靶向激活LRP6的工具在制备防治阿尔兹海默症药物中的应用

靶向激活lrp6的工具在制备防治阿尔兹海默症药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域。具体涉及基于靶向激活lrp6而修复维护血脑屏障功能的工具在防治阿尔兹海默症中的应用，更具体地，涉及光遗传学工具optolrp6在防治阿尔兹海默症中的应用。


背景技术：

2.阿尔兹海默症(alzheimer’s disease,ad)是一种神经退行性疾病，目前我国乃至全世界ad的发病率呈极快的趋势增长，已成为严重的社会问题。但迄今为止，ad仍缺少有效的预防和治疗手段，亟需寻找新的治疗策略。由于ad并无有效的预防手段，并且ad早期疾病进程缓慢导致诊断较难，药物干预通常较晚，因此目前针对ad的临床试验药物，主要为靶向确诊ad病人脑部β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein，aβ)斑块的清除，虽可以减少脑中aβ斑块沉积，但无法进一步恢复ad病理中脑组织微环境的破坏，对病人的神经元损伤与认知功能改善的作用有限。因此，如何早期干预预防及重塑ad病程中的大脑微环境稳态就成为了目前的研究难点。
3.血脑屏障(blood-brain barriers,bbb)是脑毛细血管壁与神经细胞之间的一层物理屏障，由脑内皮细胞(brain endothelia cell,bec)、周细胞以及星形胶质细胞足突构成。血脑屏障的正常对维持大脑微环境稳态有重要支持作用。现有研究多将血脑屏障功能异常作为ad的病理损伤表型。而最新的研究表明在大脑aβ斑块沉积前，大脑微环境中溶解性aβ寡聚体的水平升高，可作用于脑内皮细胞，导致血脑屏障功能异常，从而大脑微环境失衡，继而引发神经元功能障碍，说明血脑屏障的功能异常不仅是早期ad的重要病理特征，也是ad病程进展的重要因素。因此研究ad中血脑屏障功能改变的调控机制对ad的预防及临床治疗是非常有意义的。
4.现有药物多为直接作用于aβ寡聚体，比如中国专利公开的硫酸乙酰肝素在防治阿尔兹海默症中的应用，硫酸乙酰肝素能够抑制aβ1
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42对神经细胞带来的损伤，能够改变减少寡聚体的状态，将寡聚体转变为毒性较弱的纤维体，能够发挥改善小鼠认知损伤的作用。未有从修复维持血脑屏障、重塑ad病程中的大脑微环境稳态方面特异性精准调控的治疗手段来预防与治疗阿尔兹海默症。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种能够修复血脑屏障损伤及维护血脑屏障功能，实现重塑ad病程中的大脑微环境稳态，从而缓解aβ寡聚体导致的脑内皮细胞功能损坏，可应用于制备阿尔兹海默症早期干预预防药物的技术。
6.具体地，本发明提供靶向激活lrp6的工具在制备防治阿尔兹海默症药物中的应用。
7.本发明为了实现上述目的，采用以下技术方案：
8.本发明目的是提供靶向激活lrp6的工具在制备预防和/或治疗阿尔兹海默症的药
物中的应用。
9.本发明又一目的是提供靶向激活lrp6的工具在制备修复血脑屏障损伤及维护血脑屏障功能的药物中的应用。
10.本发明再一目的是提供靶向激活lrp6的工具在制备缓解aβ寡聚体导致的脑内皮细胞功能损坏的药物中的应用。
11.进一步地，所述靶向激活lrp6的工具为光遗传学工具optolrp6。
12.本光遗传学工具optolrp6在蓝光刺激下，特异性地将lrp6招募到细胞膜上，可逆转溶解性aβ寡聚体导致的紧密连接蛋白表达下调，改善血脑屏障的功能，延缓阿尔兹海默症进程。
13.进一步的，作为一种可选择的实施方案，所述光遗传学工具optolrp6的制备方法如下：
14.s1.构建表达lrp6蛋白的光敏控制质粒；
15.s2.利用慢病毒制备系统，将步骤s1中质粒转染至人源细胞系中；
