一种基于姜黄素的分子印迹聚合物的制备方法、电化学传感器及其应用与流程

1.本发明涉及检测方法技术领域，尤其涉及一种基于姜黄素的分子印迹聚合物的制备方法、电化学传感器及其应用。


背景技术：

2.姜黄素是从姜科、天南星科中的一些植物的根茎中提取的一种化学成分，其中，姜黄约含3％～6％，是植物界很稀少的具有二酮的色素，为二酮类化合物。姜黄素的抗氧化或促氧化活性取决于其浓度，因此控制进入人体的食品中的姜黄素浓度至关重要，所以开发一种准确而简单的检测方法来检测姜黄素是非常必要的。
3.从环境中、食品中、生物样品以及天然产物中检测或者收集微量物质一直是目前各领域的研究关注点和困难点。各领域的科研人员都在想方设法的想要开发一种新的分析方法，这种方法必须具备简单、快速、高效且准确这些优点。但是，就目前而言，分析的目标物一般都比较复杂而且含有许多未知成分，这些都是能够造成分析误差和干扰的原因。如果仅仅只是依靠较高灵敏度的仪器分析方法而不考虑实际分析检测中所遇到各种问题，这样也是难以起到相应的作用的。对复杂样品进行预处理从而排除一定的干扰项是目前痕量分析中必不可少的一个步骤。然而，即便是样品的预处理方法也是多种多样的，这样就造成了后续分析结果的准确度和精密度，从而最终影响整个实验方法的普遍适用性。


技术实现要素：

4.本发明解决的技术问题在于提供一种电化学传感器，其能够实现姜黄素快速、高效且准确的检测。
5.有鉴于此，本技术提供了一种基于姜黄素的分子印迹聚合物的制备方法，包括以下步骤：
6.将姜黄素与有机溶剂、水混合，得到混合溶液；
7.将磁性fe3o4纳米颗粒、玉米醇溶蛋白与所述混合溶液混合，自聚合后得到初始聚合物；
8.将所述初始聚合物清洗以去除姜黄素，得到基于姜黄素的分子印迹聚合物。
9.优选的，所述姜黄素、所述磁性fe3o4纳米颗粒和所述玉米醇溶蛋白的质量比为(0.8～1.5):1:(3～8)。
10.优选的，所述有机溶剂选自乙醇，所述有机溶剂与所述水的体积比为(2～4):1；所述清洗的试剂为体积比为9:1的甲醇和乙酸混合液。
11.优选的，所述自聚合的时间为8～12h。
12.本技术还提供了一种基于分子印迹聚合物的电化学传感器，包括相连接的电极和电化学工作站，所述电极由电极材料和涂敷于所述电极材料表面的基于姜黄素的分子印迹聚合物层组成；所述基于姜黄素的分子印迹聚合物层由所述的制备方法所制备的基于姜黄
素的分子印迹聚合物制备得到。
13.优选的，所述电极材料为经过抛光处理的玻璃碳电极。
14.本技术还提供了一种基于分子印迹聚合物的电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：
15.将基于姜黄素的分子印迹聚合物分散在有机溶剂中，得到分散液；
16.将所述分散液滴加至电极材料表面，干燥后，得到电极；
17.将所述电极与电化学工作站连接，得到基于分子印迹聚合物的电化学传感器；
18.所述基于姜黄素的分子印迹聚合物由所述的制备方法所制备的基于姜黄素的分子印迹聚合物。
19.优选的，所述分散液中所述分子印迹聚合物的浓度为0.2～2.0mg/ml。
20.本技术还提供了一种检测姜黄素的方法，包括：
21.将含有姜黄素的样品溶解后采用电化学传感器检测，所述电化学传感器为所述的电化学传感器或所述的制备方法所制备的电化学传感器。
22.本技术提供了一种基于分子印迹聚合物的电化学传感器，其中的电极由电极材料和涂敷于电极材料表面的基于姜黄素的分子印迹聚合物层组成；本技术中的基于姜黄素的分子印迹聚合物以玉米醇溶蛋白作为功能单体和交联剂，在温和条件下其与姜黄素模板反应形成微球聚合物，姜黄素模板去除后即形成具有大量空腔的分子印迹聚合物，由此可实现姜黄素的特异性吸附，使姜黄素样品分子通过聚合物孔扩散到电极表面并进行氧化还原反应；同时，由于mbmips对姜黄素有富集作用，提高了电极的灵敏度，增强了电极的抗干扰能力；进一步的，玉米醇溶蛋白包覆于fe3o4纳米颗粒表面，可实现检测样品的快速分离。
