阿霉素诱导斑马鱼血管内皮损伤模型及建立方法、应用

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种阿霉素诱导斑马鱼血管内皮损伤模型及建立方法、应用。


背景技术：

2.阿霉素（doxrubicin, dox）是一种广谱的肿瘤化疗药物，在急性白血病、恶性淋巴瘤、乳腺癌、肺癌等多种实体瘤和血液系统肿瘤的治疗中有很好的疗效。但是在临床中约5%-48%的肿瘤病人首次使用阿霉素即可出现不可逆的心脏损伤，并且随着应用过程中药物的累积，心脏损伤不断加重，最终发展为心脏衰竭，这严重影响肿瘤治疗和病人的生存质量。
3.目前对阿霉素心脏毒性机制的研究很多，但绝大多集中于阿霉素对心肌细胞的毒性，然而阿霉素关于血管内皮细胞的毒性研究较少。内皮细胞是心血管系统的重要组成部分，在维持血管系统的稳态方面起着重要作用，它们受到物理、化学的损害后，产生各种毒副作用最终改变心脏功能。此外，内皮功能障碍导致心血管并发症，如动脉粥样硬化和狭窄。抗癌药物如阿霉素、柔红霉素等，都曾被报道会引起内皮损伤。但阿霉素对血管内皮细胞的毒副作用机制仍未被清楚地理解，因此建立简便、易行的血管内皮损伤的动物模型显得非常迫切。为了预防阿霉素的毒副作用，各种血管内皮损伤的预防药物受到了关注，也迫切需要合适好用的血管内皮损伤动物模型。
4.斑马鱼是一种用来研究器官发育和人类疾病模型的经典模型，具有胚胎透明、可直接观察内部器官、受试品用量少、筛选周期短和实验操作简便等独特优势。斑马鱼是脊椎动物，有独立的组织器官，其器官与人器官在结构、生理等方面惊人地相似。斑马鱼在分子水平上85% 与人类相同，心血管系统早期发育极为相似。fli-gfp 转基因斑马鱼是一种在血管内皮细胞表面表达 gfp 的转基因整体模型，受精后2天( 2dpf) 背动脉与轴静脉形成简单循环网，受精后3天( 3dpf) 功能性管脉系统形成，肠下静脉血管( sivs) 呈现，因此可以在细胞板中观察斑马鱼胚胎的血管生成发育过程。


