一种生物友好型心肌敷料及其制备方法与应用

1.本发明属于生物医用材料领域，尤其涉及一种生物友好型心肌敷料及其制备方法与应用。


背景技术：

2.目前在全球范围内，急性心肌梗死仍然是威胁人类健康的主要疾病之一。据统计，目前我国城乡居民的急性心肌梗死的死亡率可达58.90～76.04/10万。近年来随着经皮冠状动脉介入(percutaneous coronary intervention，pci)等技术的不断发展、普及及下沉，越来越多的基层患者能够及时获得再血管化治疗，但患者死亡率却仍居高不下。诸多文献报道：相当一部分接受急诊pci治疗的患者仍面临着远期心力衰竭的风险，这可能是以冠脉支架手术为主的再血管化治疗虽然开通了“罪犯血管”，但是并未对患者产生的缺血再灌注损伤(ischemic reperfusion injury，iri)进行同步治疗，而继发的iri则会导致血管再通区域的心肌细胞凋亡，微循环障碍，间质异常重构等，造成患者远期的预后不良。心梗后局部心肌薄弱，顺应性极大改变，易与周围心肌发生“反常运动”，故需加固以保证对心室壁的力学支撑，同时还需改善心肌的局部顺应性。
3.心肌补片是指根据工程学原理，将具有形成心肌细胞能力的种子细胞与适宜的支架材料复合，构建出可用于移植、修复或替代自体心肌的生物材料。尽管心肌补片的理论研究已获得飞速发展，但由于心脏具有特殊的结构和功能，因此心肌补片的实际临床应用仍面临诸多挑战。
4.既往的研究中，心肌补片多采用戊二醛、甲醛等作为交联剂，虽然催化交联的效率较高，但成分本身均有较高的细胞毒性，经此处理的生物材料在体内降解的过程中，会不断局部释放上述交联剂从而影响术后安全性，甚至引发严重的局部炎症反应。以往的心肌补片原料繁杂、来源广泛，易引起局部排异反应，需要特殊的仪器或制备方法，且存在制备周期长等缺点。故目前临床迫切需要一种新型心肌材料，达到治疗目的的同时，又能克服上述不足。


技术实现要素：

5.为解决现有心肌补片原料繁杂，交联剂具有细胞毒性，容易影响术后安全性的问题，本发明提供了一种生物友好型心肌敷料及其制备方法与应用。
6.本发明的技术方案：
7.一种生物友好型心肌敷料，所述心肌敷料包括脂肪脱细胞基质水凝胶和心肌补片；所述脂肪脱细胞基质水凝胶含有如下质量份的组分：脂肪脱细胞基质20份、明胶5～15份和去离子水165～175份；所述心肌补片含有如下质量份的组分：脂肪脱细胞基质100份、明胶5～15份和多酚交联剂0.1～3份。
8.进一步的，所述脂肪脱细胞基质由人源脂肪组织或动物源脂肪组织制备得到。
9.进一步的，所述多酚交联剂为原花青素、儿茶素、表儿茶素、没食子酸或茶多酚中
的一种。
10.一种生物友好型心肌敷料的制备方法，包括如下步骤：
11.步骤一、提取脂肪脱细胞基质：
12.脂肪组织经反复冻融后依次在胰蛋白酶和异丙醇的作用下水浴，水浴后进行组织破碎，组织破碎所得物依次在胰蛋白酶和异丙醇的作用下水浴，水浴后经筛网过滤收集脂肪脱细胞基质；
13.步骤二、制备脂肪脱细胞基质水凝胶：
14.向步骤一所得脂肪脱细胞基质中加入去离子水并通过搅拌获得第一匀浆，在所述第一匀浆中加入明胶，搅拌均匀得到脂肪脱细胞基质水凝胶；
15.步骤三、多酚交联制备心肌补片：
16.将步骤一所得脂肪脱细胞基质搅拌破碎获得第二匀浆，在所述第二匀浆中加入含有明胶和多酚交联剂进行交联，完成交联后将体系置于液氮中速冻，再经冻干处理后得到心肌补片。
