一种脱细胞真皮及其制备方法与流程

1.本发明涉及生物医用材料领域，具体涉及一种脱细胞真皮及其制备方法。


背景技术：

2.组织修复或创伤愈合是指外伤或其它疾病造成组织缺损(如伤口、创面等)后,局部组织通过增生或再生方式来进行修补的一系列病理生理过程。尽管不同组织在遭受创伤后都有各自的修复特征与规律,但软组织,特别是体表软组织创伤后的修复过程与规律最具代表性,皮肤是人体最大的组织器官，无论在平时还是战时，皮肤损伤都是最常见的。皮肤创伤修复是一个复杂而渐进的过程，需要多方面的协同作用，不仅需要机体内部的生理修复，同时也需要人为提供创伤修复材料及时覆盖伤口，提供有利于伤口愈合的环境。脱细胞真皮是通过物理或化学的方法，去除皮肤中可能诱发强烈排斥反应的表皮层和真皮中的细胞成分及皮肤附属器后剩下的真皮组织，其具有完整的三维网状结构、生物相容性好，与自体皮肤组织成分最接近，基于上述优点，脱细胞真皮在软组织修复特别是皮肤创伤修复中具有较高的应用价值。
3.目前的软组织修复材料主要分为不可吸收型(聚酯补片、聚丙烯补片、膨化聚四氟乙烯补片等)；可吸收型(聚羟基乙酸、聚乳酸羟基乙酸等)；复合材料以及生物材料(自体皮、同种异体皮、异种皮、羊膜、脱细胞真皮基质、小肠粘膜下层、胶原类等)。
4.以生物材料为例，目前大部分生物材料在处理过程中都会采取脱细胞和交联的方法进行处理，脱细胞的方法主要有反复冻融法、高渗溶液法、酶和去垢剂等，具体试剂如：dispaseⅱ、十二烷基硫酸钠和dna酶联合、冻融后超声、0.01-0.20％edta、十二烷基硫酸钠、维生素c、dnae酶、胰酶、0.25％-5％曲拉通、甘油碱溶液等。个别生物材料还会选择使用强酸强碱等试剂对材料进行脱细胞处理。然而上述方法存在如下的缺陷：
5.(1)生物材料产品目前在处理的过程中多使用交联剂，目的是提高产品的力学性能，然而交联后的产品在使用过程中会抑制伤口的愈合，短期内材料的细胞毒性增大，刺激局部组织产生长时间的炎症反应，有些交联剂在长期的组织修复中会释放交联剂单体，对局部组织和机体产生慢性毒性；
6.(2)部分生物材料产品在制备时使用强酸强碱等试剂，强烈的反应大大破坏了胶原的结构，甚至破坏异体皮肤在修复过程中起到重要修复作用的基底膜的完整性，使产品在使用过程中效果下降，甚至无法起到组织修复作用；
7.(3)部分生物材料产品的处理工艺脱细胞效果差，无法彻底去除细胞并降低引起免疫排除反应的dna残留，使产品的免疫原性差；
8.(4)个别种类酶的使用可能会因为浓度过大或处理时间不够等各种因素的问题使材料出现过度处理或处理不到位的问题，过度处理导致胶原结构破坏或松散，部分基底膜被破坏或不存在；处理不到位导致细胞残留，免疫原性不符合要求。


技术实现要素：

9.因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的脱细胞真皮免疫原性高、排斥反应大、胶原结构和基底膜不完整、交联皮毒性大等缺陷，从而提供一种脱细胞真皮及其制备方法，制备的脱细胞真皮无表皮层，无细胞残留，dna残留低，免疫原性低，无免疫排斥反应，且保持了完整的胶原结构和基底膜，毒性低，符合生物材料产品使用要求。
10.为此，本发明提供了如下的技术方案：
11.一种脱细胞真皮的制备方法，包括：
12.s1、采用甘油溶液浸泡原料皮；
13.s2、采用低渗透压溶液浸泡s1步骤中的原料皮；
14.s3、重复步骤s1-s2的次数为≥0次。
15.可选的，还包括：
16.s1步骤中，采用不同浓度的甘油溶液依次浸泡原料皮。
17.可选的，在s1步骤中，采用浓度梯度递增的甘油溶液依次浸泡原料皮。
18.可选的，在s1步骤中，所述甘油溶液依次为甘油浓度为体积百分比10％-50％、体积百分比50％-85％、体积百分比85％-98％的甘油溶液。
19.可选的，采用甘油浓度为体积百分比10-50％的甘油溶液浸泡原料皮的条件为，室温浸泡3-10h。
20.可选的，采用甘油浓度为体积百分比50-85％的甘油溶液浸泡原料皮的条件为，室温浸泡4-8h。
21.可选的，采用甘油浓度为体积百分比85-98％的甘油溶液浸泡原料皮的条件为，33℃-37℃浸泡3-12h；
22.可选的，采用甘油浓度为体积百分比85-98％的甘油溶液浸泡原料时，每浸泡0.5-1.5h超声振荡10-30min后进行换液，超声条件为20khz-50khz,220w。通过此条件下浸泡原料皮，有利于组织内细胞彻底脱水，通过超声振荡使脱水后细胞脱落，另外高浓度甘油具有去除病毒，杀灭细菌作用。
