一种具有手性选择性的芳氧苯氧丙酸酯类除草剂水解酯酶及其应用

1.本发明属于应用环境微生物领域，涉及一种具有手性选择性的芳氧苯氧丙酸酯类除草剂水解酯酶及其应用。


背景技术：

2.芳氧苯氧丙酸酯(aryloxyphenoxy propinoate,aopp)类除草剂是德国赫斯特公司在20世纪70年代开发出来的一类高活性除草剂。目前，商品化的aopp类除草剂约有20余种，主要用于阔叶作物田以防除一年生和多年生的禾本科杂草。2014年，全球aopp类除草剂的销售额超过121.7亿美元，占全球除草剂市场的4.6％，是继草甘膦后世界上使用最广泛的除草剂类别之一。虽然aopp类除草剂是一类毒性较低，相对安全的除草剂，但其在生态环境中的残留仍然会危害到后茬作物及非靶标生物。此外，aopp类除草剂大多属于手性化合物，拥有不同的手性异构体。然而，手性化合物的不同异构体不但具有不同的生物活性和生态毒理,而且在土壤微生物的作用下手性异构体之间还可以相互转化。因此，aopp类除草剂在环境中的代谢消亡日益引起了人们极大的关注。
3.喹禾灵为典型的aopp类除草剂，拥有一对手性异构体。商品化的喹禾灵是由等摩尔的(r)-构型和(s)-构型混合而成的外消旋体(rac-qe)，其除草活性主要来源于(r)-构型，除草机理是通过抑制乙酰辅酶a羧化酶活性使杂草坏死。现已开发出仅含有单一的(r)-构型的精制品,即精喹禾灵。目前，尽管精喹禾灵的使用量多于喹禾灵，但基于良好的除草性和低成本，喹禾灵在许多领域仍有广泛的应用。随着研究的不断深入，越来越多的报道表明除了直接对土壤环境、水环境和大气环境造成污染外，喹禾灵还表现出一定的生态毒性，包括生殖毒性、遗传毒性和肝脏毒性。因此。喹禾灵从环境中的去除是当前研究的热点。
4.利用微生物修复有机物的污染是一种简单、高效、廉价和无二次污染的方法，比传统的化学和物理修复方法具有更多的优势。微生物在有机污染物残留的生物学解决途径中有着独特的作用。微生物降解有机污染物的本质是微生物产生的酶对污染物的降解作用，从微生物中提取的降解酶来消除有机污染物残留在国外已有成功的先例，降解酶的来源可以通过从降解菌中提取，也可以采用基因工程手段构建高效表达菌株来获得。aopp类除草剂水解酯酶基因aoph在除草剂喹禾灵和禾草灵等污染的修复领域有巨大的应用潜力。同时可通过基因改造扩大酶作用的底物范围，广泛应用于环境中aopp类除草剂的降解和脱毒，保护环境。此外，aopp类除草剂水解酯酶aoph对喹禾灵的不同异构体具有显著的手性选择性。因此，aoph甚至能为实现喹禾灵等aopp类除草剂手性拆分特定酶的改造提供理论指导。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供从aopp类除草剂喹禾灵降解菌株brevundimonas sp.s1中克隆的水解酯酶基因aoph。
6.本发明的另一目的是提供该水解酯酶基因编码的酯酶aoph。
7.本发明的又一目的是提供该水解酯酶基因的应用。
8.本发明的目的可通过以下技术方案实现：
9.一种aopp类除草剂喹禾灵水解酯酶基因aoph，其核苷酸序列为seq id no.1。该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为930bp，g c含量为69.9％，编码309个氨基酸，分子量为33.9kda。
10.本发明所述的aopp类除草剂喹禾灵水解酯酶基因aoph编码的酯酶aoph，其氨基酸序列为seq id no.2。
11.含有本发明所述的aopp类除草剂喹禾灵水解酯酶基因aoph的重组质粒。
12.作为本发明的一种优选方式，水解酯酶基因片段与酶切好的pet-29a( )进行酶连获得含水解酯酶基因的pet-29a( )重组质粒。
13.含本发明所述的重组质粒的重组微生物bl21(de3)。