17.进一步的，步骤一所述反复冻融后的脂肪组织依次在胰蛋白酶和异丙醇作用下水浴为：反复冻融后的脂肪组织加入等体积胰蛋白酶处理液中，35～37℃水浴4～8h，然后置于异丙醇中35～37℃水浴24～36h；步骤一所述组织破碎所得物依次在胰蛋白酶和异丙醇的作用下水浴为：所述组织破碎所得物加入等体积胰蛋白酶处理液中，35～37℃水浴4～8h，然后置于异丙醇中35-℃水浴4～8h；所述胰蛋白酶处理液中均含有0.25％w/v的胰蛋白酶和0.1％w/v的edta。
18.进一步的，步骤二中所述脂肪脱细胞基质与去离子水的质量体积比为20g:80ml；在所述第一匀浆中加入明胶时，将明胶用去离子水配制成质量浓度为5～15％的明胶溶液，再将所述明胶溶液与第一匀浆等体积混合。
19.进一步的，步骤三中在所述第二匀浆中加入明胶和多酚交联剂时，将明胶和多酚交联剂用去离子水配制成混合溶液，其中明胶的质量浓度为5～15％w/v，多酚交联剂的质量浓度为0.1～3％w/v；再将所述混合溶液与第二匀浆等体积混合。
20.进一步的，步骤三中交联的温度为4～20℃，交联的时间为6～24h；所述置于液氮中速冻为将交联所得体系置于液氮中10～60s，所述冻干为将速冻所得体系置于-50℃冻干处理48～72h。
21.一种生物友好型心肌敷料在制备心脏外科医用材料中的应用。
22.进一步的，所述心脏外科医用材料为缝合于局部梗死心肌处修复心肌损伤的外用材料，心肌敷料中脂肪脱细胞基质水凝胶和心肌补片为单独使用或联合使用；联合使用时脂肪脱细胞基质水凝胶为内层贴敷于受损心肌处，心肌补片为外层覆盖在脂肪脱细胞基质水凝胶上。
23.本发明的有益效果：
24.本发明提供的生物友好型心肌敷料以脂肪脱细胞基质为主要原料制备了脂肪脱细胞基质水凝胶，以植物来源多酚交联剂与脂肪脱细胞基质水凝胶交联、冻干制备了心肌补片；其中脂肪脱细胞基质、植物多酚交联剂为心肌敷料的原材料，成分安全可靠，商品化程度高，最大可能的降低了免疫原性及局部炎症反应，具备良好的生物相容性。
25.植物来源的多酚交联剂中酚羟基的存在能够交联脂肪脱细胞基质中的胶原蛋白，
形成氢键从而改善了心肌补片的生物力学性能，得到的心肌补片质韧，并具有疏松多孔的三维构象。多酚具有较强的抗氧化能力，其本身可以作为治疗药物在体内降解过程中局部、缓慢释放，从而起到靶向精准的治疗作用和心血管保护作用。
26.本发明提供的生物友好型心肌敷料中，脂肪脱细胞基质水凝胶能够改善心肌局部顺应性，心肌补片能够支撑病变心肌，避免心肌变薄、扩张产生“矛盾运动”。两者可以单独使用，也可以联合使用，联合使用则能够兼顾力学支撑和改善心肌局部顺应性的作用。
附图说明
27.图1为实施例1制备的脂肪脱细胞基质水凝胶的照片；
28.图2为实施例1制备的心肌补片的照片；
29.图3为本发明心肌敷料的制备及应用示意图；
30.图4为本发明实施例1-实施例6制备的心肌补片的弹性模量比较图；
31.图5为对比例1心肌补片adecm-ga与实施例1心肌补片adecm-pc的外观照片；
32.图6为对比例1心肌补片adecm-ga与实施例1心肌补片adecm-pc分别与大鼠主动脉平滑肌细胞共培养的细胞增殖荧光染色照片；
33.图7为对比例1心肌补片adecm-ga与实施例1心肌补片adecm-pc分别与大鼠主动脉平滑肌细胞共培养的细胞增殖情况对比图。
具体实施方式
34.下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置，若未特别指明，本发明实施例中所用的原料等均可市售获得；若未具体指明，本发明实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
