一种川贝母鳞茎组织培养再生方法与流程

1.本发明涉及植物组织培养技术，特别是涉及一种快速获得大量再生植株的川贝母鳞茎组织培养再生方法。


背景技术：

2.川贝母(fritillaria cirrhosa d.don)为百合科,贝母属多年生草本植物。以干燥鳞茎入药，味苦、性寒,有清热润肺，化痰止咳，散结消痈等功效，是治疗肺热燥咳，干咳少痰，阴虚劳嗽，痰中带血，瘰疬的重要中药材。川贝母主要分布在四川、云南、西藏等地，多长于海拔2800～4700米林中、灌丛下、草地、河滩、山谷等湿地或岩缝中，喜冷凉气候条件，具有耐寒、喜湿、喜荫蔽的特性。气温高于30℃或地温高于25℃时，植株就会枯萎；因此，在海拔低、气温高的地区不能存活。川贝母的繁殖方式主要分为种子繁殖和鳞茎繁殖。但由于其特殊的生境，在自然界中川贝母种子繁殖休眠期长、自然萌发率低，出苗率差；而人工栽培时，鳞茎繁殖系数也较低；因此，川贝母历来以采挖野生资源为主，但随着市场对川贝母需求的日益增长，野生川贝母被过度采挖导致资源紧缺，濒临灭绝，目前川贝母野生资源已远远不能满足市场所需，因此如何现实有效解决川贝母资源短缺问题已变得十分迫切。
3.利用悬浮培养技术可以在短期内获得大量川贝母再生植株，并且不受季节和环境等因素的限制。而且悬浮培养还具有用材少，繁殖效率高，遗传稳定的特点，因此，从野生川贝母种源中选出优良单株再利用悬浮培养技术来实现川贝母的工厂化生产是解决川贝母资源短缺问题最有效的方法之一。目前虽然已有利用悬浮培养技术获得川贝母再生植株的研究，但是还存在增殖时间长，体胚萌发率低等影响川贝母再生植株增殖率的缺陷。