14.作为本发明的一种优选方式，酶连好的含水解酯酶基因的pet-29a( )重组质粒转化到表达宿主菌e.coli bl21(de3)获得重组微生物e.coli bl21(de3)。
15.本发明所述的水解酯酶基因aoph在去除环境中aopp类除草剂污染方面的应用。
16.本发明所述的水解酯酶去除农作物、土壤和水体中的aopp类除草剂污染方面的应用。
17.其中，所述的aopp类除草剂优选自喹禾灵、精喹禾灵、禾草灵和精恶唑禾草灵。
18.本发明所述的重组微生物bl21(de3)在去除土壤、水体和农产品表面的aopp类除草剂残留方面的应用。
19.其中，所述的aopp类除草剂优选喹禾灵、精喹禾灵、禾草灵和精恶唑禾草灵。
20.有益效果
21.1.本发明从菌株brevundimonas sp.s1(从某废弃农药厂厂区的土壤中分离筛选获得的喹禾灵降解菌株，专利菌种保藏编号为cctcc m 2021604)中克隆出喹禾灵水解酯酶基因aoph。
22.2.将该酯酶基因aoph克隆至高效表达载体pet29a( )(购自novegen公司)获得重组表达质粒pet-aoph，通过转化的方法将重组表达质粒pet-aoph转移至高效表达菌株e.coli bl21(de3)(购自invitrogen公司)，获得重组表达菌株e.coli bl21(pet-aoph)。
23.3.重组表达菌株e.coli bl21(pet-aoph)经过0.5mm的iptg诱导18h后，大量表达携带his
6-tag的酯酶aoph，进一步通过ni
2 -nta resin(novagen)进行亲和层析获得纯的aoph。
24.4.本发明对酯酶基因aoph表达的产物aoph进行酶学降解试验，发现aoph可快速降解喹禾灵、精喹禾灵、禾草灵和精恶唑禾草灵。进一步研究发现，该水解酯酶对喹禾灵不同异构体具有显著的手性选择性，即aoph更倾向于降解(s)-喹禾灵。
25.5.利用酯酶基因aoph构建的工程菌株能高效表达aoph，生产的酶制剂可用于去除土壤、水体和农作物中残留的喹禾灵、精喹禾灵、禾草灵和精恶唑禾草灵。
附图说明
26.图1喹禾灵水解酯酶基因的克隆策略图
27.图2为本发明重组菌株e.coli dh5α(puc-aoph)对喹禾灵、精喹禾灵、禾草灵和精
恶唑禾草灵的降解曲线。
28.图3为本发明重组高效表达菌株e.coli bl21(pet-aoph)的构建流程图
29.图4为本发明水解酯酶基因aoph在表达宿主菌e.coli bl21(de3)中表达并纯化的蛋白sds-page电泳图。
30.图5为本发明水解酯酶aoph降解喹禾灵的代谢产物的液相-质谱检测图。
31.图6为本发明水解酯酶aoph转化喹禾灵的代谢机制。
32.图7为本发明水解酯酶aoph对喹禾灵不同异构体的选择性降解液相检测图及对映体分数(enantiomer fraction，ef)变化。
33.图8为本发明水解酯酶aoph的最适反应温度(a)、最适反应ph(b)和金属离子(c)对酯酶aoph酶活影响的研究结果图。
34.图9为本发明水解酯酶aoph对四种不同底物的酶活测定。
具体实施方式：
35.实施例1喹禾灵水解酯酶基因的克隆
36.喹禾灵水解酯酶基因的克隆采用鸟枪法建库，策略图如图1，具体步骤如下：
37.1.1菌株s1基因组总dna的提取
38.菌株brevundimonas sp.s1(cctcc m 2021604,公开于cn202110685560.5)大量培养后，采用ctab法提取高纯度、大片段的基因组总dna，溶于te(ph 8.0)中，置于-20℃保藏，具体方法参考f
·
奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》。
39.1.2鸟枪法建库克隆目的基因
40.1.2.1 puc118(bamh i)购买于宝生物工程(大连)有限公司。
41.1.2.2总dna的酶切