23.可选的，所述甘油溶液的溶剂是乙醇水溶液或生理盐水。所述乙醇水溶液和生理盐水都有助于去除表皮，且乙醇水溶液还有协助去病毒杀灭细菌的作用，甘油在上述溶剂的配合下具有更优的脱除表皮和去病毒杀灭细菌的作用。
24.可选的，所述甘油溶液的溶剂是乙醇水溶液时，甘油浓度为体积百分比10-50％的甘油溶液时，所用的溶剂乙醇浓度为体积百分比0.2-10％；可选的，所用的溶剂乙醇浓度为体积百分比5％；上述浓度的乙醇溶液有助于脱表皮的作用，协助甘油去除表皮。
25.可选的，所述甘油溶液的溶剂是乙醇水溶液时，甘油浓度为体积百分比50-85％的甘油溶液时，所用的溶剂乙醇浓度为体积百分比50-85％；可选的，所用的溶剂乙醇浓度为体积百分比75％；上述浓度的乙醇溶液有助于去病毒杀灭细菌。
26.可选的，所述甘油溶液的溶剂是乙醇水溶液时，甘油浓度为体积百分比85-98％的甘油溶液时，所用的溶剂乙醇浓度为体积百分比95-99％。可选的，所用的溶剂乙醇浓度为体积百分比99％；上述浓度的乙醇溶液有助于脱水，可协助甘油脱水去细胞。
27.可选的，所述低渗透压溶液为水或低渗盐水。可选的，所述低渗盐水为质量分数小于0.9％的氯化钠溶液。
28.在所述的脱细胞真皮的制备方法中，所述低渗透压溶液浸泡原料皮的条件为室温浸泡7-12h；
29.可选的，在低渗透压溶液浸泡前，用低渗透压溶液对所述原料皮进行清洗。上述清洗的作用，一方面是清洗上一步骤所用的试剂，以及上一步处理后脱落的细胞和表皮，另一方面在清洗的同时可以由于渗透压的改变使残留细胞胀破脱落。
30.在所述的脱细胞真皮的制备方法中，还包括，将步骤s3处理后的原料皮经表面活性剂、pbs缓冲液、dna水解酶和/或氨基酸溶液浸泡处理的步骤。上述步骤中，表面活性剂起到进一步脱细胞的作用，pbs缓冲液起到清洗的作用，dna水解酶起到进一步去除破碎细胞残留dna的作用，氨基酸溶液起到对组织材料补充营养的作用。
31.可选的，所述表面活性剂包括质量百分比0.05-0.4％sds溶液、聚乙二醇溶液、聚山梨酯80溶液、tritonx-100溶液、磷酸三丁酯溶液、tritonx-200溶液或脱氧胆酸钠溶液；
32.可选的，所述表面活性剂的浓度为含体积百分比0.2％-0.5％tritonx-100和/或质量百分比0.05-0.4％sds中的水溶液；
33.可选的，采用表面活性剂浸泡处理时，于室温振荡1-2h，振荡转速为80-100rpm，每10-30min换液一次；
34.可选的，所述氨基酸溶液包括谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸或天门冬氨酸中的少一种；
35.可选的，所述氨基酸溶液的浓度为质量百分比为0.2％-1％；可选的为，0.5％；
36.可选的，采用氨基酸溶液浸泡处理时，于4℃浸泡4h；
37.可选的，所述dna水解酶浓度为3-7g/l，ph为7.0；
38.可选的，采用dna水解酶浸泡处理时，于30℃，浸泡时间为3-7h；
39.可选的，还包括，将制备得到的脱细胞真皮进行包装和灭菌。
40.在所述的脱细胞真皮的制备方法中，步骤s3处理后的原料皮依次经过表面活性剂、pbs缓冲液、dna水解酶和氨基酸溶液浸泡处理；
41.在所述的脱细胞真皮的制备方法中，所述原料皮为异体皮肤。
42.本发明提供了一种由上述的制备方法制备得到的脱细胞真皮；
43.可选的，所述脱细胞真皮dna残留≤1.0ng/mg，无细胞残留；
44.更可选的，所述脱细胞真皮拉伸强度为10.25-11.56mpa，缝合强度17.1-18.1n。本发明制备的脱细胞真皮没有破坏胶原组织的结构，使结构更加致密，弹性更大，用于软组织修复烧创伤优势更突出。
45.本发明技术方案，具有如下优点：
46.1.本发明提供的一种脱细胞真皮的制备方法包括：s1、采用甘油溶液浸泡原料皮；s2、采用低渗透压溶液浸泡s1步骤中的原料皮；s3、重复步骤s1-s2的次数为≥0次；利用甘油溶液可以有效的脱细胞去病毒去表皮并保证基底膜和脱细胞真皮的结构形态完整，上述利用的是甘油的脱水剂作用及固定组织细胞内游离水作用使细胞可以脱离原位组织，另外结合低渗透压溶液产生的渗透差，浸泡处理原料皮，采用渗透压法，进一步脱细胞去表皮，获得完整的脱细胞真皮，相比传统的高渗溶液-低渗溶液仅利用浓度梯度产生渗透压差作用无法固定组织保证完整的真皮状态以及去病毒杀灭细菌，本发明的方法能够有效的去除表皮、脱细胞、杀灭病毒和细菌，同时使得真皮获得完整的胶原结构和基底膜，此外该方法不使用交联剂，无交联剂残留引起的慢性毒性，不使用强酸强碱等激烈试剂，对脱细胞真皮
的胶原结构没有破坏，去表皮脱细胞工艺温和，完整的保留了基底膜和真皮的胶原结构，且彻底清除细胞，dna残留量低，无免疫原性，通过此工艺的处理，可以获得具有一定抗感染能力和一定抗张强度的，无细菌病毒病原体的，组织相容性良好的且易于自体细胞黏附生长的软组织修复产品。