35.实施例1
36.本实施例提供了一种生物友好型心肌敷料，所述心肌敷料包括脂肪脱细胞基质水凝胶和心肌补片。
37.本实施例中脂肪脱细胞基质水凝胶含有如下质量份的组分：脂肪脱细胞基质20份、明胶15份和去离子水165份。
38.本实施例中心肌补片含有如下质量份的组分：脂肪脱细胞基质100份、明胶15份和原花青素交联剂3份。
39.本实施例进一步提供了生物友好型心肌敷料的制备方法。
40.本实施例使用的脂肪组织来自于冠脉搭桥手术患者的废弃纵膈脂肪组织(术前已签署知情同意书)，以下各项操作均在无菌条件下，严格遵循无菌操作原则进行。所有使用的溶液均由去离子水配制，即均含有100u/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的双抗成分。
41.脂肪脱细胞基质水凝胶和心肌补片的具体制备方法如下：
42.步骤一、提取脂肪脱细胞基质：
43.将脂肪组织于超净台中切成0.3cm厚的组织块并置于50ml离心管中，用pbs缓冲液充分冲洗去除血液杂质，加入刚没过脂肪的低渗三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，-80℃冷冻后
37℃水浴复温，并反复冻融5次；本实施例使用的低渗三羟甲基氨基甲烷缓冲液含10mmol/l三羟甲基氨基甲烷，5mmol/l edta。
44.配制含有0.25％w/v的胰蛋白酶和0.1％w/v的edta的胰蛋白酶处理液，经反复冻融的脂肪组织加入等体积的胰蛋白酶处理液中，37℃水浴6h，用无菌pbs缓冲液冲洗30min
×
3次；置于异丙醇中，37℃水浴36h，用无菌pbs缓冲液冲洗30min
×
3次；用手持电动匀浆器处理5min进行组织破碎，用无菌pbs缓冲液冲洗破碎后组织30min
×
3次；所得组织破碎物加入等体积的胰蛋白酶处理液中，37℃水浴6h，用无菌pbs缓冲液冲洗30min
×
3次；置于异丙醇中37℃水浴8h，用无菌pbs缓冲液冲洗30min
×
3次，经筛网过滤收集筛网上的脂肪脱细胞基质。
45.步骤二、制备脂肪脱细胞基质水凝胶：
46.按照去离子水与步骤一所得脂肪脱细胞基质的体积质量比为20g:80ml将步骤一所得脂肪脱细胞基质配制成溶液，在37℃水浴恒温振荡箱内，以120r/min的转速均匀搅拌12h，获得均匀乳白色的第一匀浆，将明胶用去离子水配制成质量浓度为15％的明胶溶液，再将所述明胶溶液与第一匀浆等体积混合，37℃水浴恒温振荡箱内搅拌1h，得到脂肪脱细胞基质水凝胶。水凝胶的外观照片如图1所示，室温下水凝胶呈凝胶状，4℃时呈胶冻状，具有一定的粘弹性，于水中溶胀但不溶解，尺寸大小可根据梗死心肌具体面积进行剪裁。
47.步骤三、制备心肌补片：
48.将步骤一所得脂肪脱细胞基质通过电动匀浆器搅碎后在37℃水浴恒温振荡箱内以120r/min的转速均匀搅拌1h，获得均匀乳白色的第二匀浆，将明胶和原花青素交联剂用去离子水配制成混合溶液，其中明胶的质量浓度为15％w/v，原花青素交联剂的质量浓度为3％w/v，再将所述混合溶液与第二匀浆等体积混合，4℃交联12h后，加入液氮中速冻，再置于预冷的真空冻干机中-50℃冻干处理48h，得到心肌补片adecm-pc。将获得的心肌补片用去离子水冲洗30min
×
3次，-50℃冻干机中冻干24h，环氧乙烷低温消毒后密封4℃条件下备用。
