全血800μl。添加全血后，将试
验管倒转混和，在室温下静置30分钟，进行离心分离(3000rpm，5分钟)，回收上清，通过(材料与方法)中所述的方法，对作为细胞外囊泡(ev)的表面标记蛋白的cd9进行了测定。
[0210]
此外，作为比较对象，制作了不包含螯合剂和表面活性剂的采血管、以及包含螯合剂但不包含表面活性剂的采血管，同样地对cd9进行了测定。
[0211]
其结果，与螯合剂的种类无关，从添加了螯合剂以及表面活性剂的全血中制备得到的上清与从添加了螯合剂而未添加表面活性剂的全血中制备得到的上清相比，表现出了显著更高的计数值(表3)。这表示，从添加了螯合剂以及表面活性剂的全血中制备得到的上清中存在的ev的量与从添加了螯合剂而未添加表面活性剂的全血中制备得到的上清中存在的ev的量相比显著增加。
[0212]
因此，可以看出，通过将螯合剂以及表面活性剂添加至全血中，能够使ev的回收量显著地增加。
[0213]
[表3]
[0214]
表3.从添加了螯合剂和表面活性剂的全血中回收ev
[0215][0216]
实施例4：螯合剂以及表面活性剂的浓度的探讨
[0217]
向人类全血中，添加各种浓度的螯合剂和表面活性剂，对离心分离后上清中的cd9进行了测定。
[0218]
首先，将添加有各种浓度的egta的d-pbs(-)100μl、以及添加有各种浓度的tergitol15-s-40的d-pbs(-)100μl加入至聚丙烯制5ml试验管(nunc制)中，制作了包含螯合剂以及表面活性剂的采血管模型。在该采血管模型的制作中，egta以与全血混合后的终浓度为0、10、50、100、200mm的方式而设定。tergitol 15-s-40以与全血混合后的终浓度为0、0.1、0.25、1.0、2.0％的方式而设定。
[0219]
接下来，向该试验管(采血管模型)中添加采血后的全血800μl。添加全血后，将试验管倒转混和，在室温下静置30分钟，进行离心分离(3000rpm，5分钟)，回收上清，通过(材料与方法)中所述的方法，对作为细胞外囊泡(ev)的表面标记蛋白的cd9进行了测定。
[0220]
其结果，螯合剂浓度依赖性地使反应性增加(表4)。表面活性剂单独的情况下未使反应性增加，而在与螯合剂的组合中，使反应性增加(表5)。此外，通过与螯合剂的组合，表面活性剂的浓度越高，反应性越是增加(表4，5)。这表示，从添加了螯合剂以及表面活性剂的全血中制备得到的上清中存在的ev的量以依赖于螯合剂以及表面活性剂的浓度的方式而增加。
[0221]
因此，可以看出，通过将高浓度的螯合剂以及高浓度的表面活性剂添加至全血中，能够使ev的回收量增加。
[0222]
[表4]
[0223]
表4.螯合剂的浓度的探讨
[0224][0225]
[表5]
[0226]
表5.表面活性剂的浓度的探讨
[0227][0228]
实施例5：螯合剂和表面活性剂的作用的探讨
[0229]
对螯合剂和表面活性剂的作用是对全血的效果，还是对免疫反应的效果进行了确认。
[0230]
首先，将添加了螯合剂(egta)的d-pbs(-)125μl、以及添加了表面活性剂(tergitol 15-s-40)的d-pbs(-)125μl加入聚丙烯制5ml试验管(nunc制)中，制作了包含螯合剂以及表面活性剂的采血管模型。在该采血管模型的制作中，螯合剂以及表面活性剂以与全血混合后的终浓度为表6中的浓度的方式而设定。
[0231]
接下来，向该试验管(采血管模型)中，添加采血后的全血1000μl。添加全血后，将试验管倒转混和，在室温下静置30分钟，进行离心分离(3000rpm，5分钟)，回收上清，通过(材料与方法)中所述的方法，对作为细胞外囊泡(ev)的表面标记蛋白的cd9进行了测定。
[0232]
此外，在测定cd9时，对向cd9抗体固相化粒子溶液中添加了100mm egta的样品也进行了测定。
[0233]
在向cd9抗体固相化粒子溶液(粒子稀释液)中添加了100mm egta的情况下，一次反应中的egta浓度为71.4mm。在向采血管中以与全血混合后的终浓度为200mm的方式添加了egta的情况下，一次反应中的egta浓度为57.1mm。如果，egta是在免疫反应时发挥作用，则在向cd9抗体固相化粒子溶液中添加了egta的情况下，计数值也应当变高。
[0234]
首先，使用了从添加有终浓度200mm的egta的全血中制备得到的上清的条件
〔200mm egta和0％tergitоl 15-s-40，以及200mm egta和1％tergitol 15-s-40〕，与使用了从未添加同浓度的egta的全血中制备得到的上清的条件〔0mm egta和0％tergitоl 15-s-40)〕相比，表现出了显著高的计数值(参照表6中的“相对于未添加(％)”)。另一方面，在将egta添加至cd9抗体固相化粒子溶液中的情况下，与未将egta添加至cd9抗体固相化粒子溶液中的情况相比，未显示显著高的计数值(参照表6中的“相对于egta无(％)”)。这表示，螯合剂和表面活性剂的作用并非对cd9测定体系中的免疫反应起作用，而是对全血起作用。
[0235]
因此，证明了通过将螯合剂以及表面活性剂添加至全血中，能够使细胞外囊泡的回收量提高。
[0236]
[表6]
[0237]
表6.螯合剂和表面活性剂的组合的作用的探讨
[0238][0239]
表中的tergitol均为tergitol 15-s-40。
[0240]
实施例6：表面活性剂的种类的探讨
[0241]
对各种非离子性表面活性剂是否能够对全血发挥作用进行了确认。作为表面活性剂，使用了tergitol15-s-40、pluronicf68、pluronicf108、pluronicf127。
[0242]
首先，将添加有egta的d-pbs(-)125μl、以及添加有各种表面活性剂的d-pbs(-)125μl，加入聚丙烯制5ml试验管(nunc制)中，制作了包含螯合剂以及表面活性剂的采血管模型。在该采血管模型的制作中，螯合剂以及表面活性剂以与全血混合后的终浓度为表7中的浓度的方式进行了设定。
[0243]
接下来，向该试验管(采血管模型)中添加采血后的全血1000μl。添加全血后，将试验管倒转混和，在室温下静置30分钟，进行离心分离(3000rpm，5分钟)，回收上清，通过(材料与方法)中所述的方法，对作为细胞外囊泡(ev)的表面标记蛋白的cd9进行了测定。
[0244]
其结果，与表面活性剂的种类无关，从添加了螯合剂以及表面活性剂的全血中制备得到的上清与从添加了螯合剂而未添加表面活性剂的全血中制备得到的上清相比，表现出了显著高的计数值(表7)。这表示，与表面活性剂的种类无关，从添加了螯合剂以及表面活性剂的全血中制备得到的上清中存在的ev的量与从添加了螯合剂而未添加表面活性剂的全血中制备得到的上清中存在的ev的量相比显著增加。
[0245]
因此，可以看出，通过将螯合剂以及各种表面活性剂添加至全血中，能够使ev的回
收量显著地增加。
[0246]
[表7]
[0247]
表7 螯合剂和各种表面活性剂的组合的作用的探讨
[0248][0249]
工业实用性
[0250]
例如，本发明对于细胞外囊泡的临床检查是有用的。