47.2.本发明提供的一种脱细胞真皮的制备方法包括在s1步骤中，采用浓度梯度递增的甘油溶液依次浸泡原料皮；梯度浓度的甘油溶液具有脱水剂作用以及固定组织细胞内游离水的作用，使细胞可以脱离原位组织，配合低渗溶液作为复水剂，进一步利用渗透压原理，对皮肤组织进行反复处理，使残留细胞脱水后吸水胀破，不同浓度的甘油溶液对脱细胞真皮的作用侧重效果不同，采用梯度浓度处理更有利于细胞的脱水分离及后续复水胀破，脱细胞脱表皮的效果更好更彻底，又不会破坏胶原和基底膜的结构，偏高浓度的甘油具有杀灭细菌和病毒的效果，且可以固定组织。
48.3.本发明提供的一种脱细胞真皮的制备方法，该方法采用梯度浓度的甘油溶液超声振荡配合低渗透压溶液反复浸泡的渗透压法，进行脱细胞去表皮去病毒固定组织处理，结合表面活性剂、pbs缓冲液、dna水解酶、氨基酸等试剂对脱细胞真皮进行进一步处理，最终达到彻底去表皮脱细胞固定真皮组织的作用。
附图说明
49.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
50.图1是本发明实施例1脱细胞真皮的组织切片图；
51.图2是本发明实施例2脱细胞真皮的组织切片图；
52.图3是本发明对比例1脱细胞真皮的组织切片图；
53.图4是本发明对比例2脱细胞真皮的组织切片图；
54.图5是本发明实施例1处理后的脱细胞真皮在扫描电镜下的多孔结构图(放大比例
×
10000)；
55.图6是本发明实施例1处理后的脱细胞真皮的去病毒效果验证结果；
56.图7是本发明实施例1脱细胞真皮处理前后mhc抗原染色在光学显微镜检查图(放大比例
×
100)；
57.图8是正常皮肤的表皮乳突的组织切片图；
58.图9是本发明实施例1脱细胞真皮的修复部位的表皮乳突的组织切片图。
具体实施方式
59.提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
60.实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验
步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
61.下述实施例中的甘油乙醇溶液为甘油溶于乙醇水溶液中制备得到。
62.甘油生理盐水溶液为甘油溶于盐水中制备得到，得到的甘油生理盐水溶液中氯化钠浓度为0.9％。
63.下述实施例中的室温的温度范围为10-30℃。
64.本发明中的原料皮材料可以是人源皮肤或是动物源皮肤，动物源皮肤如猪源皮肤、羊源皮肤等，下述实施例中使用的原料皮材料为人源皮肤。
65.实施例1
66.本实施例提供了一种脱细胞真皮的制备方法，包括如下步骤：
67.(1)将原料皮置于甘油浓度为体积百分比10％-50％的甘油溶液(所用的溶剂乙醇浓度为体积百分比0.2％-10％)充分反应，在本实施例中选择甘油溶液(所用的溶剂为体积百分比5％乙醇水溶液，甘油体积百分比30％)，室温浸泡处理3h；
68.(2)将步骤(1)中的原料皮取出置于浓度为体积百分比50％-85％的甘油溶液(所用的溶剂乙醇浓度为体积百分比50-85％)中，充分反应，在本实施例中选择甘油溶液(所用的溶剂为体积百分比75％乙醇水溶液，甘油体积百分比85％)，室温浸泡处理4h；
69.(3)将步骤(2)中的原料皮取出置于浓度为体积百分比85％-98％的甘油溶液中，充分反应，在本实施例中选择甘油溶液(所用的溶剂为体积百分比99％乙醇水溶液，甘油体积百分比98％)，于35℃下浸泡处理12h，每浸泡1h超声振荡20min后更换为上述新的甘油乙醇溶液，超声条件：50khz,220w；
70.(4)将步骤(3)中的原料皮取出置于低渗透压溶液中漂洗5遍后置于低渗透压溶液中浸泡，所述低渗透压溶液可以是水或低渗盐水(浓度为质量分数小于0.9％的氯化钠溶液)，充分反应，在本实施例中选择将原料皮取出置于纯化水中漂洗5遍(每次25khz超声处理5分钟)后置于纯化水中，室温浸泡7h；
71.(5)将步骤(4)中的原料皮置于甘油浓度为体积百分比10％-50％的甘油溶液中，充分反应，在本实施例中选择甘油浓度为体积百分比30％的甘油溶液(所用的溶剂为生理盐水)，室温浸泡10h；
72.(6)将步骤(5)中的原料皮取出置于浓度为甘油体积百分比50％-85％的甘油溶液(所用的溶剂为生理盐水)中，充分反应，在本实施例中选择甘油浓度为体积百分比85％的甘油溶液(所用的溶剂为生理盐水)，室温处理4h；