49.心肌补片的外观如图2所示，呈固态，具有疏松多孔的三维构象和足够的力学性能，厚度为2～3mm，尺寸大小可根据梗死心肌实际需要剪裁。
50.本实施例中脂肪脱细胞基质由人源脂肪组织制备得到，无免疫原性且具有优良的生物相容性。植物多酚交联剂成分安全可靠，商品化程度高，最大可能的降低了局部炎症反应，多酚具有较强的抗氧化能力，在体内降解过程中局部、缓慢释放，能够起到靶向精准的治疗作用和心血管保护作用。
51.本实施例中脂肪脱细胞基质水凝胶与心肌补片可单独使用，也可以联合使用，在急性心肌梗死经药物溶栓或支架介入开通“犯罪血管”后经胸腔镜缝合于局部梗死心肌处；或于冠状动脉旁路移植术同期缝合于梗死心肌局部。联合使用时脂肪脱细胞基质水凝胶为内层贴敷于受损心肌处，心肌补片为外层覆盖在脂肪脱细胞基质水凝胶上。
52.实施例2
53.本实施例提供了一种生物友好型心肌敷料，所述心肌敷料包括脂肪脱细胞基质水凝胶和心肌补片。
54.本实施例中脂肪脱细胞基质水凝胶含有如下质量份的组分：脂肪脱细胞基质20份、明胶5份和去离子水175份。
55.本实施例中心肌补片含有如下质量份的组分：脂肪脱细胞基质100份、明胶5份和原花青素交联剂0.1份。
56.本实施例进一步提供了生物友好型心肌敷料的制备方法。
57.本实施例使用的脂肪组织来自于冠脉搭桥手术患者的废弃纵膈脂肪组织(术前已签署知情同意书)，以下各项操作均在无菌条件下，严格遵循无菌操作原则进行。所有使用的溶液均由去离子水配制，即均含有100u/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的双抗成分。
58.脂肪脱细胞基质水凝胶和心肌补片的具体制备方法如下：
59.步骤一、提取脂肪脱细胞基质：
60.将脂肪组织于超净台中切成0.3cm厚的组织块并置于50ml离心管中，用pbs缓冲液充分冲洗去除血液杂质，加入刚没过脂肪的低渗三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，-80℃冷冻后37℃水浴复温，并反复冻融5次；本实施例使用的低渗三羟甲基氨基甲烷缓冲液含10mmol/l三羟甲基氨基甲烷，5mmol/l edta。
61.配制含有0.25％w/v的胰蛋白酶和0.1％w/v的edta的胰蛋白酶处理液，经反复冻融的脂肪组织加入等体积的胰蛋白酶处理液中，37℃水浴6h，用无菌pbs缓冲液冲洗30min
×
3次；置于异丙醇中，37℃水浴36h，用无菌pbs缓冲液冲洗30min
×
3次；用手持电动匀浆器处理5min进行组织破碎，用无菌pbs缓冲液冲洗破碎后组织30min
×
3次；所得组织破碎物加入等体积的胰蛋白酶处理液中，37℃水浴6h，用无菌pbs缓冲液冲洗30min
×
3次；置于异丙醇中37℃水浴8h，用无菌pbs缓冲液冲洗30min
×
3次，经筛网过滤收集筛网上的脂肪脱细胞基质。
62.步骤二、制备脂肪脱细胞基质水凝胶：
63.按照去离子水与步骤一所得脂肪脱细胞基质的体积质量比为20g:80ml将步骤一所得脂肪脱细胞基质配制成溶液，在37℃水浴恒温振荡箱内，以110r/min的转速均匀搅拌12h，获得均匀乳白色的第一匀浆，将明胶用去离子水配制成质量浓度为5％的明胶溶液，再将所述明胶溶液与第一匀浆等体积混合，37℃水浴恒温振荡箱内搅拌1h，得到脂肪脱细胞基质水凝胶。
64.步骤三、制备心肌补片：
