一种监测gtfD和ftf基因水平表达上调的荧光素酶报告基因菌株、制备方法及其应用

一种监测gtfd和ftf基因水平表达上调的荧光素酶报告基因菌株、制备方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物学技术领域，尤其是涉及一种用于监测gtfd和ftf基因水平表达上调的荧光素酶报告基因菌株、制备方法及其应用。


背景技术：

2.变异链球菌是与龋病(虫牙)发生发展关系密切的菌株，变异链球菌致龋与它强大的生物膜形成能力密切相关。变异链球菌利用碳水化合物合成细胞外多糖(尤其是水不溶性细胞外多糖)是其生物膜的重要组分。变异链球菌合成细胞外多糖的主要蛋白包括a.葡糖基转移酶b(gtfb)；b.葡糖基转移酶c(gtfc)；c.葡糖基转移酶d(gtfd)；d.果糖基转移酶(ftf)。而研究证实编码上述4个蛋白的基因gtfbcd以及ftf的表达受双组份信号系统vicrk调控vicrk双组份信号系统主体由膜蛋白组氨酸激酶vick以及胞内转录调控蛋白vicr组成。其中，vick具有双重活性，可感受细胞内外环境变化自动磷酸化并把磷酸基团传递给vicr(激酶活性)，使胞内vicr～p水平上调调控下游靶基因转录的启停；另一方面vick也可以将vicr～p的磷酸基团去除(磷酸酶活性)阻止细胞内vicr～p的过度堆积。申请人前期研究通过点突变变异链球菌vick蛋白证实了vick激酶活性被阻断后，细胞内vicr～p过渡堆积(～90％)，阻碍gtfb/c基因的转录，造成gtfb/c表达大幅下降，同时启动gtfd和ftf基因的转录，大幅上调它们的表达水平。然而，目前尚未存在能够有效阻断变异链球菌vick蛋白磷酸酶活性的阻断剂，基于此，构建一种能够监测gtfd和ftf基因水平表达上调的荧光素酶报告基因菌株，以用于筛选基于阻断变异链球菌vick磷酸酶活性的小分子化合物是目前亟需解决的问题。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种用于监测gtfd和ftf基因水平表达上调的荧光素酶报告基因菌株、构建方法及其应用。
4.为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
5.本发明提供的一种用于监测gtfd和ftf基因水平表达上调的荧光素酶报告基因菌株的制备方法，包括如下步骤：
6.(1)获取gtfd和ftf基因起始密码子5’端200bp～350bpdna片段；且所获取的dna片段包含两个基因gtfd和ftf基因的启动子区域；
7.(2)设计引物用pcr法从变异链球菌野生菌株ua159基因组dna中克隆所需的靶启动子片段，将gtfd启动子区域与编码firefly luciferase的基因5’端相连，将ftf启动子区域与编码renilla luciferase的基因5’端相连后构建成1个完整的带安苄西林抗性基因的质粒；
8.(3)将构建成功且具备安苄西林抗性的质粒转染用于扩增的dh5a大肠杆菌，将50ul转染产物平铺在含100μg/ml安苄西林的lb固体培养基平板上，16小时后挑选阳性菌落
进行全质粒dna测序，筛选出包含无dna突变的工具质粒，液体培养基增菌后提纯质粒备用；
9.(4)准备相应的空载质粒对照，提纯备用；
10.(5)利用bhi液体培养基过夜培养ua159野生菌株，并于次日以1：50的比例稀释并增菌至od
600
＝0.1～0.2；
11.(6)将报告基因质粒转染ua159细菌，筛选报告菌株阳性克隆，并通过pcr扩增启动子区域测序检验；
12.(7)过夜培养报告菌株，并于次日以1：20比例稀释并增菌至od
600
＝0.4～0.6，用于荧光素酶检测；
13.(8)增菌后的报告菌株被接种在两个平行的96孔板中，定义为孔板a及孔板b，同样位置的孔中加入相同的待测小分子化合物，孔板a加入荧光素底物，孔板b加入腔肠素，分别测定两种荧光素酶的活性；
14.(9)计算相对荧光强度，并与空载对照比较。
15.根据一种优选实施方式，所述gtfd启动子区域的扩增引物对的序列如seq id no.1和seq id no.2所示，所述ftf启动子区域的扩增引物对的序列如seq id no.3和seq id no.4所示。
16.根据一种优选实施方式，其中步骤(5)和步骤(6)还包括：利用bhi液体培养基过夜培养变异链球菌野生菌株ua159，次日1：50稀释至od
600
＝0.2，取500ul菌液，加入500ng～1000ng上述工具质粒后培养1小时后在4000rpm转速下离心浓缩菌液，最后菌体被重悬在50ul培养基中，并被平铺在包含安苄西林的bhi固体培养基平板上在5％co2、37℃条件下培养48～72小时后挑取获得安苄西林抗性的变异链球菌，菌落pcr扩增两个基因启动子区域并再次测序。
17.根据一种优选实施方式，步骤(4)中的所述空载质粒是指与工具质粒相比，不包含gtfd和ftf启动子dna序列的质粒，以用于转化变异链球菌获取阴性对照菌株。
18.本发明还提供了一种用于监测gtfd和ftf基因水平表达上调的荧光素酶报告基因菌株，所述菌株是通过所述的制备方法制备而成。