技术实现要素：

4.基于此，本发明的目的在于，提供一种川贝母鳞茎组织培养再生方法，其具有快速获得大量川贝母再生植株的优点。
5.一种川贝母鳞茎组织培养再生方法，包括以下步骤：
6.s1外植体处理：选川贝母鳞片作为外植体，消毒，备用；
7.s2胚性愈伤组织诱导：将s1处理后的鳞片接种至胚性愈伤诱导培养基中，在25
±
2℃下暗培养至形成胚性愈伤组织；
8.s3增殖培养：将s2中获得的胚性愈伤组织按40g/l转接至增殖培养基中，在25℃恒温摇床上120r/min暗培养，每15日继代1次，连续继代4次；
9.s4分化培养：对s3中获得的培养物离心去上清后，将留下的细胞团转接至分化培养基中，在25℃恒温摇床上120r/min暗培养，期间至少更换一次培养基，直至分化出直径为1～2mm的体胚；
10.s5萌发培养：将s4获得的体胚接种到体胚萌发培养基上进行萌发，先将体胚置于10℃下暗培养7～14日，然后再将其转至培养条件温度为20～25℃，光周期8/16h，光照强度1000～1500lux的环境下进行培养至体胚发育成基部有白色粗根的乳白色小鳞茎；
11.s6植株再生：将s5中得到的已生根的小鳞茎从愈伤组织中分离并转接到sh基础培养基上继续培养至小鳞茎分化抽芽，期间至少更换一次新鲜培养基，培养条件为20～25℃，光周期12/12h，光照强度2000lux；
12.所述胚性愈伤诱导培养基以每升计算，其制备方法为：在sh培养基母液中加入1～2mg的2,4-d、0.5～1mg的6-ba、0.5～2mg的naa和30g蔗糖后用水定容至于一升，调节ph至5.8，最后加入2.5g的琼脂；
13.所述增殖培养基以每升计算，其制备方法为：在sh培养基母液中加入1～2mg的2,4-d、0.5～1mg的naa和30g蔗糖后用水定容至一升，调节ph至5.8；
14.所述分化培养基以每升计算，其制备方法为：在sh培养基母液加入0.5～2mg的6-ba和45g的蔗糖后用水定容至一升，调节ph至5.8；
15.所述萌发培养基以每升计算，其制备方法为：在sh培养基母液加入0.5～2mg的6-ba和30g的蔗糖后用水定容至一升，调节ph至5.8后加入0.5～2g的活性炭和2.5g的琼脂；
16.所述sh基础培养基以每升计算，其制备方法为：在sh培养基母液加入30g的蔗糖后用水定容至一升，调节ph至5.8后加入0.5～2g的活性炭和2.5g的琼脂。
17.本发明中，所述naa是1-萘乙酸的简称；所述6-ba是6-苄氨基嘌呤的简称，所述2,4-d是2,4-二氯苯氧乙酸的简称。本发明中，所述sh培养基的配方为无水氯化钙(cacl
2)
151.02mg/l、七水合硫酸镁(mgso4.7h2o)400mg/l、硝酸钾(kno3)2500mg/l、磷酸二氢铵(nh4h2po3)300mg/l。
18.本发明提供的川贝母鳞茎组织培养再生方法通过在液体环境对川贝母鳞茎愈伤组织进行增殖培养实现短时间内大量增殖，并通过在萌发培养环节对体胚进行短期低温暗培养处理提高了体胚的萌发率，从而进一步提高川贝母的繁育率。
19.进一步地，在上述方法的步骤s5中，将体胚置于10℃下暗培养的时间为7日。此时可得到更佳的体胚萌发率。
20.进一步地，在上述方法的步骤s3中，所述胚性愈伤组织为从s2中形成的胚性愈伤组织中挑选的浅黄色、疏松呈颗粒状的胚性愈伤组织。
21.进一步地，在上述方法的步骤s3中，每个月用20目不锈钢筛网对培养物进行过滤，保留直径小于1mm的细胞继续增殖培养。此时可获得大小均一、分散性良好的细胞系。
22.进一步地，在上述方法的在步骤s2中，所述川贝母鳞片切成大小为0.5cm2的块状后再进行接种至胚性愈伤诱导培养基中。
23.进一步地，在上述方法的步骤s1中，所述消毒方法为先在流水下对整个鳞茎进行涮洗，去掉表面粗皮和须根；随后将鳞片由内而外分开，再用软刷蘸取洗洁精对其进行涮洗后，最后在自来水下将洗洁精漂净。将洗净的鳞片放入无菌瓶并转入超净工作台内，用75％酒精浸泡15～30s，再用0.1％hgcl2浸泡8～15min，无菌水漂洗5～8次，用无菌滤纸吸干表面水分。
24.进一步地，在上述方法的步骤s4中，每7日更换一次培养基；在步骤s6中，每30日更换一次培养基。
25.为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
26.图1是川贝母鳞茎组织培养再生的不同阶段的照片，其中a是川贝母鳞茎；b是从外植体诱导出的胚性愈伤组织；c是增殖培养和分化培养阶段的液体培养环境；d是胚性细胞悬浮系分化出的体细胞胚；d是体细胞胚萌发得到的基部有白色粗根的再生小鳞茎；f是分化出芽的再生小鳞茎。
具体实施方式
27.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
28.实施例1
29.一种川贝母鳞茎组织培养再生方法，包括以下步骤：