技术实现要素：

5.本发明的第一个目的在于提供一种阿霉素诱导斑马鱼血管内皮损伤模型的建立方法。
6.本发明的第二个目的在于建立一种简便、易行的血管内皮损伤的动物模型。
7.本发明的第三个目的在于将建立的动物模型用于研发预防和治疗阿霉素的血管内皮损伤毒副作用的药物研究。
8.为实现上述目的，本发明通过以下技术方案加以实现：所述阿霉素诱导斑马鱼血管内皮损伤模型的建立方法，包括以下步骤：1）取受精后48小时大的转基因的斑马鱼胚胎出膜后，于6孔板中；2）采用静脉注射给予阿霉素，28℃造模24h，得到斑马鱼血管损伤模型。
9.进一步地，步骤1）中转基因斑马鱼为tg(fli-1:egfp)。
10.进一步地，步骤2）中阿霉素的注射量为2nl/尾，阿霉素的浓度为2.9mg/ml-5.8 mg/ml。
11.采用上述方法得到的用于筛选抗血管内皮损伤药物的斑马鱼血管内皮损伤模型及该模型在研发预防和治疗阿霉素的血管内皮损伤毒副作用的药物研究中的应用。
12.本发明通过静脉注射获得斑马鱼血管内皮损伤模型及建立方法，其建立方法简单易于实现，筛选周期短，既具备体内动物的生物复杂性，又可进行体外实验的高通量特性的筛选。另外斑马鱼模型胚胎透明，可直接观察内部血管，并且斑马鱼的心血管系统早期发育与人极为相似，适合模拟临床上阿霉素对血管内皮细胞的毒副作用，对治疗阿霉素的毒副作用和研发预防血管内皮损伤的药物更具参考意义。
附图说明
13.图1为阿霉素对斑马鱼血栓表型图（con：正常组，sol：溶剂对照组，dox 5.8ng：阿霉素 5.8 ng/尾组，dox 11.6ng：阿霉素 11.6 ng/尾组，黄色虚线框为观察部位）；图2为阿霉素诱导血管内皮损伤模型（肠下血管面积&肠下血管分支数）表型图（con：正常组，sol：溶剂对照组，dox 5.8ng：阿霉素 5.8 ng/尾组，dox 11.6ng：阿霉素 11.6 ng/尾组，黄色虚线框为分析部位）；图3为阿霉素诱导血管内皮损伤模型斑马鱼肠下血管面积与溶剂对照组比较图（*p《 0.05，***p《 0.001）；图4为阿霉素诱导血管内皮损伤模型斑马鱼肠下血管分支数与溶剂对照组比较（*p《 0.05，***p《 0.001）；图5为阿霉素诱导血管内皮损伤模型（节间血管直径）表型图，（con：正常组，sol：溶剂对照组，dox 5.8ng：阿霉素 5.8 ng/尾组，dox 11.6ng：阿霉素 11.6 ng/尾组，黄色虚线框为分析部位）；图6为阿霉素诱导血管内皮损伤模型斑马鱼节间血管直径与溶剂对照组比较图，（***p《 0.001）。
具体实施方式
14.以下结合说明书附图对本发明做进一步详细说明，以便更好地理解本技术方案。
15.实验材料样品配制信息：盐酸阿霉素,cas号:25316-40-9（dox，usp级，98%hplc），购自上海源叶生物科技有限公司，用dmso配制成10mm母液，-20 ℃储存。
16.实验动物：斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中（水质：每1l反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为450-550 μs/cm；ph为6.5-8.5；硬度为50-100 mg/l caco3），由杭州环特生物科技股份有限公司养鱼中心繁殖提供，实验动物使用许可证号为：syxk（浙）2012-0171，饲养管理符合国际aaalac认证（认证编号：001458）的要求。
17.转基因血管荧光fli-1品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后2天（2dpf）。用于血管内皮损伤模型评价。
18.仪器、耗材与试剂：解剖显微镜（szx7，olympus，japan）；ccd相机（verta1，上海土
森视觉科技有限公司，china）；电动聚焦连续变倍荧光显微镜（az100，nikon，japan）；精密电子天平（cp214，ohaus，america）；6孔板（nest biotech，china）。
19.二甲基亚砜（dmso，批号bcbz1685，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，france）；甲基纤维素（批号079k0054v，sigma，usa）。
20.实施例1：阿霉素诱导血管内皮损伤模型，验证血栓发生率具体步骤为：1）取受精后48小时大的转基因血管荧光fli-1品系斑马鱼胚胎出膜后，于6孔板中，每孔（实验组）均处理30尾斑马鱼；2）分别静脉注射给予阿霉素5.80 ng/尾（2.90 mg/ml每尾斑马鱼注射2 nl）和11.6 ng/尾剂量（5.80 mg/ml每尾斑马鱼注射2 nl），同时设置正常对照组和溶剂对照组，每孔容量为3 ml；3）注射给药不需要清洗，28℃造模24 h，得到斑马鱼血管损伤模型；4）造模结束后，邻联茴香胺染色，在解剖显微镜下观察每组30尾斑马鱼的血栓发生率（%），以该指标的统计学分析结果评价阿霉素诱导斑马鱼血管内皮损伤模型。统计学处理结果采用mean
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se表示。用spss26.0软件进行统计学分析，p《 0.05表明差异具有统计学意义。
21.在本实验条件下，阿霉素诱导斑马鱼血栓发生率增加，血栓发生率随剂量增加而增加。详见表1和图1。
22.表阿霉素诱导血管内皮损伤模型（血栓发生率）实验结果（n=30）与溶剂对照组比较，***p《 0.001从表1和图1可知：静脉注射给予5.80 ng/尾的阿霉素剂量，30尾斑马鱼中观察到19尾发生血栓，血栓发生率为63.3%，与溶剂对照组相比，血栓发生率显著升高（p《 0.001）。静脉注射给予11.6 ng/尾的阿霉素剂量，30尾斑马鱼中观察到23尾发生血栓，血栓发生率为66.7%，与溶剂对照组相比，血栓发生率显著升高（p《 0.001）。
23.实施例2：阿霉素诱导血管内皮损伤模型，用于验证肠下血管面积、肠下血管分支数及节间血管直径具体步骤为：1）取受精后48小时大的转基因血管荧光fli-1品系斑马鱼胚胎出膜后，于6孔板中，每孔（实验组）均处理30尾斑马鱼；2）分别静脉注射给予阿霉素5.80 ng/尾（2.90 mg/ml每尾斑马鱼注射2 nl）和11.6 ng/尾剂量（5.80 mg/ml每尾斑马鱼注射2 nl），同时设置正常对照组和溶剂对照组，每孔容量为3ml；3）注射给药不需要清洗，28℃造模24h，得到斑马鱼血管损伤模型；
4）造模结束后，每个实验组随机选择10尾斑马鱼在荧光显微镜下进行观察、拍摄并保存图片，利用nis-elements d 3.20高级图像处理软件分析并采集数据，分别分析（1）斑马鱼节间血管直径；（2）肠下血管面积；（3）肠下血管分支数。以这些指标的统计学分析结果评价阿霉素诱导斑马鱼血管内皮损伤模型。统计学处理结果采用mean
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se表示。用spss26.0软件进行统计学分析，p《 0.05表明差异具有统计学意义。
24.在本实验条件下，阿霉素诱导血管内皮损伤模型，主要表现为肠下血管面积增大；肠下血管分支数增加；节间血管直径减小。详见表2及图2-图6。
25.表2 阿霉素诱导血管内皮损伤模型实验结果（n=10）与溶剂对照组比较，*p《 0.05，***p《 0.001从表2和图2-图4可知：静脉注射给予5.80 ng/尾的阿霉素剂量，斑马鱼的肠下血管面积为68619
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3616像素，肠下血管分支数为8.30
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0.396条，与溶剂对照组相比，肠下血管面积显著增大（p《 0.05），肠下血管分支数显著增加（p《 0.05）；静脉注射给予11.6 ng/尾的阿霉素剂量，斑马鱼的肠下血管面积为78830
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6393像素，肠下血管分支数为9.20
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0.442条，与溶剂对照组相比，肠下血管面积显著增大（p《 0.001），肠下血管分支数显著增加（p《 0.001）。
26.从表2和图5-图6可知：静脉注射给予5.80 ng/尾的阿霉素剂量，斑马鱼的节间血管直径为13.2
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0.509像素，与溶剂对照组相比，无显著差异（p》 0.05）；静脉注射给予11.6 ng/尾的阿霉素剂量，斑马鱼的节间血管直径为10.6
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0.289像素，与溶剂对照组相比，节间血管直径显著减小（p《 0.001）。