65.将步骤一所得脂肪脱细胞基质通过电动匀浆器搅碎后在37℃水浴恒温振荡箱内以120r/min的转速均匀搅拌1h，获得均匀乳白色的第二匀浆，将明胶和原花青素交联剂用去离子水配制成混合溶液，其中明胶的质量浓度为5％w/v，原花青素交联剂的质量浓度为0.1％w/v，再将所述混合溶液与第二匀浆等体积混合，4℃交联12h后，加入液氮中速冻，再置于预冷的真空冻干机中-50℃冻干处理48h，得到心肌补片。将获得的心肌补片用去离子水冲洗30min
×
3次，-50℃冻干机中冻干24h，环氧乙烷低温消毒后密封4℃条件下备用。
66.实施例3
67.本实施例提供了一种生物友好型心肌敷料，所述心肌敷料包括脂肪脱细胞基质水凝胶和心肌补片。
68.本实施例中脂肪脱细胞基质水凝胶含有如下质量份的组分：脂肪脱细胞基质20份、明胶15份和去离子水165份。
69.本实施例中心肌补片含有如下质量份的组分：脂肪脱细胞基质100份、明胶15份和儿茶素交联剂1份。
70.本实施例进一步提供了生物友好型心肌敷料的制备方法。
71.本实施例使用的脂肪组织来自于猪纵膈脂肪组织，以下各项操作均在无菌条件下，严格遵循无菌操作原则进行。所有使用的溶液均由去离子水配制，即均含有100u/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的双抗成分。
72.脂肪脱细胞基质水凝胶和心肌补片的具体制备方法如下：
73.步骤一、提取脂肪脱细胞基质：
74.将脂肪组织于超净台中切成0.3cm厚的组织块并置于50ml离心管中，用pbs缓冲液充分冲洗去除血液杂质，加入刚没过脂肪的低渗三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，-80℃冷冻后37℃水浴复温，并反复冻融5次；本实施例使用的低渗三羟甲基氨基甲烷缓冲液含10mmol/l三羟甲基氨基甲烷，5mmol/l edta。
75.配制含有0.25％w/v的胰蛋白酶和0.1％w/v的edta的胰蛋白酶处理液，经反复冻融的脂肪组织加入等体积的胰蛋白酶处理液中，37℃水浴6h，用无菌pbs缓冲液冲洗30min
×
3次；置于异丙醇中，37℃水浴36h，用无菌pbs缓冲液冲洗30min
×
3次；用手持电动匀浆器处理5min进行组织破碎，用无菌pbs缓冲液冲洗破碎后组织30min
×
3次；所得组织破碎物加入等体积的胰蛋白酶处理液中，37℃水浴6h，用无菌pbs缓冲液冲洗30min
×
3次；置于异丙醇中37℃水浴8h，用无菌pbs缓冲液冲洗30min
×
3次，经筛网过滤收集筛网上的脂肪脱细胞基质。
76.步骤二、制备脂肪脱细胞基质水凝胶：
77.按照去离子水与步骤一所得脂肪脱细胞基质的体积质量比为20g:80ml将步骤一所得脂肪脱细胞基质配制成溶液，在37℃水浴恒温振荡箱内，以100r/min的转速均匀搅拌12h，获得均匀乳白色的第一匀浆，将明胶用去离子水配制成质量浓度为15％的明胶溶液，再将所述明胶溶液与第一匀浆等体积混合，37℃水浴恒温振荡箱内搅拌1h，得到脂肪脱细胞基质水凝胶。
78.步骤三、制备心肌补片：
79.将步骤一所得脂肪脱细胞基质通过电动匀浆器搅碎后在37℃水浴恒温振荡箱内以120r/min的转速均匀搅拌1h，获得均匀乳白色的第二匀浆，将明胶和儿茶素交联剂用去离子水配制成混合溶液，其中明胶的质量浓度为15％w/v，儿茶素交联剂的质量浓度为1％w/v，再将所述混合溶液与第二匀浆等体积混合，4℃交联12h后，加入液氮中速冻，再置于预冷的真空冻干机中-50℃冻干处理48h，得到心肌补片。将获得的心肌补片用去离子水冲洗30min
×
3次，-50℃冻干机中冻干24h，环氧乙烷低温消毒后密封4℃条件下备用。