42.s1总dna采用sau3a i进行部分酶切。
43.1.2.3 dna的回收
44.酶切后的总dna通过电泳(tae缓冲液)进行切胶回收，然后采用omega胶回收试剂盒进行纯化回收，回收的dna溶于te(ph 8.0)中，置于-20℃保藏。
45.1.2.4酶连
46.建立如下反应体系:
[0047][0048][0049]
16℃温育12小时。
[0050]
1.2.5制备e.coli dh5α高效感受态细胞
[0051]
具体方法参照f.奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》p 22-23。
[0052]
1.2.6转化
[0053]
取10μl酶连产物转化100μl感受态细胞，具体方法参照f.奥斯伯等编的《精编分子
生物学实验指南》p 23。涂布于含有100mg l-1
的喹禾灵(丙酮溶解成的2500mg l-1
的母液)，100mg l-1
氨苄青霉素的lb平板，培养24h后挑取菌落周围产生透明水解圈(喹禾灵水溶性差,故含有喹禾灵的lb固体培养基为浑浊不透明状,微生物降解喹禾灵后会在菌落周围形成透明圈)的菌落，即是含喹禾灵降解酶基因的阳性克隆。然后借助核苷酸序列测定获得降解喹禾灵的酯酶基因。
[0054]
1.2.7喹禾灵酯酶基因的核苷酸序列测定
[0055]
将阳性转化子送交通用生物(安徽)股份有限公司进行序列测定，然后根据数据库比对，获得喹禾灵水解酯酶基因(命名为aoph)，该喹禾灵酯酶基因的核苷酸序列为seq id no.1，根据该酯酶基因的核苷酸序列所推导的309个氨基酸序列为seq id no.2。
[0056]
1.3喹禾灵酯酶基因aoph的功能验证
[0057]
将疑似的喹禾灵酯酶基因定向克隆到表达载体puc18上，构建成puc-aoph，并转化至表达宿主e.coli dh5α中，获得重组菌株e.coli dh5α(puc-aoph)。然后利用该重组菌株进行全细胞转化实验，最终发现该重组菌株e.coli dh5α(puc-aoph)可以降解喹禾灵、精喹禾灵、禾草灵和精恶唑禾草灵(图2)，说明aoph基因负责喹禾灵、精喹禾灵、禾草灵和精恶唑禾草灵的降解。
[0058]
实施例2喹禾灵酯酶基因aoph的高效表达与纯化
[0059]
具体实验方案如图3所示。
[0060]
2.1酯酶基因aoph的pcr扩增
[0061]
引物序列：
[0062]
aoph-f：taagaaggagatatacatatgctggccgccggagcggtc(nde i)(seq id no.3)；
[0063]
aoph-r：gtggtggtggtggtgctcgagcgcacgcggcgcctcctt(xhoⅰ)(seq id no.4)。
[0064]
使用引物aoph-f和aoph-r扩增酯酶基因aoph，pcr扩增体系如下：
[0065]
扩增体系：
[0066][0067]
pcr扩增程序：
[0068][0069]
2.2 pcr产物及载体用nde i和xho i快切酶同时酶切。
[0070]
酶切体系：
[0071][0072]
酶切产物用纯化回收试剂盒纯化回收。
[0073]
2.3转化和表达
[0074]
将2.2中酶切好的dna片段和pet-29a( )进行酶连(参考1.2.4)。将酶连好的含有水解酯酶基因的pet-29a( )重组质粒转化到表达宿主菌e.coli bl21(de3)，涂布于含有50mg l-1
卡那霉素的平板，获得重组转化子e.coli bl21(de3)(pet-aoph)。
[0075]
2.4酯酶aoph的表达与纯化
[0076]
将重组菌株e.coli bl21(de3)(pet-aoph)在lb培养基中培养至od
600