16.s3.收集步骤s2中转染后包含人源细胞系中的培养基，去除杂质，得到光遗传学工具optolrp6。
17.更进一步的，步骤s2中所述转染，转染后4-12小时(优选8小时)更换一次培养人源细胞系的培养基。
18.更进一步的，步骤s2中所述人源细胞系为hek293t细胞系。
19.更进一步的，步骤s3中所述收集步骤s2中转染后包含人源细胞系的培养基后，再使用0.22μm过滤器对所述培养基进行过滤。
20.步骤s3中所述去除杂质是使用0.22μm过滤器进行过滤。使用孔径的过滤器的原因是将细胞、细胞器碎片截留下来，使得滤液仅允许光遗传学工具optolrp6质粒及以下大小的物质通过。
21.更进一步的，步骤s2中所述慢病毒制备系统为第三代慢病毒制备系统。
22.更进一步的，步骤s3中所述收集为转染后1-3天(优选48小时)开始收集。
23.本发明的有益效果为：
24.本发明研究显示，利用光遗传学工具optolrp6靶向lrp6，可修复血脑屏障损伤及维护血脑屏障功能，实现重塑ad病程中的大脑微环境稳态，从而缓解aβ寡聚体导致的脑内皮细胞功能损坏，可应用于制备阿尔兹海默症治疗和早期干预预防和治疗药物。而且该药物结合光学及遗传学可对细胞或组织进行特异性精准调控，应用价值和前景好。
附图说明
25.图1为optolrp6质粒结构图。
26.图2为体外脑内皮细胞损伤模型构建图；图中cldn5为血脑屏障的功能指标、ki67为血脑屏障的细胞增殖指标、tunel为血脑屏障的细胞凋亡指标。
27.图3为光遗传学工具optolrp6治疗aβ寡聚体处理导致的体外血脑屏障损伤图；图中a表示光遗传学工具optolrp6工作示意图；图中b表示治疗血脑屏障损伤各组血脑屏障功能蛋白指标cldn5、zo1、glut1蛋白的免疫染色及统计；c表示治疗血脑屏障损伤各组血脑屏障功能蛋白指标cldn5、zo1、glut1蛋白的表达水平及统计；d表示治疗血脑屏障损伤各组血
脑屏障功能蛋白cldn5 mrna表达水平；图中标注δcry为不含lrp6的对照质粒组，lrp6为光遗传转染后目标质粒组，aβ指在细胞中加入20μm aβ寡聚体进行处理，图中上标
“‑”
指未对该组进行相应处理，图中上标“ ”指对该组进行相应处理。
28.图4为光遗传学工具optolrp6预防aβ寡聚体处理导致的体外血脑屏障损伤图；图中a表示光遗传学工具optolrp6工作示意图；图中b表示预防血脑屏障损伤各组血脑屏障功能蛋白指标cldn5、zo1、glut1蛋白的免疫染色及统计；c表示预防血脑屏障损伤各组血脑屏障功能蛋白指标cldn5、zo1、glut1蛋白的表达水平及统计；d表示预防血脑屏障损伤各组血脑屏障功能蛋白cldn5 mrna表达水平；图中标注δcry为不含lrp6的对照质粒组，lrp6为光遗传转染后目标质粒组，aβ指在细胞中加入20μm aβ寡聚体进行处理，图中上标
“‑”
指未对该组进行相应处理，图中上标“ ”指对该组进行相应处理。
具体实施方式
29.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
30.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
31.实施例1光遗传学工具optolrp6制备
32.制备步骤：
33.s1.构建表达lrp6蛋白的光敏控制质粒，即optolrp6质粒(由addgene组织提供，其结构如图1所示，所用骨架质粒为pcs2 )；
34.s2.利用第三代慢病毒制备系统，将步骤s1中质粒转染至hek293t细胞系中，转染后每隔8小时更换一次培养hek293t细胞系的培养基；
35.s3.收集步骤s2中转染48小时后hek293t细胞系的培养基，并使用0.22μm过滤器进行过滤，所得滤液即为optolrp6的质粒。
36.实施例2体外脑内皮细胞血脑屏障损伤模型
37.1、实验目的：
38.制备体外脑内皮细胞血脑屏障损伤模型以测试光遗传学工具