80.实施例4
81.本实施例提供了一种生物友好型心肌敷料，所述心肌敷料包括脂肪脱细胞基质水凝胶和心肌补片。
82.本实施例中脂肪脱细胞基质水凝胶含有如下质量份的组分：脂肪脱细胞基质20份、明胶8份和去离子水172份。
83.本实施例中心肌补片含有如下质量份的组分：脂肪脱细胞基质100份、明胶8份和表儿茶素交联剂2份。
84.本实施例进一步提供了生物友好型心肌敷料的制备方法。
85.本实施例使用的脂肪组织来自于猪纵膈脂肪组织，以下各项操作均在无菌条件
下，严格遵循无菌操作原则进行。所有使用的溶液均由去离子水配制，即均含有100u/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的双抗成分。
86.脂肪脱细胞基质水凝胶和心肌补片的具体制备方法如下：
87.步骤一、提取脂肪脱细胞基质：
88.将脂肪组织于超净台中切成0.3cm厚的组织块并置于50ml离心管中，用pbs缓冲液充分冲洗去除血液杂质，加入刚没过脂肪的低渗三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，-80℃冷冻后37℃水浴复温，并反复冻融5次；本实施例使用的低渗三羟甲基氨基甲烷缓冲液含10mmol/l三羟甲基氨基甲烷，5mmol/l edta。
89.配制含有0.25％w/v的胰蛋白酶和0.1％w/v的edta的胰蛋白酶处理液，经反复冻融的脂肪组织加入等体积的胰蛋白酶处理液中，37℃水浴6h，用无菌pbs缓冲液冲洗30min
×
3次；置于异丙醇中，37℃水浴36h，用无菌pbs缓冲液冲洗30min
×
3次；用手持电动匀浆器处理5min进行组织破碎，用无菌pbs缓冲液冲洗破碎后组织30min
×
3次；所得组织破碎物加入等体积的胰蛋白酶处理液中，37℃水浴6h，用无菌pbs缓冲液冲洗30min
×
3次；置于异丙醇中37℃水浴8h，用无菌pbs缓冲液冲洗30min
×
3次，经筛网过滤收集筛网上的脂肪脱细胞基质。
90.步骤二、制备脂肪脱细胞基质水凝胶：
91.按照去离子水与步骤一所得脂肪脱细胞基质的体积质量比为20g:80ml将步骤一所得脂肪脱细胞基质配制成溶液，在37℃水浴恒温振荡箱内，以120r/min的转速均匀搅拌12h，获得均匀乳白色的第一匀浆，将明胶用去离子水配制成质量浓度为8％的明胶溶液，再将所述明胶溶液与第一匀浆等体积混合，37℃水浴恒温振荡箱内搅拌1h，得到脂肪脱细胞基质水凝胶。
92.步骤三、制备心肌补片：
93.将步骤一所得脂肪脱细胞基质通过电动匀浆器搅碎后在37℃水浴恒温振荡箱内以120r/min的转速均匀搅拌1h，获得均匀乳白色的第二匀浆，将明胶和表儿茶素交联剂用去离子水配制成混合溶液，其中明胶的质量浓度为8％w/v，表儿茶素交联剂的质量浓度为2％w/v，再将所述混合溶液与第二匀浆等体积混合，4℃交联12h后，加入液氮中速冻，再置于预冷的真空冻干机中-50℃冻干处理48h，得到心肌补片。将获得的心肌补片用去离子水冲洗30min
×
3次，-50℃冻干机中冻干24h，环氧乙烷低温消毒后密封4℃条件下备用。
94.实施例5
95.本实施例提供了一种生物友好型心肌敷料，所述心肌敷料包括脂肪脱细胞基质水凝胶和心肌补片。
96.本实施例中脂肪脱细胞基质水凝胶含有如下质量份的组分：脂肪脱细胞基质20份、明胶12份和去离子水168份。
97.本实施例中心肌补片含有如下质量份的组分：脂肪脱细胞基质100份、明胶12份和没食子酸交联剂2.5份。