73.(7)将步骤(6)中原料皮取出置于浓度为体积百分比85％-98％的甘油溶液(所用的溶剂为生理盐水)中，充分反应，在本实施例中选择甘油浓度为体积百分比98％的甘油溶液(所用的溶剂为生理盐水)，35℃，处理3h，每浸泡1h超声振荡20min后更换为上述新的甘油溶液，超声条件：50khz,220w；
74.(8)将步骤(7)中的原料皮取出置于低渗透压溶液中漂洗干净后置于生理盐水中浸泡，所述低渗透压溶液可以是水或低渗盐水(浓度为质量分数小于0.9％的氯化钠溶液)，在本实施例中选择将原料皮取出置于纯化水中漂洗5遍后置于生理盐水中，室温浸泡12h；
75.(9)表面活性剂处理：将步骤(8)中的原料皮取出置于表面活性剂中浸泡处理，在本实施例中选择体积百分比0.5％tritonx-100溶液室温振荡2h，振荡转速为100rpm，每浸
泡10分钟换液一次；
76.(10)dna水解酶处理：将步骤(9)中的原料皮取出用纯化水漂洗5遍后于浓度为6g/l，ph为7.0的dna水解酶(dnase)中，30℃下浸泡反应5h；
77.(11)氨基酸溶液处理：将步骤(10)中的原料皮取出用纯化水漂洗后置于氨基酸溶液中浸泡处理，在本实施例中选择浓度为质量百分比0.5％谷氨酸溶液，室温浸泡2h；
78.(12)pbs缓冲液处理：将步骤(11)中的原料皮取出用纯化水漂洗5次(每次25khz超声处理2分钟)后置于pbs缓冲液(ph＝7.2-7.4)中室温浸泡2h；
79.(13)包装和灭菌：生理盐水漂洗两遍并装袋封口保存，然后将包装好的产品经钴-60或电子束辐射灭菌，灭菌辐射剂量25-40kgy。
80.实施例2
81.本实施例提供了一种脱细胞真皮的制备方法，包括如下步骤：
82.(1)将原料皮置于甘油浓度为体积百分比10％-50％的甘油溶液(所用的溶剂为乙醇浓度为体积百分比0.2％-10％)充分反应，在本实施例中选择甘油体积百分比10％的甘油溶液(所用的溶剂为乙醇浓度为体积百分比0.2％的水溶液)，室温浸泡处理6h；
83.(2)将步骤(1)中的原料皮取出置于甘油浓度为体积百分比50％-85％的甘油溶液中，充分反应，在本实施例中选择甘油浓度为体积百分比50％的甘油溶液(所用的溶剂为乙醇浓度为体积百分比50％的水溶液)，室温浸泡处理6h；
84.(3)将步骤(2)中的原料皮取出置于甘油浓度为体积百分比85％-98％的甘油溶液中，充分反应，在本实施例中选择甘油体积百分比85％的甘油溶液(所用的溶剂为乙醇为体积百分比95％的水溶液)，于33℃下浸泡处理10h；每浸泡0.5h超声振荡10min后换液，超声条件：50khz,220w；
85.(4)将步骤(3)中的原料皮取出置于低渗透压溶液中漂洗干净后置于低渗透压溶液中浸泡，所述低渗透压溶液可以是水或低渗盐水(质量分数小于0.9％氯化钠溶液)，充分反应，在本实施例中选择将原料皮取出置于纯化水中漂洗5遍后(每次25khz超声处理5分钟)置于纯化水中，室温浸泡12h；
86.(5)表面活性剂处理：将步骤(4)中的原料皮取出置于表面活性剂溶液中浸泡处理，在本实施例中选择体积百分比为0.2％tritonx-100室温摇床振荡浸泡1h，每浸泡30分钟换液一次，振荡转速80rpm；
87.(6)dna水解酶处理：将步骤(5)中的原料皮取出用纯化水漂洗5遍后于浓度为5g/l，ph为7.0的dna水解酶(dnase)中，30℃反应7h；
88.(7)氨基酸溶液处理：将步骤(6)中的原料皮取出用纯化水漂洗后置于氨基酸溶液中浸泡处理，在本实施例中选择浓度为质量百分比0.5％谷氨酸溶液，室温浸泡2h；
89.(8)pbs缓冲液处理：将步骤(7)中的原料皮取出用纯化水漂洗5次(每次25khz超声处理2分钟)后置于pbs缓冲液(ph7.2-7.4)中室温浸泡2h；
90.(9)包装和灭菌：生理盐水漂洗两遍并装袋封口保存，然后将包装好的产品经钴-60或电子束辐射灭菌，灭菌辐射剂量25-40kgy。
91.实施例3
92.本实施例提供了一种脱细胞真皮的制备方法，包括如下步骤：
93.(1)将原料皮置于甘油浓度为体积百分比10％-50％的甘油溶液(所用的溶剂为乙
醇浓度为0.2％-10％)充分反应，在本实施例中选择甘油体积百分比50％的甘油溶液(所用的溶剂为乙醇浓度为10％水溶液)，室温浸泡处理10h；
94.(2)将步骤(1)中的原料皮取出置于甘油浓度为体积百分比50％-85％的甘油溶液中，充分反应，在本实施例中选择甘油体积百分比75％甘油溶液(所用的溶剂为乙醇浓度为体积百分比85％水溶液)，室温浸泡处理8h；