附图说明
23.图1为本发明mbmips的合成示意图；
24.图2为本发明制备的mbmips、mbnips和fe3o4的sem照片和tem照片；
25.图3为本发明实施例中的fe3o4、mbmips、mbnips和zein的ft-ir光谱、合成的分子印迹聚合物纳米颗粒的热分析图以及fe3o4和mbmip的xrd图谱；
26.图4为本发明实施例中的mbmips的磁性研究示意图；
27.图5为本发明实施例中的mbmips和mbnips的特征吸附等温线和吸附动力学曲线；
28.图6为标准溶液中不同工作电极的循环伏安图、不同浓度姜黄素下mbmip-gce电极的循环伏安图以及电流下姜黄素在mbmip-gce电极上的氧化还原机制。
具体实施方式
29.为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
30.本技术通过玉米醇溶蛋白的自聚合，制备出一种易于提取和分离姜黄素的生物相容性材料，其可在高温、低温、高压、大量有机溶剂等任何环境和原料中有效提取姜黄素；将玉米醇溶蛋白与姜黄素模板相结合，成功地构建了一种用于复杂样品中姜黄素高灵敏度和选择性测定的新型分子印迹聚合物(mbmip)。玉米醇溶蛋白作为功能单体和交联剂，在温和
条件下与模板反应形成微球聚合物；玉米醇溶蛋白可以通过改变溶剂的极性进行自聚合，由此引入具有磁性的fe3o4纳米颗粒，得到具有特异性吸附和磁性的分子印迹聚合物。具体的，本发明实施例公开了一种基于姜黄素的分子印迹聚合物的制备方法，包括以下步骤：
31.将姜黄素与有机溶剂、水混合，得到混合溶液；
32.将磁性fe3o4纳米颗粒、玉米醇溶蛋白与所述混合溶液混合，自聚合后得到初始聚合物；
33.将所述初始聚合物清洗以去除姜黄素，得到基于姜黄素的分子印迹聚合物。
34.本技术首先提供了一种基于姜黄素的分子印迹聚合物的制备方法，其中模板分子为姜黄素，其与有机溶剂、水混合，得到混合溶液；在本技术中，所述有机溶剂选自本领域技术人员熟知的有机溶剂即可，在具体实施例中，所述有机溶剂选自乙醇；所述有机溶剂与水的体积比为(2～4):1。
35.本技术然后将磁性fe3o4纳米颗粒、玉米醇溶蛋白与所述混合溶液混合，自聚合后，得到初始聚合物；在本技术中，所述玉米醇溶蛋白作为功能单体和交联剂，其通过自聚合与模板分子存在氢键关系包覆于磁性fe3o4纳米颗粒表面。所述姜黄素、所述磁性fe3o4纳米颗粒和所述玉米醇溶蛋白的质量比为(0.8～1.5):1:(3～8)；在具体实施例中，所述磁性fe3o4纳米颗粒和所述玉米醇溶蛋白的质量比为0.92:1:5。所述自聚合的时间为10h。
36.本技术最后将所述初始聚合物清洗，以去除聚合物壳体中的模板分子，得到具有大量空腔结构的分子印迹聚合物(mbmips)。在清洗的过程中，本技术首先采用75％乙醇/水溶液清洗，以去除未反应的原料，再采用体积比9:1的甲醇和乙酸洗去模板分子。
37.为了便捷、快速的检测出样品中的姜黄素，在上述分子印迹聚合物的基础上，本技术还提供了一种基于分子印迹聚合物的电化学传感器，包括相连接的电极和电化学工作站，所述电极由电极材料和涂敷于所述电极材料表面的基于姜黄素的分子印迹聚合物层组成；所述基于姜黄素的分子印迹聚合物层由上述基于姜黄素的分子印迹聚合物制备得到。
38.在本技术中，所述电极材料选自本领域技术人员熟知的材料，示例的，具体选自玻璃碳电极，其需要优先进行抛光处理。本技术所述电化学工作站为本领域技术人员熟知的便携式电化学工作站，对此本技术没有特别的限制；示例的，所述电化学工作站为以mbmip-gce为工作电极，sce为参比电极，铂电极为对电极的传统三电极体系。