＝0.5左右，向培养基中加入终浓度为0.5mm的iptg，30℃诱导18h后，离心收集菌体。用tris-hcl(ph 8.0)洗涤菌体，超声波破碎，离心取上清。由于构建的重组菌株e.coli bl21(de3)(pet-aoph)经过iptg诱导表达的aoph蛋白n端带有6个组氨酸残基组成的标签，重组蛋白可以通过ni
2 -nta resin(novagen)进行洗脱纯化。详细纯化步骤及所需溶液见试剂盒内附说明书。将纯化后收集到的所有不同梯度的酶液分别倒入透析袋中，并置于20mm tris-hcl缓冲液(ph 8.0)中4℃过夜透析，最后进行sds-page电泳检测目的蛋白纯度，最终获得aoph的纯酶(图4)。蛋白操作均在层析柜(4℃)中进行，蛋白浓度的测定采用bradford方法(bradford,1976)，牛血清白蛋白作为标准蛋白质。
[0077]
2.5 aoph对喹禾灵的降解
[0078]
以喹禾灵为底物建立纯酶的酶促反应体系(3ml)：
[0079]
喹禾灵
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
30mg l-1
[0080]
aoph
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1μm
[0081]
tris-hcl缓冲液(ph 8.0)
ꢀꢀ
20mm
[0082]
30℃水浴反应10min，加入等体积的二氯甲烷萃取并终止反应。去除上层水相，用无水硫酸钠进一步除水。将二氯甲烷相挥发除尽，然后用甲醇复溶。用滤膜(孔径0.22μm)过滤，最后采用普通高效液相色谱和手性高效液相色谱进行检测。
[0083]
普通液相色谱检测条件为:thermo scientific
tm acclaim
tm 120c18反相柱(4.6
×
250mm,5μm,)，流动相为甲醇:水:乙酸(80:20:0.5,v/v/v)，流速1ml min-1
，柱温40℃，进样量20μl，紫外检测波长为220nm和280nm。
[0084]
手性液相色谱检测条件为：仪器，shimadzu lc-20a(shimadzu corporation)；色谱柱，superchiral s-ad(chiralway biotech co.,ltd.)，0.46cm i.d.
×
15cm length，5μm，柱温40℃；进样量10μl，流动相，正己烷:异丙醇:三氟乙酸＝90:10:0.05(v/v/v)；旋光检测器，advanced laser polarimeter@670nm(pdr-separations llc)；流速:0.9ml min-1
；紫外检测波长,220nm。
[0085]
最后采用高效液相色谱串联质谱检测并鉴定代谢产物。ms分析使用esi模式，检测
器为agilent g6410b triple quad mass spectrometer。
[0086]
色谱检测结果表明，喹禾灵两种异构体的吸收峰(5.410min和5.907min)显著下降，同时出现了两个保留时间分别为8.967min和10.489min的产物峰。而质谱分析共检测到两个离子峰(图5)，分别为m/z 371.0795和m/z 343.0480，而且这两个特征峰均存在同位素特征吸收峰，结合这些特点可以确定m/z＝371.0797为喹禾灵原药，而m/z＝343.0484为喹禾灵断裂酯键后的产物。由此可以得知纯酶aoph降解喹禾灵的途径为水解喹禾灵分子中的酯键，生成喹禾灵酸和乙醇(图6)。
[0087]
2.6 aoph对喹禾灵的不同异构体的手性选择性
[0088]
以喹禾灵为底物建立纯酶的酶促反应体系，将反应体系置于30℃水浴中，3h取样一次，所取样品立即进行萃取，定时取样至18h。最后采用手性高效液相色谱对两种异构体进行拆分及定量，对映体分数(enantiomer fraction，ef)值的计算依据各异构体的峰面积,公式如下:
[0089]