95.(3)将步骤(2)中的原料皮取出置于浓度为85％-98％的甘油溶液中，充分反应，在本实施例中选择甘油溶液(所用的溶剂为体积百分比为97％乙醇水溶液，甘油浓度为体积百分比85％)，于37℃下浸泡处理3h；每浸泡1h超声振荡20min后换液，超声条件：50khz,220w；
96.(4)将步骤(3)中的原料皮取出置于低渗透压溶液中漂洗干净后置于低渗透压溶液中浸泡，所述低渗透压溶液可以是水或低渗盐水(质量分数小于0.9％氯化钠溶液)，充分反应，在本实施例中选择将原料皮取出置于纯化水中漂洗5遍(每次25khz超声处理5分钟)后置于质量分数为0.7％的氯化钠溶液中，室温浸泡10h；
97.(5)将步骤(4)中原料皮取出置于浓度为体积百分比85％-98％的甘油溶液(所用的溶剂为生理盐水)中，充分反应，在本实施例中选择甘油浓度为体积百分比90％的甘油溶液(所用的溶剂为生理盐水)，37℃下处理10h；每浸泡1.5h超声振荡30min后换液，超声条件：20khz,220w；
98.(6)将步骤(5)中的原料皮取出置于浓度为甘油体积百分比50％-85％的甘油溶液(所用的溶剂为生理盐水)中，充分反应，在本实施例中选择甘油浓度为体积百分比78％的甘油溶液(所用的溶剂为生理盐水)，室温处理8h；
99.(7)将步骤(6)中的原料皮置于甘油浓度为体积百分比10％-50％的甘油溶液中，充分反应，在本实施例中选择甘油浓度为体积百分比50％的甘油生理盐水溶液，室温浸泡8h；
100.(8)将步骤(7)中的原料皮取出置于低渗透压溶液中漂洗干净后置于生理盐水中浸泡，所述低渗透压溶液可以是水或低渗盐水(浓度为质量分数小于0.9％的氯化钠溶液)，在本实施例中选择将原料皮取出置于0.7％氯化钠水溶液中漂洗5遍(每次25khz超声处理5分钟)后置于生理盐水中，室温浸泡10h；
101.(9)表面活性剂处理：将步骤(8)中的原料皮取出置于表面活性剂溶液中浸泡处理，在本实施例中选择含体积百分比0.5％tritonx-100和质量分数为0.4％sds的混合溶液，室温摇床振荡浸泡1h，振荡转速90rpm，每浸泡20分钟换液一次；
102.(10)dna水解酶处理：将步骤(9)中的原料皮取出用纯化水漂洗5遍后于浓度为6g/l，ph为7.0的dna水解酶(dnase)中，30℃，反应3h；
103.(11)氨基酸溶液处理：将步骤(10)中的原料皮取出用纯化水漂洗后置于氨基酸溶液中浸泡处理，在本实施例中选择浓度为含质量百分比0.5％甘氨酸和质量百分比0.5％丙氨酸的混合溶液，室温浸泡2h；
104.(12)pbs缓冲液处理：将步骤(11)中的原料皮取出用纯化水漂洗5次(每次25khz超声处理2分钟)后置于pbs缓冲液(ph7.2-7.4)中室温浸泡2h；
105.(13)包装和灭菌：生理盐水漂洗两遍并装袋封口保存，然后将包装好的产品经钴-60或电子束辐射灭菌，灭菌辐射剂量25-40kgy。
106.实施例4
107.(1)将原料皮取出置于浓度为体积百分比85％-98％的甘油水溶液中，充分反应，在本实施例中选择甘油水溶液(甘油体积百分比98％)，于35℃下浸泡处理12h，每浸泡1h超声振荡20min后更换为上述新的甘油水溶液，超声条件：50khz,220w；
108.(2)将步骤(1)中的原料皮取出置于低渗透压溶液中漂洗5遍后置于低渗透压溶液中浸泡，所述低渗透压溶液可以是水或低渗盐水(浓度为质量分数小于0.9％的氯化钠溶液)，充分反应，在本实施例中选择将原料皮取出置于纯化水中漂洗5遍(每次25khz超声处理5分钟)后置于纯化水中，室温浸泡7h；
109.(3)将步骤(2)中的原料皮取出置于浓度为体积百分比50％-85％的甘油水溶液中，充分反应，在本实施例中选择甘油水溶液(甘油体积百分比85％)，室温浸泡处理4h；
110.(4)将步骤(3)中的原料皮取出置于低渗透压溶液中漂洗5遍后置于低渗透压溶液中浸泡，所述低渗透压溶液可以是水或低渗盐水(浓度为质量分数小于0.9％的氯化钠溶液)，充分反应，在本实施例中选择将原料皮取出置于纯化水中漂洗5遍(每次25khz超声处理5分钟)后置于纯化水中，室温浸泡7h；
111.(5)步骤(4)中的原料皮置于甘油浓度为体积百分比10％-50％的甘油水溶液充分反应，在本实施例中选择甘油水溶液(甘油体积百分比30％)，室温浸泡处理3h；
112.(6)将步骤(5)中的原料皮取出置于浓度为体积百分比85％-98％的甘油水溶液中，充分反应，在本实施例中选择甘油水溶液(甘油体积百分比98％)，于35℃下浸泡处理12h，每浸泡1h超声振荡20min后更换为上述新的甘油水溶液，超声条件：50khz,220w；