19.本发明还提供了所述的荧光素酶报告基因菌株在高通量筛查用于阻断vick磷酸酶活性的潜在小分子化合物或药物中的应用。
20.本发明还提供了所述的荧光素酶报告基因菌株在制备用于治疗和预防龋病的药物中的应用。
21.基于上述技术方案，本发明的一种用于监测gtfd和ftf基因水平表达上调的荧光素酶报告基因菌株、制备方法及其应用至少具有如下技术效果：
22.本发明构建的用于监测gtfd和ftf基因水平表达上调的荧光素酶报告基因菌株能够通过检测荧光素的强弱来判断gtfd和ftf的表达情况，通过动态检测这两个基因表达可监测vick磷酸酶的活性状态，以此来筛查阻断vick磷酸酶活性的潜在小分子化合物或药物。相比较传统的rt-qpcr技术或westernblot技术来检测gtfd和ftf基因的表达或蛋白质水平，相比其流程复杂且技术敏感性高，产生的经费支出也高，并且无法实现高通量筛选来说，本发明的荧光素酶报告基因菌株检测流程简单，技术敏感性低，同时能够大大节省检测时间和试剂成本。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
24.图1是本发明的制备方法利用设计引物构建具备安苄西林抗性质粒的过程。
具体实施方式
25.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
26.实施例1
27.本发明提供了一种用于监测gtfd和ftf基因水平表达上调的荧光素酶报告基因菌株的制备方法，包括如下步骤：
28.(1)获取gtfd和ftf基因起始密码子(atg)5’端200bp～350bpdna片段；且所获取的dna片段包含两个基因gtfd和ftf基因的启动子区域。
29.(2)如图1所示，设计引物用pcr法从变异链球菌野生菌株ua159基因组dna中克隆所需的靶启动子片段，将gtfd启动子区域与编码firefly luciferase的基因5’端相连，将ftf启动子区域与编码renilla luciferase的基因5’端相连后构建成1个完整的带安苄西林抗性基因的质粒。
30.其中，gtfd启动子区域(324bp)的扩增引物对的序列如seq id no.1和seq id no.2所示。sed id no.1为：5’tctctcctgaccactccctta3’。seq id no.2为：5’tacccagtgctttttaaccttg3’。ftf启动子区域(216bp)的扩增引物对的序列如seq id no.3和seq id no.4所示。seq id no.3为5’ccacccaaaatttccctttc3’。seq id no.4为5’cttaatctaatatgtgaatttgtt3’。
31.(3)将构建成功且具备安苄西林抗性的质粒转染用于扩增的dh5a大肠杆菌，将50ul转染产物平铺在含100μg/ml安苄西林的lb固体培养基平板上，16小时后挑选4个左右阳性菌落进行全质粒dna测序，筛选出包含无dna突变的工具质粒，液体培养基增菌后提纯质粒备用。
32.(4)准备相应的空载质粒对照，提纯备用。空载质粒是指与工具质粒相比，不包含gtfd和ftf启动子dna序列的质粒，以用于转化变异链球菌获取阴性对照菌株。
33.(5)利用bhi液体培养基过夜培养变异链球菌野生菌株ua159，次日1：50稀释至od
600
＝0.2，取500ul菌液，加入500ng～1000ng上述工具质粒后培养1小时后在4000rpm转速下离心浓缩菌液，最后菌体被重悬在50ul培养基中，并被平铺在包含安苄西林的bhi固体培养基平板上在5％co2、37℃条件下培养48～72小时后挑取获得安苄西林抗性的变异链球菌，菌落pcr扩增两个基因启动子区域并再次测序。
34.(6)过夜培养报告菌株，并于次日以1：20比例稀释并增菌至od
600
＝0.4～0.6，用于荧光素酶检测。
35.(7)增菌后的报告菌株被接种在两个平行的96孔板中，定义为孔板a及孔板b，同样位置的孔中加入相同的待测小分子化合物，孔板a加入荧光素底物，孔板b加入腔肠素，分别测定两种荧光素酶的活性；
36.(8)计算相对荧光强度，并与空载对照比较。
37.当反应体系中加入的化合物可靶向阻断vick磷酸酶活性，与没有加入小分子化合物或者化合物没有阻断vick磷酸酶活性(阴性对照)相比，前者所检测的荧光强度将显著高于后两者。
38.实施例2
39.本实施例提供了一种用于监测gtfd和ftf基因水平表达上调的荧光素酶报告基因菌株，所述菌株是通过所述的制备方法制备而成。
40.实施例3
41.本实施例提供了所述的荧光素酶报告基因菌株在高通量筛查用于阻断vick磷酸酶活性的潜在小分子化合物或药物中的应用。
42.本技术人前期研究证实变异链球菌vick磷酸酶活性被阻断后gtfd及ftf表达大幅上调，因此，通过荧光素酶报告基因菌株动态检测这两个基因表达可监测vick磷酸酶活性的状态，通过工具菌株可以高通量筛查阻断vick磷酸酶活性的潜在小分子化合物或药物。
43.实施例4
44.本实施例提供了荧光素酶报告基因菌株在制备用于治疗和预防龋病的药物中的应用。
45.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。