39.2、实验方法：
40.取10天龄大鼠乳鼠，麻醉后取出脑组织，并在冰上取出小脑、小脑、脑干和白质，得到剩余的皮质；将剩余的皮质在10ml和1mldmem中匀浆，dmem含有1mg/ml胶原酶和0.1mg/ml dnase i，并在37℃下以250rpm的速度摇动1小时，然后在室温下以1000g离心8分钟；将离心所得沉淀悬浮在25ml含20％bsa的dmem中，室温下1000g离心20分钟，得到微血管沉淀。进一步将微血管沉淀在5ml含有0.5ml 1mg/ml胶原酶-分散酶和0.1mg/ml dnase i的dmem中进一步匀浆，并在37℃下以250转/分钟的速度摇动30分钟，得到沉淀物，然后将沉淀物悬浮在bec培养基中，并接种于胶原蛋白包被的细胞培养皿中。将aβ肽在dmso中重组并冻干过夜以防止肽的聚集。冻干后的aβ被储存在-80℃温度下。实验时将aβ重新悬浮在细胞培养基中至所需的浓度，并在每次实验前于37℃孵育以形成寡聚体。使用不同浓度的aβ寡聚体黑暗条件下处理bec 24小时，处理浓度分别为：0μm、0.1μm、1μm、10μm、20μm、30μm，处理后通过观察分析各浓度处理后的血脑屏障的功能指标cldn5、血脑屏障的细胞增殖指标ki67和血脑屏
障的细胞凋亡指标tunel的蛋白免疫荧光强度和水平。
41.3、实验结果：
42.如图2所示，可以看出使用20μm、30μm aβ处理的bec功能蛋白cldn5表达水平显著下降而增殖及凋亡蛋白ki67/tunel并无明显变化，表明使用20μm、30μm aβ处理均可以成功建立体外血脑屏障损伤模型，以下实施例3-4中方法采用本方法构建体外脑内皮细胞血脑屏障损伤模型，其中aβ含量为20μm。
43.实施例3光遗传学工具lrp6治疗aβ寡聚体处理导致的体外血脑屏障损伤
44.1、实验目的：
45.验证光遗传学工具optolrp6对aβ寡聚体处理导致的体外血脑屏障损伤的治疗作用。
46.2、实验方法：
47.按实施例2中的原代bec提取方法提取原代bec，并使用实施例2中的血脑屏障损伤模型构建方法使用20μm aβ处理bec细胞建立体外血脑屏障损伤模型，然后对造模细胞进行蓝光处理，具体为蓝光(波长450nm)循环处理进行，即开启蓝光20分钟，后关闭蓝光40分钟的循环处理共8小时，结束后收取细胞样本提取rna、蛋白样本进行相关指标及血脑屏障功能蛋白相关指标检测。
48.具体实验步骤如下：
49.将原代bec分成4组，分别为对照组1和实验组1-3。
50.对照组对原代bec仅含有δcry(不含lrp6的对照质粒组)质粒处理，处理过程保证bec在黑暗条件下；
51.实验组1先对原代bec进行光遗传学optolrp6(实施例1得到的光遗传学工具optolrp6)质粒组处理，然后对处理后的原代bec按照实施例2方法构建体外脑内皮细胞血脑屏障损伤模型，整个过程在无蓝光条件下完成；
52.实验组2对原代bec进行仅含有δcry(不含lrp6的对照质粒组)质粒处理，后按照实施例2方法(aβ20μm)构建体外脑内皮细胞血脑屏障损伤模型，然后对模型进行蓝光处理(蓝光波长为450nm)；
53.实验组3对原代bec进行光遗传学optolrp6(实施例1得到的光遗传学工具optolrp6)质粒组处理，然后按照实施例2方法构建体外脑内皮细胞血脑屏障损伤模型，再对损伤模型进行蓝光处理(蓝光波长为450nm)。
54.其中上述实验组2和3中蓝光处理为在波长为450nm的蓝光条件下对细胞进行开启蓝光20分钟，后关闭蓝光40分钟的循环处理共8小时。各实验组总时间保持一致，即无蓝光处理的要在黑暗条件下处理相同时间，无构建aβ模型损伤的需要在黑暗条件处理相同时间，步骤参照图3a。处理结束后，收取细胞样本提取rna、测定血脑屏障功能蛋白cldn5、zo-1、glut1免疫荧光强度和水平及rna表达情况。
55.3、实验结果：