113.(7)将步骤(6)中的原料皮取出置于低渗透压溶液中漂洗5遍后置于低渗透压溶液中浸泡，所述低渗透压溶液可以是水或低渗盐水(浓度为质量分数小于0.9％的氯化钠溶液)，充分反应，在本实施例中选择将原料皮取出置于纯化水中漂洗5遍(每次25khz超声处理5分钟)后置于纯化水中，室温浸泡7h；
114.(8)将步骤(7)中的原料皮取出置于低渗透压溶液中漂洗干净后置于生理盐水中浸泡，所述低渗透压溶液可以是水或低渗盐水(浓度为质量分数小于0.9％的氯化钠溶液)，在本实施例中选择将原料皮取出置于纯化水中漂洗5遍后置于生理盐水中，室温浸泡12h；
115.(9)表面活性剂处理：将步骤(8)中的原料皮取出置于表面活性剂中浸泡处理，在本实施例中选择体积百分比0.5％tritonx-100溶液室温振荡2h，振荡转速为100rpm，每浸泡10分钟换液一次；
116.(10)dna水解酶处理：将步骤(9)中的原料皮取出用纯化水漂洗5遍后于浓度为6g/l，ph为7.0的dna水解酶(dnase)中，30℃下反应5h；
117.(11)氨基酸溶液处理：将步骤(10)中的原料皮取出用纯化水漂洗后置于氨基酸溶液中浸泡处理，在本实施例中选择浓度为质量百分比0.5％谷氨酸溶液，室温浸泡2h；
118.(12)pbs缓冲液处理：将步骤(11)中的原料皮取出用纯化水漂洗5次(每次25khz超声处理2分钟)后置于pbs缓冲液(ph7.2-7.4)中室温浸泡2h；
119.(13)包装和灭菌：生理盐水漂洗两遍并装袋封口保存，然后将包装好的产品经钴-60或电子束辐射灭菌，灭菌辐射剂量25-40kgy。
120.实施例5
121.(1)将原料皮取出置于体积百分比浓度为85％-98％的甘油溶液中，充分反应，在
本实施例中选择甘油溶液(所用的溶剂为体积百分比为97％乙醇水溶液，甘油浓度为体积百分比85％)，于37℃下浸泡处理3h；每浸泡1h超声振荡20min后换液，超声条件：50khz,220w；
122.(2)将步骤(1)中的原料皮取出置于甘油浓度为体积百分比50％-85％的甘油溶液中，充分反应，在本实施例中选择甘油体积百分比75％甘油溶液(所用的溶剂为乙醇浓度为体积百分比85％水溶液)，室温浸泡处理8h；
123.(3)将步骤(2)中的原料皮置于甘油浓度为体积百分比10％-50％的甘油溶液(所用的溶剂为乙醇浓度为体积百分比0.2％-10％的水溶液)充分反应，在本实施例中选择甘油体积百分比50％的甘油溶液(所用的溶剂为乙醇浓度为体积百分比10％的水溶液)，室温浸泡处理10h；
124.(4)将步骤(3)中的原料皮取出置于浓度为85％-98％的甘油溶液中，充分反应，在本实施例中选择甘油溶液(所用的溶剂为体积百分比为97％乙醇水溶液，甘油浓度为体积百分比85％)，于37℃下浸泡处理3h；每浸泡1h超声振荡20min后换液，超声条件：50khz,220w；
125.(5)将步骤(4)中的原料皮取出置于低渗透压溶液中漂洗干净后置于低渗透压溶液中浸泡，所述低渗透压溶液可以是水或低渗盐水(质量分数小于0.9％氯化钠溶液)，充分反应，在本实施例中选择将原料皮取出置于纯化水中漂洗5遍(每次25khz超声处理5分钟)后置于质量分数为0.7％的氯化钠溶液中，室温浸泡10h；
126.(6)将步骤(5)中原料皮取出置于浓度为体积百分比85％-98％的甘油溶液(所用的溶剂为生理盐水)中，充分反应，在本实施例中选择甘油浓度为体积百分比90％的甘油溶液(所用的溶剂为生理盐水)，37℃下处理10h；每浸泡1.5h超声振荡30min后换液，超声条件：20khz,220w；
127.(7)将步骤(6)中的原料皮取出置于浓度为甘油体积百分比50％-85％的甘油溶液(所用的溶剂为生理盐水)中，充分反应，在本实施例中选择甘油浓度为体积百分比78％的甘油溶液(所用的溶剂为生理盐水)，室温处理8h；
128.(8)将步骤(7)中的原料皮置于甘油浓度为体积百分比10％-50％的甘油溶液(所用的溶剂为生理盐水)中，充分反应，在本实施例中选择甘油浓度为体积百分比50％的甘油溶液(所用的溶剂为生理盐水)，室温浸泡8h；
129.(9)将步骤(8)中的原料皮取出置于低渗透压溶液中漂洗干净后置于生理盐水中浸泡，所述低渗透压溶液可以是水或低渗盐水(浓度为质量分数小于0.9％的氯化钠溶液)，在本实施例中选择将原料皮取出置于0.2％氯化钠水溶液中漂洗5遍(每次25khz超声处理5分钟)后置于生理盐水中，室温浸泡10h；
130.(10)表面活性剂处理：将步骤(9)中的原料皮取出置于表面活性剂溶液中浸泡处理，在本实施例中选择含体积百分比0.5％tritonx-100和质量分数为0.4％sds的混合溶液，室温摇床振荡浸泡1h，振荡转速90rpm，每浸泡20分钟换液一次；