39.本技术还提供了一种基于分子印迹聚合物的电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：
40.将基于姜黄素的分子印迹聚合物分散在有机溶剂中，得到分散液；
41.将所述分散液滴加至电极材料表面，干燥后，得到电极；
42.将所述电极与电化学工作站连接，得到基于分子印迹聚合物的电化学传感器；
43.所述基于姜黄素的分子印迹聚合物层由上述基于姜黄素的分子印迹聚合物。
44.在上述过程中，所述有机溶剂选自本领域技术人员熟知的有机溶剂，示例的，所述有机溶剂选自乙醇；所述分散液中所述分子印迹聚合物的浓度为0.2～2.0mg/ml；更具体的，所述分散液中所述分子印迹聚合物的浓度为1.0mg/ml。
45.本技术还提供了一种检测姜黄素的方法，包括：
46.将含有姜黄素的样品溶解后采用电化学传感器检测，所述电化学传感器为上述方案所述的电化学传感器。
47.在检测姜黄素的过程中，本技术首先将含有姜黄素的样品溶解，以将其中的姜黄素溶解而进行后续的检测。
48.本技术的检测方法可以得出：mbmips修饰的gce电极比未修饰的gce电极具有更好的电化学响应。在优化的实验条件下，改性电极表现出线性浓度范围5～200μg/ml。此外，该mbmips传感器已成功应用于薯片中姜黄素的检测；合成的材料具有吸附动力学快(20min)、吸附量(32.12mg/g)好、抗干扰能力强的特点；在薯片中的成功检测出姜黄素，可以为食品色素的检测方法提供新的方向。
49.为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的基于姜黄素的分子印迹聚合物的制备方法、电化学传感器及其应用进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
50.实施例1
51.1材料与仪器
52.姜黄素(98％)购自中国医药生物制品研究所，六水氯化铁(fecl3·
6h2o)、无水乙酸钠(naac)、乙二醇(ch2oh)2、柠檬酸钠(na3c6h5o7·
2h2o)、盐酸(hcl)、甲醇(meoh)、无水乙醇(etoh)、乙酸(acoh)均购自成都科龙化学试剂厂(成都)，乙腈(acn)和甲醇为德国默克公司(merck)生产的高效液相色谱(hplc)级产品，实验中使用的超纯水是由millipore,milford,ma,usa公司的millipore-q系统制备的。其他试剂均为分析级。
53.扫描电子显微镜(sem)和透射电子显微镜(tem)图像采用的是merlin compact(zeiss，germany)和jem 2100f(jeol，japan)。红外光谱采用近红外光谱仪(岛津，日本)近红外亲和傅里叶变换获得；热重分析采用tga/dsl1/1600lf(mettler toledo，瑞士)；安捷伦zorbax eclipse c18柱(2.1
×
100毫米,1.8μm)是用于色谱分离；循环伏安法(cv)采用igs1230cn系列便携式电化学工作站(ingsens仪器，广州)，以mbmip-gce为工作电极，sce(chenhua instruments,shanghai,china)为参比电极，铂电极(chenhua instruments,shanghai,china)为对电极的传统三电极体系。
54.2 mbmips的制备
55.mbmips的合成步骤如图1所示；首先，利用溶剂热法合成磁性fe3o4纳米颗粒：一般情况下，将2.7g的fecl3·