ef＝(r)-喹禾灵/[(r)-喹禾灵 (s)-喹禾灵)]
[0090]
根据手性高效液相色谱仪的定量分析结果发现，酯酶aoph对喹禾灵的降解存在显著的手性选择性(图7a)。通过计算对映体分数发现，ef值由起初的0.5上升至0.937(图7b)，这表明酯酶aoph更倾向于降解(s)-构型的喹禾灵。
[0091]
2.7 aoph的酶学特性
[0092]
将aoph催化喹禾灵的反应设置在不同的温度下(4-45℃)进行，考察aoph的最适反应温度。将aoph先置于4-70℃水浴中保温30min，然后置于最适温度下进行酶促反应，以考察aoph的热稳定性。酶促反应时间为20min，反应结束后沸水中放置3min来终止反应，然后加入等体积的二氯甲烷进行萃取。去除上层水相，用无水硫酸钠进一步除水。将二氯甲烷相挥发除尽，然后甲醇复溶。用滤膜(孔径0.22μm)过滤，最后采用高效液相色谱进行检测，测定不同温度下aoph对喹禾灵的降解率，以最适温度下的降解效率为100％，计算相对酶活。实验结果表明，在4-45℃范围内aoph对喹禾灵都有一定的活性，且最适反应温度为30℃；当温度在25-40℃时，相对酶活在70以上；当温度低于16℃时，相对酶活低于25％；当温度为45℃时，相对酶活低于60％(图8a)。
[0093]
设置不同ph值范围的四种缓冲液：包括20mm柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(ph3.6-5.8)、20mm柠檬酸-na2hpo4缓冲液(ph 5.0-8.0)、20mm tris-hcl缓冲液(ph 7.5-8.6)、20mm甘氨酸-naoh缓冲液(ph 8.6-10.6)。30℃条件下，将aoph在上述不同ph值的缓冲液中进行酶促反应20min，然后沸水中放置3min来终止反应。加入等体积的二氯甲烷进行萃取。去除上层水相，用无水硫酸钠进一步除水。将二氯甲烷相挥发除尽，然后甲醇复溶。用滤膜(孔径0.22μm)过滤，最后采用高效液相色谱进行检测，测定不同ph条件下aoph对喹禾灵的降解率，以最适ph的降解率设为100％，计算相对酶活力。实验结果表明，aoph的最适反应ph是7；当ph在6.4-9.4之间，aoph的相对活力保持在80％以上；当ph《6时，aoph的相对酶活低于45％(图8b)。
[0094]
在最适反应温度和ph条件下，向酶促反应体系中加入终浓度分别为0.2mm和1.0mm的常见金属离子(ni
2
、cu
2
、fe
3
、al
3
、co
2
、zn
2
、ca
2
、mg
2
、mn
2
和cd
2
)，反应20min。然后沸水中放置3min来终止反应，加入等体积的二氯甲烷进行萃取。去除上层水相，用无水硫酸钠进一步除水。将二氯甲烷相挥发除尽，然后甲醇复溶。用滤膜(孔径0.22μm)过滤，最后采用
高效液相色谱进行检测，测定不同金属离子影响下aoph对喹禾灵的降解率，以不添加任何金属离子的反应体系下的酶活力定义为100％，计算各实验组的相对酶活。结果表明，0.2mm不同金属离子对aoph酶活几乎无影响。而浓度增大到1.0mm时，co
2
、cd
2
、ni
2
和zn
2
会轻微抑制aoph的酶活力，使其降低10-30％左右，其他金属离子的影响则几乎不变(图8c)。
[0095]
向30ml的20mm tris-hcl(ph 8.0)缓冲液中加入1％的琼脂糖,微波炉中加热溶解,待溶液稍冷后加入终浓度为100mg l-1
的喹禾灵，混匀后倒制平板。然后按照同样操作，制备包含其他底物如精喹禾灵、禾草灵和精恶唑禾草灵的平板。待平板冷却后用打孔器打孔,然后在孔中加入0.2ml的aoph,以加入等体积的20mm tris-hcl(ph 8.0)缓冲液作为阴性对照。结果表明，酯酶aoph在加有这四种底物的平板上均可以产生明显的水解圈，说明酯酶aoph对这四种底物均有显著酶活(图9)。