30.s1外植体处理：选取鳞片闭合较紧密，外表面无明显伤口、霉变、腐烂情况的新鲜川贝母鳞茎作为外植体，先在流水下对整个鳞茎进行涮洗，去掉表面粗皮和须根；随后将鳞片由内而外分开，再用软刷蘸取洗洁精对其进行涮洗后，最后在自来水下将洗洁精漂净。将洗净的鳞片放入无菌瓶并转入超净工作台内，用75％酒精浸泡15～30s，再用0.1％hgcl2浸泡8～15min，无菌水漂洗5～8次，用无菌滤纸吸干表面水分。
31.s2胚性愈伤组织诱导：完成消毒处理后的鳞片切成0.5cm2左右的小块接种到胚性愈伤诱导培养基上，在25
±
2℃下暗培养进行培养，经过30～45d开始形成浅黄色致密的胚性愈伤组织。
32.所述胚性愈伤诱导培养基以每升计算，其制备方法为：在sh培养基母液中加入2mg的2,4-d、0.5mg的6-ba、0.5mg的naa和30g蔗糖后用水定容至于一升，调节ph至5.8，最后加入2.5g的琼脂。
33.s3增殖培养：在步骤s2获得的胚性愈伤组织中挑选浅黄色、结构疏松呈颗粒状的胚性愈伤组织，按40g/l的接种量转接到增殖培养基中，放到25℃恒温摇床上120r/min，黑暗条件下进行增殖培养。培养中每15日继代1次，连续继代4次，以促进细胞增殖。培养过程中，每次继代时通过离心去掉原培养液后再补充等量新鲜培养液；每个月用20目不锈钢筛网对培养物过滤，并收集直径小于1mm的细胞继续进行增殖培养。
34.所述增殖培养基以每升计算，其制备方法为：在sh培养基母液中加入1mg的2,4-d、0.5mg的naa和30g蔗糖后用水定容至一升，调节ph至5.8；
35.s4分化培养：将步骤s3中获得的细胞悬液离心后，弃上清，将留下的细胞团按1g/l转接至分化培养基中，在25℃恒温摇床上120r/min，黑暗条件下进行胚状体诱导培养。培养过程中每7日更换一次培养基，约35日后胚性细胞团可分化出直径为1～2mm大小的体胚。
36.所述分化培养基以每升计算，其制备方法为：在sh培养基母液加入1mg的6-ba和45g的蔗糖后用水定容至一升，调节ph至5.8。
37.s5萌发培养：将步骤s4中得到的直径为1～2mm大小的体胚转接至萌发培养基上，20个体胚一皿，设置3个重复。先将其置于10℃下暗培养7日，然后再将其转至培养温度为20℃，光周期8/16h，光照强度1000～1500lux的培养室内进行培养，20日后，统计体胚萌发率。
38.所述萌发培养基以每升计算，其制备方法为：在sh培养基母液加入1mg的6-ba和
30g的蔗糖后用水定容至一升，调节ph至5.8后加入0.75g的活性炭和2.5g的琼脂。
39.s6植株再生：将步骤s5得到的再生小鳞茎从愈伤组织中分离并转接到sh基础培养基上在20℃，光周期12/12h，光照强度2000lux的条件下继续培养，直至再生小鳞茎形成带有白色粗根的幼苗。培养期间，每30日更换一次新鲜培养基。
40.所述sh基础培养基以每升计算，其制备方法为：在sh培养基母液加入30g的蔗糖后用水定容至一升，调节ph至5.8后加入0.75g的活性炭和2.5g的琼脂。
41.实施例2
42.将实施例一的步骤s5改为将步骤s4中得到的直径为1～2mm大小的体胚转接至萌发培养基上，20个体胚一皿，设置3个重复。先将其置于10℃下暗培养14日,然后再将其转至培养温度为20℃，光周期8/16h，光照强度1000～1500lux的培养室内进行培养。20日后，统计体胚萌发率。所述萌发培养基以及其余步骤同实施例1。
43.对比例
44.将实施例一的步骤s5改为将步骤s4中得到的直径为1～2mm大小的体胚转接至萌发培养基上，20个体胚一皿，设置3个重复。在培养温度为20℃，光周期8/16h，光照强度1000～1500lux的培养室内进行培养20日后统计体胚萌发率。所述萌发培养基以及其余步骤同实施例1。
45.所述实施例1、2和对比例1的体胚萌发率如表1所示。
46.其中所述体胚萌发率(％)＝(萌发体胚数/接种体胚总数)
×
100，所述萌发体胚的定义为基部膨大发育成乳白色小鳞茎，且在鳞茎基部生出表面光滑的白色根系的体胚。
47.表1
48.实验参数对比例实施例1实施例2低温暗培养处理时间(日)0714体胚萌发率(％)35.075.065.0
49.表1中对比例和实施例1、2的对比显示，在其余条件相同的情况下，分别进行了7日和14日低温暗培养处理的体胚均比不进行低温暗培养处理的体胚有更高的体胚萌发率。其中，当低温暗培养处理时间为7日时，体胚萌发率最高，为75.0％，高于对比例的两倍。因此，可见对体胚进行7～14日的低温暗培养处理可使体胚获得更高的萌发率，从而提高川贝母再生植株增殖率。而当低温暗培养处理时间为7日时，可得到最高的体胚萌发率。
50.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，则本发明也意图包含这些改动和变形。