56.如图3b所示，血脑屏障损伤模型经过蓝光光照处理后光遗传学工具optolrp6组(实验组3)的血脑屏障功能蛋白cldn5、zo-1、glut1的荧光强度显著高于其他组，表明optolrp6处理对血脑屏障功能蛋白表达的提升；如图3c所示，蛋白印迹结果显示血脑屏障功能蛋白cldn5及glut1的蛋白表达水平和上述一致；如图3d所示，经过蓝光光照处理后光
遗传学工具optolrp6组(实验组3)蛋白cldn5的mrna表达水平相对其他组明显提升；因此上述结果表明：通过靶向lrp6途径，可以提升aβ诱导的ad功能蛋白的表达，对挽救aβ诱导的ad的血脑屏障功能障碍具有潜在的治疗价值。
57.实施例4光遗传学工具lrp6预防aβ寡聚体处理导致的体外血脑屏障损伤
58.1、实验目的：
59.验证光遗传学工具optolrp6对aβ寡聚体处理导致的体外血脑屏障损伤的预防作用。
60.2、实验方法：
61.按实施例2中的原代bec提取方法提取原代bec并按实施例3中蓝光处理方法对细胞进行蓝光处理后，按实施例2中的血脑屏障损伤模型模型构建方法并使用20μm aβ处理bec细胞建立体外血脑屏障损伤模型，结束后收取细胞样本提取蛋白样本进行血脑屏障功能蛋白cldn5、zo-1、glut1及其表达mrna相关指标检测，实施例2与实施例3中方法区别为实验组蓝光处理与体外血脑屏障损伤模型的顺序不同。
62.具体实验步骤如下：
63.将原代bec分成4组，分别为对照组1和实验组1-3。
64.对照组对原代bec仅含有δcry(不含lrp6的对照质粒组)质粒处理，整个过程在无蓝光条件下完成；
65.实验组1先对原代bec进行光遗传学optolrp6(实施例1得到的光遗传学工具optolrp6)质粒组处理，然后对处理后的原代bec按照实施例2方法构建体外脑内皮细胞血脑屏障损伤模型，整个过程在无蓝光条件下完成；
66.实验组2对原代bec进行仅含有δcry(不含lrp6的对照质粒组)质粒处理，然后进行蓝光处理，处理完成后按照实施例2方法(20μm aβ)构建体外脑内皮细胞血脑屏障损伤模型；
67.实验组3对原代bec进行光遗传学optolrp6(实施例1得到的光遗传学工具optolrp6)质粒组处理，然后进行蓝光处理(蓝光波长为450nm)，处理完成后按照实施例2方法构建体外脑内皮细胞血脑屏障损伤模型。
68.其中上述实验组2和3中蓝光处理为在波长为450nm的蓝光条件下对细胞进行，即开启蓝光20分钟，后关闭蓝光40分钟的循环处理共8小时。各实验组总时间保持一致，即无蓝光处理的要在黑暗条件下处理相同时间，无构建aβ模型损伤的需要在黑暗条件处理相同时间，步骤参照图4a。处理结束后，收取细胞样本提取rna、测定血脑屏障功能蛋白cldn5、zo-1、glut1免疫荧光强度和水平及rna表达情况。
69.3、实验结果：
70.如图4b所示，经过蓝光光照处理后光遗传学工具optolrp6血脑屏障损伤模型组(实验组3)的血脑屏障功能蛋白cldn5、zo-1、glut1的荧光强度显著高于其他组，表明optolrp6预处理对血脑屏障功能蛋白表达的提升；如图4c所示，蛋白印迹结果显示血脑屏障功能蛋白cldn5及glut1的蛋白表达水平如上述一致；如图4d所示，经过蓝光光照预处理后光遗传学工具optolrp6组cldn5mrna表达水平相对其他组明显提升；因此上述结果表明：先optolrp6后aβ寡聚体建模即optolrp6预激活对aβ导致的bec功能障碍有预防作用。
71.综上，在阿尔兹海默症(alzheimer’s disease；ad)病人大脑中，aβ寡聚体刺激下
导致血脑屏障(blood-brain barrier；bbb)功能蛋白表达减少，从而损害血脑屏障功能，促进ad的进展。相反，光遗传学工具optolrp6激活脑内皮细胞，可以促进aβ刺激下所抑制的血脑屏障功能蛋白表达，从而阻止ad病程的进展。
72.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。