6h2o溶解在80ml乙二醇中，在室温下采用磁力搅拌，直到形成透明溶液为止；然后加入6.2g无水乙酸钠和0.8g柠檬酸钠，在150℃下搅拌约30分钟使溶液混合均匀；接着将混合均匀的黑色溶液转移到特氟龙内衬的不锈钢高压釜中，将高压釜置于200℃的烘箱中8小时；最后，将得到的黑色材料依次用无水乙醇和蒸馏水洗涤3次左右，将磁性不好或者没合成成功的材料洗干净，然后在50℃真空下干燥8小时以备后面使用。
56.将46mg模板分子姜黄素溶于37.5ml乙醇中，加入12.5ml超纯水，制成乙醇/水75％(v/v)的混合溶液；然后将合成的磁性fe3o4纳米粒子50mg和玉米醇溶蛋白250mg在超声下分散到混合溶液中，将混合溶液在室温下振荡2小时，加入50ml超纯水室温在摇床上自聚合约10小时；反应结束后，用磁铁收集产物，用75％乙醇/水(v/v)溶液清洗三次，将未能合成分子印记的其它材料洗去；然后用甲醇和乙酸溶液(v/v 9:1)多次重复洗去聚合物壳体中的模板分子，直到hplc检测到溶液中没有姜黄素，然后在45℃真空中干燥备用，得到基于姜黄素的分子印迹聚合物(mbmips)。
57.作为对照，在没有姜黄素作为模板的情况下，以相同的方法制备相应的mbnips。
58.3 mbmip-nps和mbnip-nps改性传感器的制备
59.用0.3μm的氧化铝将玻璃碳电极(gce d＝4mm)表面进行抛光，然后分别在乙醇和超纯水中超声清洗，在空气中干燥，将制备的磁性纳米颗粒在超声波下均匀分散在无水乙醇中；将30.0μl分散溶液(1mg/ml)的mbmips或mbnips滴加到gce表面上(每次10μl，3次)，并在室温下干燥；然后，在混合磷酸盐缓冲液中对mbmip-nps或mbnip-nps进行扫描速率为50mv/s的cv实验，直至获得稳定的伏安图。
60.4缓冲液和标准溶液的制备
61.采用超声将混合磷酸盐固体试剂(kh2po43.388g na2hpo43.533g)完全溶解于蒸馏水中；然后把溶液被转移到一个带塞子的锥形瓶中；采用1m hcl溶液对ph值进行调节，得到ph值为6.86的磷酸盐缓冲液；
62.准确称量姜黄素标准品(0.07368g)，超声使其完全溶解于无水乙醇中；然后，将溶液转移到一个250ml的棕色锥形瓶中；最后得到1.0mm姜黄素标准溶液，低温避光保存在冰箱中；需要时，溶液可以用磷酸盐缓冲溶液稀释到所需浓度；
63.缓冲液的选择：选择不同类型的缓冲溶液进行测试，如k3[fe(cn)6]-kcl，h3po
4-kh2po4，nh
3-nh4cl，hac-naac
,
pbs，hcl，na2b4o7以及khc4h4o6；结果表明，姜黄素在k3[fe(cn)6]-kcl溶液和na2b4o7溶液中均有信号；但峰值电流相对较小，稳定性较差；相反，姜黄素在pbs溶液中具有较好的峰形，峰值电流足够大且稳定。因此，选择pbs作为缓冲溶液。
[0064]
5电化学测试
[0065]
将配置好的溶液转移到一个小烧杯中，插入三电极系统；首先，采用未经修饰的裸gce电极进行检测，静止时间设置为2s，扫描范围为-2～0.5v，扫描速度为50mv/s；记录峰值电流和峰值电位；用事先准备好的修饰电极代替工作电极，并测量已知浓度的样品溶液。
[0066]
6样品预处理
[0067]
将薯片磨碎，在50℃下烘干，将干薯片渣(1g)称重，放入烧杯中；将95％乙醇(20ml)加入烧杯中，超声提取30min，过滤，收集滤液；滤液混合后转移到100ml容量瓶中，4℃下避光保存备用。
[0068]
实施例2验证与分析
[0069]
1 mbmips、mbnips和fe3o4nps的sem和tem图谱
[0070]
用sem对mbmips(图2a)、mbnips(图2b)和fe3o4nps(图2c)的形态特征进行了表征，如图2所示，由图2可知，fe3o4nps为球形，高度单分散，直径为300nm；利用透射电镜对mbmips(图2d)、mbnips(图2e)和fe3o4nps(图2f)的形态特征进行了表征；扫描电镜(sem)和透射电镜(tem)图像表明，mbmips为球形结构，直径为300～380nm，相比之下，较fe3o4nps的粒径显著增大，推测玉米醇溶蛋白已成功聚合在fe3o4的表面上了。