98.本实施例进一步提供了生物友好型心肌敷料的制备方法。
99.本实施例使用的脂肪组织来自于兔纵膈脂肪组织，以下各项操作均在无菌条件下，严格遵循无菌操作原则进行。所有使用的溶液均由去离子水配制，即均含有100u/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的双抗成分。
100.脂肪脱细胞基质水凝胶和心肌补片的具体制备方法如下：
101.步骤一、提取脂肪脱细胞基质：
102.将脂肪组织于超净台中切成0.3cm厚的组织块并置于50ml离心管中，用pbs缓冲液充分冲洗去除血液杂质，加入刚没过脂肪的低渗三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，-80℃冷冻后37℃水浴复温，并反复冻融5次；本实施例使用的低渗三羟甲基氨基甲烷缓冲液含10mmol/l三羟甲基氨基甲烷，5mmol/l edta。
103.配制含有0.25％w/v的胰蛋白酶和0.1％w/v的edta的胰蛋白酶处理液，经反复冻融的脂肪组织加入等体积的胰蛋白酶处理液中，37℃水浴6h，用无菌pbs缓冲液冲洗30min
×
3次；置于异丙醇中，37℃水浴36h，用无菌pbs缓冲液冲洗30min
×
3次；用手持电动匀浆器处理5min进行组织破碎，用无菌pbs缓冲液冲洗破碎后组织30min
×
3次；所得组织破碎物加入等体积的胰蛋白酶处理液中，37℃水浴6h，用无菌pbs缓冲液冲洗30min
×
3次；置于异丙醇中37℃水浴8h，用无菌pbs缓冲液冲洗30min
×
3次，经筛网过滤收集筛网上的脂肪脱细胞基质。
104.步骤二、制备脂肪脱细胞基质水凝胶：
105.按照去离子水与步骤一所得脂肪脱细胞基质的体积质量比为20g:80ml将步骤一所得脂肪脱细胞基质配制成溶液，在37℃水浴恒温振荡箱内，以120r/min的转速均匀搅拌12h，获得均匀乳白色的第一匀浆，将明胶用去离子水配制成质量浓度为12％的明胶溶液，再将所述明胶溶液与第一匀浆等体积混合，37℃水浴恒温振荡箱内搅拌1h，得到脂肪脱细胞基质水凝胶。
106.步骤三、制备心肌补片：
107.将步骤一所得脂肪脱细胞基质通过电动匀浆器搅碎后在37℃水浴恒温振荡箱内以120r/min的转速均匀搅拌1h，获得均匀乳白色的第二匀浆，将明胶和没食子酸交联剂用去离子水配制成混合溶液，其中明胶的质量浓度为12％w/v，没食子酸交联剂的质量浓度为2.5％w/v，再将所述混合溶液与第二匀浆等体积混合，4℃交联12h后，加入液氮中速冻，再置于预冷的真空冻干机中-50℃冻干处理48h，得到心肌补片。将获得的心肌补片用去离子水冲洗30min
×
3次，-50℃冻干机中冻干24h，环氧乙烷低温消毒后密封4℃条件下备用。
108.实施例6
109.本实施例提供了一种生物友好型心肌敷料，所述心肌敷料包括脂肪脱细胞基质水凝胶和心肌补片。
110.本实施例中脂肪脱细胞基质水凝胶含有如下质量份的组分：脂肪脱细胞基质20份、明胶10份和去离子水170份。
111.本实施例中心肌补片含有如下质量份的组分：脂肪脱细胞基质100份、明胶10份和茶多酚交联剂3份。
112.本实施例进一步提供了生物友好型心肌敷料的制备方法。
113.本实施例使用的脂肪组织来自于兔纵膈脂肪组织，以下各项操作均在无菌条件下，严格遵循无菌操作原则进行。所有使用的溶液均由去离子水配制，即均含有100u/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的双抗成分。