131.(11)dna水解酶处理：将步骤(10)中的原料皮取出用纯化水漂洗5遍后于浓度为6g/l，ph为7.0的dna水解酶(dnase)中，30℃，反应3h；
132.(12)氨基酸溶液处理：将步骤(11)中的原料皮取出用纯化水漂洗后置于氨基酸溶液中浸泡处理，在本实施例中选择浓度为含质量百分比0.5％甘氨酸和质量百分比0.5％丙
氨酸的混合溶液，室温浸泡2h；
133.(13)pbs缓冲液处理：将步骤(12)中的原料皮取出用纯化水漂洗5次(每次25khz超声处理2分钟)后置于pbs缓冲液(ph7.2-7.4)中室温浸泡2h；
134.(14)包装和灭菌：生理盐水漂洗两遍并装袋封口保存，然后将包装好的产品经钴-60或电子束辐射灭菌，灭菌辐射剂量25-40kgy。
135.实施例6
136.(1)将原料皮置于甘油浓度为体积百分比10％-50％的甘油溶液(所用的溶剂为乙醇浓度为体积百分比0.2％-10％水溶液)充分反应，在本实施例中选择甘油体积百分比10％的甘油溶液(所用的溶剂为乙醇浓度为体积百分比0.2％水溶液)，室温浸泡处理6h；
137.(2)将步骤(1)中的原料皮取出置于低渗透压溶液中漂洗5遍后置于低渗透压溶液中浸泡，所述低渗透压溶液可以是水或低渗盐水(浓度为质量分数小于0.9％的氯化钠溶液)，充分反应，在本实施例中选择将原料皮取出置于纯化水中漂洗5遍(每次25khz超声处理5分钟)后置于纯化水中，室温浸泡7h；
138.(3)将步骤(2)中的原料皮取出置于甘油浓度为体积百分比50％-85％的甘油溶液中，充分反应，在本实施例中选择甘油浓度为体积百分比50％的甘油溶液(所用的溶剂为乙醇浓度为体积百分比50％水溶液)，室温浸泡处理6h；
139.(4)将步骤(3)中的原料皮取出置于低渗透压溶液中漂洗5遍后置于低渗透压溶液中浸泡，所述低渗透压溶液可以是水或低渗盐水(浓度为质量分数小于0.9％的氯化钠溶液)，充分反应，在本实施例中选择将原料皮取出置于纯化水中漂洗5遍(每次25khz超声处理5分钟)后置于纯化水中，室温浸泡7h；
140.(5)将步骤(4)中的原料皮取出置于甘油浓度为体积百分比85％-98％的甘油溶液中，充分反应，在本实施例中选择甘油体积百分比85％的甘油溶液(所用的溶剂为体积百分比95％的乙醇水溶液)，于33℃下浸泡处理10h；每浸泡0.5h超声振荡10min后换液，超声条件：50khz,220w；
141.(6)将步骤(5)中的原料皮取出置于低渗透压溶液中漂洗干净后置于低渗透压溶液中浸泡，所述低渗透压溶液可以是水或低渗盐水(质量分数小于0.9％氯化钠溶液)，充分反应，在本实施例中选择将原料皮取出置于纯化水中漂洗5遍后(每次25khz超声处理5分钟)置于纯化水中，室温浸泡12h；
142.(7)表面活性剂处理：将步骤(6)中的原料皮取出置于表面活性剂溶液中浸泡处理，在本实施例中选择体积百分比为0.2％tritonx-100室温摇床振荡浸泡1h，每浸泡30分钟换液一次，振荡转速80rpm；
143.(8)dna水解酶处理：将步骤(7)中的原料皮取出用纯化水漂洗5遍后于浓度为5g/l，ph为7.0的dna水解酶(dnase)中，30℃反应7h；
144.(9)氨基酸溶液处理：将步骤(8)中的原料皮取出用纯化水漂洗后置于氨基酸溶液中浸泡处理，在本实施例中选择浓度为质量百分比0.5％谷氨酸溶液，室温浸泡2h；
145.(10)pbs缓冲液处理：将步骤(9)中的原料皮取出用纯化水漂洗5次(每次25khz超声处理2分钟)后置于pbs缓冲液(ph7.2-7.4)中室温浸泡2h；
146.(11)包装和灭菌：生理盐水漂洗两遍并装袋封口保存，然后将包装好的产品经钴-60或电子束辐射灭菌，灭菌辐射剂量25-40kgy。
147.对比例1
148.本对比例提供了一种脱细胞真皮的制备方法，包括如下步骤：
149.(1)将原料皮置于碱的甘油溶液(碱为氢氧化钠，浓度为质量百分比0.5％，将氢氧化钠溶解于甘油(市售纯度为95％的甘油)中配制成氢氧化钠浓度为质量百分比0.5％的甘油溶液)中，室温浸泡处理1h；
150.(2)表面活性剂处理：将步骤(1)中的原料皮取出用纯化水漂洗干净后置于表面活性剂中浸泡处理，在本实施例中选择体积百分比0.5％tritonx-100溶液室温振荡2h，振荡转速为100rpm，每浸泡10分钟换液一次；
151.(3)dna水解酶处理：将步骤(2)中的原料皮取出用纯化水漂洗5遍后于浓度为6g/l，ph为7.0的dna水解酶(dnase)中，30℃下反应5h；
152.(4)氨基酸溶液处理：将步骤(3)中的原料皮取出用纯化水漂洗后置于氨基酸溶液中浸泡处理，在本实施例中选择浓度为质量百分比0.5％谷氨酸溶液，室温浸泡2h；