[0071]
2 fe3o
4 nps、zein和mbmips的ft-ir光谱
[0072]
ft-ir分析证实了纳米颗粒结构中存在玉米醇溶蛋白。fe3o4nps、玉米醇溶蛋白(zein)、mbnips和mbmips的ft-ir光谱如图3a所示；fe3o
4 nps在540cm-1
处有很强的吸收峰是由于fe-o的拉伸振动；对于玉米醇溶蛋白，分别在3300和1650cm-1
有吸收峰，是由于羰基和氨基的伸缩振动；对于mbmips和mbnips，fe3o4nps和zein特征吸收峰的出现，说明zein被成功地包裹在了磁性纳米颗粒的表面。
[0073]
3热稳定性研究
[0074]
mbmips在升温速率为5℃/min的大气中进行热稳定性实验(图3b)；mbmips的tga热图显示了25～800℃范围内的两个失重阶段；第一步降解(4.54％的体重下降)是由于物理结合水的损失；在160～600℃范围内，第二次失重率为9.98％，是由于残余有机溶剂的热分解作用。热稳定性研究表明该材料在160℃以内有着较好的热稳定性。
[0075]
4 xrd表征
[0076]
bmmips和fe3o4的x射线衍射图如图3c所示；在2θ＝20
°
～70
°
发现在2θ＝30.45
°
、35.66
°
、43.17
°
、53.39
°
、57.04
°
、62.87
°
时出现6个衍射峰，分别属于fe3o4纳米颗粒(220)、(311)、(400)、(422)、(511)和(440)的晶体平面衍射；通过观察mbmips的xrd光谱，发现两者的光谱完全相同，没有其他杂峰，说明mbmips的制备过程没有破坏fe3o4的晶体结构；此外，mbmips明显小于fe3o4的峰值。我们推测这很可能是由于玉米醇溶蛋白在fe3o4表面的合成所引起的，证明了该材料的成功合成而且没有破坏fe3o4的晶型结构。
[0077]
5磁性考察
[0078]
通过在装有mbmips水溶液的玻璃瓶附近外加磁场，测试了mbmips的磁性能，如图4所示，可以得出结论，即使在fe3o4nps表面上包裹了一层玉米醇溶蛋白、mbmips仍具有较好的磁性能；黑色的mbmips在不到10秒的时间内被收集到磁铁的一侧；磁铁被移走后，磁效应就消失了。利用mbmips的这种能力，可以利用传统的磁体在短时间内实现样品的快速分离。
[0079]
6吸附性能评价
[0080]
6.1吸附等温线
[0081]
制备了一系列50～300μg/ml的标准姜黄素溶液，用于研究mbmips和mbnips的静态吸附容量。姜黄素在mbmips和mbnips上的平衡吸附等温线如图5a所示，当姜黄素浓度分别达到200μg/ml和150μg/ml，mbmips和mbnips吸附饱和且最大吸附容量为32.12mg/g和23.33mg/g；不同的吸附能力是由于mbmips具有特异性识别能力的识别腔，mbnips的非特异性吸附能力是由于zein涂层具有较强的吸附能力。
[0082]
用朗格缪尔方程和弗罗因德利希方程计算了姜黄素吸附等温线，方程如下：
[0083]
朗格缪尔模型：1/qe＝1/(klceqm) 1/qm；
[0084]
弗罗因德利希模型：logqe＝mlogce logα；
[0085]
其中，qe(mg/g)为mbmips或mbnips的平衡吸附量，ce(μg/ml)是姜黄素的浓度，qm(mg/g)为最大吸附量，kl(ml/mg)是朗缪尔常数，m和α是弗伦德里希常数。
[0086]
数据如表1所示；采用弗氏等温线模型mbmips的r2＝0.907，说明该材料的吸附等温线更适用于弗氏模型。