114.脂肪脱细胞基质水凝胶和心肌补片的具体制备方法如下：
115.将脂肪组织于超净台中切成0.3cm厚的组织块并置于50ml离心管中，用pbs缓冲液
充分冲洗去除血液杂质，加入刚没过脂肪的低渗三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，-80℃冷冻后37℃水浴复温，并反复冻融5次；本实施例使用的低渗三羟甲基氨基甲烷缓冲液含10mmol/l三羟甲基氨基甲烷，5mmol/l edta。
116.配制含有0.25％w/v的胰蛋白酶和0.1％w/v的edta的胰蛋白酶处理液，经反复冻融的脂肪组织加入等体积的胰蛋白酶处理液中，37℃水浴6h，用无菌pbs缓冲液冲洗30min
×
3次；置于异丙醇中，37℃水浴36h，用无菌pbs缓冲液冲洗30min
×
3次；用手持电动匀浆器处理5min进行组织破碎，用无菌pbs缓冲液冲洗破碎后组织30min
×
3次；所得组织破碎物加入等体积的胰蛋白酶处理液中，37℃水浴6h，用无菌pbs缓冲液冲洗30min
×
3次；置于异丙醇中37℃水浴8h，用无菌pbs缓冲液冲洗30min
×
3次，经筛网过滤收集筛网上的脂肪脱细胞基质。
117.步骤二、制备脂肪脱细胞基质水凝胶：
118.按照去离子水与步骤一所得脂肪脱细胞基质的体积质量比为20g:80ml将步骤一所得脂肪脱细胞基质配制成溶液，在37℃水浴恒温振荡箱，以100r/min的转速均匀搅拌12h，获得均匀乳白色的第一匀浆，将明胶用去离子水配制成质量浓度为10％的明胶溶液，再将所述明胶溶液与第一匀浆等体积混合，37℃水浴恒温振荡箱内搅拌1h，得到脂肪脱细胞基质水凝胶。
119.步骤三、制备心肌补片：
120.将步骤一所得脂肪脱细胞基质通过电动匀浆器搅碎后在37℃水浴恒温振荡箱内以120r/min的转速均匀搅拌1h，获得均匀乳白色的第二匀浆，将明胶和茶多酚交联剂用去离子水配制成混合溶液，其中明胶的质量浓度为10％w/v，茶多酚交联剂的质量浓度为3％w/v，再将所述混合溶液与第二匀浆等体积混合，4℃交联12h后，加入液氮中速冻，再置于预冷的真空冻干机中-50℃冻干处理48h，得到心肌补片。将获得的心肌补片用去离子水冲洗30min
×
3次，-50℃冻干机中冻干24h，环氧乙烷低温消毒后密封4℃条件下备用。
121.检测实施例1-实施例6制备的心肌补片的弹性模量，结果如图4和表1所示，表1
[0122][0123]
由表1数据可知，本发明提供的心肌补片具有较好的力学性能，能够为受损心肌提供足够的力学支撑。
[0124]
对比例1
[0125]
本对比例提供了一种以戊二醛为交联剂制备的心肌补片adecm-ga，本对比例心肌
补片的制备方法与实施例1相同，区别仅在于将实施例1中的原花青素交联剂替换为戊二醛，戊二醛的用量为0.25份。本对比例在制备心肌补片时，将明胶和戊二醛用去离子水配制成混合溶液，其中明胶的质量浓度为15％w/v，戊二醛的质量浓度为0.25％w/v。
[0126]
为考察不同交联剂制备的心肌补片的生物友好性，将心肌补片adecm-ga与实施例1心肌补片adecm-pc分别与大鼠主动脉平滑肌细胞(smc)共培养3d、7d，利用4，6-联脒-2-苯基吲哚(dapi)进行荧光染色，得到如图6所示荧光染色照片和图7所示细胞增殖情况对比图，由图6、图7的对比可以看出，以原花青素为交联剂制备的心肌补片组adecm-pc获得了更多的细胞增殖，具有更好的生物友好性。