153.(5)pbs缓冲液处理：将步骤(4)中的原料皮取出用纯化水漂洗5次(每次25khz超声处理2分钟)后置于pbs缓冲液中室温浸泡2h；
154.(6)包装和灭菌：生理盐水漂洗两遍并装袋封口保存，然后将包装好的产品经钴-60或电子束辐射灭菌，灭菌辐射剂量25-40kgy。
155.对比例2
156.本对比例与对比例1基本相似，其区别仅在于步骤(1)中，将原料皮置于纯度为95％的甘油中，室温浸泡处理1h。
157.效果例1
158.将实施例1、实施例2、对比例1、对比例2中获得的脱细胞真皮进行如下性能指标的检测。
159.(1)细胞、表皮残留：
160.检测方法：he染色，显微镜下观察
161.结果如图1-5所示，由图1中可看到，实施例1的脱细胞真皮中无细胞残留，外观及切片观察可见表皮全部脱除，且完整保留了胶原结构和基底膜结构(图1和图5)，从图5中可以看到完整保留了细胞外基质的多孔性结构，且排列有序。由图2中可以看到，实施例2的脱细胞真皮中无细胞残留，外观及切片观察可见表皮全部脱除，且完整保留了胶原结构和基底膜结构。由图3中可以看到，对比例1的脱细胞真皮中无细胞残留，外观及切片观察可见表皮全部脱除，但胶原结构松散，基底膜结构已破坏。由图4中可以看到，对比例2的脱细胞真皮中未达到获取脱细胞真皮的目的，表皮仍存在无脱落迹象，皮肤褶缩质地较硬，有大量细胞残留。
162.(2)dna残留：
163.检测方法：按照yy/t 0606.25-2014《动物源性生物材料dna残留量测定法：荧光染色法》中规定的检测方法进行检测。
164.检测结果见下表1：
165.表1 dna残留
[0166] 实施例1实施例2对比例1对比例2dna残留0.2ng/mg0.3ng/mg0.7ng/mg78ng/mg
[0167]
效果例2
[0168]
将实施例1中获得的脱细胞真皮进行如下性能指标考察。
[0169]
(1)去除灭活病毒效果
[0170]
检测方法：按照同种异体植入性医疗器械病毒灭活工艺验证技术审查指导原则方法进行去病毒效果验证。
[0171]
检测结果：实施例1的脱细胞真皮的工艺可以达到灭活病毒的效果，病毒降低指数达到可接受水平。本实验例仅以实施例1步骤(2)处理后的真皮进行一种病毒(本实验例中的指示病毒为人类细小病毒b19)的病毒灭活指数检测为例，检测结果如图6。
[0172]
(2)免疫原性
[0173]
检测方法：取实施例1处理前的原料皮和经过实施例1处理后的脱细胞真皮，分别进行mhc(组织兼容性复合体)抗原染色，光学显微镜检查；
[0174]
检测结果：如图7所示，左侧图为实施例1中未处理的原料皮mhc抗原染色结果为阳性，右侧图为实施例1处理后获得的脱细胞真皮的mhc抗原染色处理结果为阴性，由图中可以看到经过实施例1处理的脱细胞真皮无免疫原性。
[0175]
(3)组织修复效果
[0176]
检测方法：将正常皮肤和植入实施例1的脱细胞真皮组织修复后的部位取下进行he染色观察。
[0177]
检测结果如图8-9所示，图8为正常皮肤的表皮乳突组织切片图，图9为实施例1的脱细胞真皮修补部位后的表皮乳突组织切片图，由图中比较可知，实施例1的脱细胞真皮修补部位与正常皮肤的表皮乳突组织结构相同，因此表明实施例1的脱细胞真皮具有良好的组织修复效果。
[0178]
(4)力学性能
[0179]
检测方法：按照gbt 1040.3-2006塑料拉伸性能的测定第3部分：薄膜和薄片的试验条件检测脱细胞真皮产品的拉伸强度，按照yy 0500-2004心血管植入物人工血管中的牵拉强度检测方法检测脱细胞真皮产品的缝合强度，检测结果如下表2。
[0180]
表2力学性能
[0181][0182]
(5)经辐照后检测无菌。
[0183]
(6)生物相容性
[0184]
检测方法：实施例1-实施例6的处理后的脱细胞真皮按照16886系列标准进行检测。
[0185]
检测结果如下：
[0186]
1、体外细胞毒：按照本产品要求的浸提比例，供试品细胞的生存率为96％。
[0187]
2、皮肤致敏：该样品未引起致敏反应。
[0188]
3、皮内反应：没有导致动物产生刺激的任何征象。
[0189]
4、急性全身毒性：无急性全身毒性。
[0190]
5、热原试验：无致热反应。
[0191]
6、亚慢性毒性：样品未见临床意义的异常指标或毒性靶器官。
[0192]
7、遗传毒性：结果均为阴性，无遗传毒性。
[0193]
8、植入：与对照品(已上市产品)无差异。
[0194]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。