[0087]
表1 langmuir和freundlich方程的吸附等温线常数
[0088][0089]
6.2吸附动力学
[0090]
mbmips和mbnips的吸附动力学如图5b所示；随着提取时间的增加，mbmips和mbnips对姜黄素的吸附能力增加；对于mbmips，最终的吸附平衡在90分钟左右达到，对于
mbnips，最终的吸附平衡在20分钟左右达到；mbmips和mbnips达到平衡所需要的时间可能是mbmips有大量的空腔，这些空腔可以特异性地与样品结合，这也解释了为什么mbmips的动力学较慢。
[0091]
采用伪二阶方程对mmips和mnips的吸附动力学进行了研究，方程如下:
[0092]
t/qt＝t/qe 1/(qe2 k)；
[0093]
其中，qt(mg/g)为mbmips或mbnips的平衡吸附量，k(g/mg
·
min)为伪二阶速率常数。计算所有相关数据，如表2所示。
[0094]
表2伪二阶速率方程的动力学常数
[0095] kr2mbmips0.1220.9992mbnips0.1760.9924
[0096]
6.3抗干扰能力测试
[0097]
对于抗干扰能力测试，将10μm的mg
2
，zn
2
，k

，na

，cl-和co
32-添加到10μm姜黄素标准溶液中；分别用裸gce和mbmip-gce扫描溶液；结果表明，mbmip-gce组对姜黄素的检测无干扰。这意味着mbmip-gce比裸gce具有更强的抗干扰能力。
[0098]
6.4姜黄素的电化学行为
[0099]
分别用mbmip-gce、mbnip-gce和gce三个电极代替工作电极，在10mm姜黄素溶液中循环伏安扫描，见第5节电化学测试，结果如图6a所示，mbmip-gce电极在不同浓度姜黄素下的循环伏安图如图6b所示[从下向上是mbmip-gce电极在各个浓度下的电信号响应(0.1微摩尔到50微摩尔)]；由图可知，工作电极为裸gce时，姜黄素的氧化峰为0.248v，还原峰为0.083v；可以推测姜黄素在裸gce表面发生氧化还原反应；mbmip-gce在电流作用下的氧化还原机理如图6c所示；从图中可以看出，姜黄素在mbmip-gce电极上的电信号最强，ipa较裸gce增加了近10倍。这种电信号的增强很可能是由于mbmips能够特异性地识别样品分子，从而使姜黄素样品分子通过聚合物孔扩散到电极表面并进行氧化还原反应；同时，由于mbmips对模板分子有富集作用，提高了电极的灵敏度，增强了电极的抗干扰能力。
[0100]
6.5检测方法的比较
[0101]
与参考方法(表3)相比，本技术提供的检测方法检测限更低，检测速度更快；本实验采用便携式电化学工作站，该仪器操作简单，使用方便，无需繁琐的预处理即可快速检测。因此，将其用于姜黄渣中姜黄素的检测和提取，以提高姜黄素的提取效率。当然，它也可以用来检测含有10μm以上姜黄素的物品。
[0102]
表3该方法与其它姜黄素检测方法的比较
[0103][0104][0105]
6.6样品分析
[0106]
采用电化学法和高效液相色谱法测定了薯片中姜黄素的含量，按照第6节样品预处理的描述处理样品。结果如表4所示，两种方法测定的姜黄素质量分数分别为0.358％和0.367％，这说明两种方法对姜黄素的检测精度相差不大；与高效液相色谱法相比，该方法分析速度快，测量范围广，仪器设备价格低廉，操作调试简单，适用范围广。
[0107]
表4通过电化学方法和hplc测定马铃薯片中的姜黄素.
[0108][0109]
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
[0110]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。